實驗六高效液相色譜法

實驗六高效液相色譜法第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日20.1.1高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)的產(chǎn)生。

薄殼型填料，柱效僅每米1000~3000塔板數(shù)5~10μm球型和無定型微粒硅膠，每米5~6萬理論塔板數(shù)高度均勻甚至單分散1~3μm硅膠基質(zhì)球形填料，達(dá)15~30萬理論塔板/m。新型分離模式和方法不斷增加第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日基本特點

1.高效、高速、高靈敏度、高選擇性

2.填料粒徑和流動相性質(zhì)影響色譜柱效

3．局限性操作條件

1.流動相對分離選擇性的影響

2.柱外效應(yīng)

3.操作壓力

適用范圍廣20.1.2.高效液相色譜法的特點及與其他色譜法比較第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日1.吸附色譜(adsorptionChromatography)2.分配色譜(partitionChromatography)3.離子交換色譜(ion-ExchangeChromatography)4.體積排阻色譜(sizeExclusionChromatography)

需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主要保留機理，但可能還存在次要的其他機理。

20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系

根據(jù)固定相和液體流動相相對極性的差別，有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。反相色譜和正相色譜主要區(qū)別是流動相和固定相的相對極性，最初形成于液液分配色譜，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于其他各種色譜方法。第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日

上述每種色譜類型均可進(jìn)一步分為多個不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用互相補充。

20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日

現(xiàn)代高效液相色譜使用3~10μm柱填料，為達(dá)到適用的流動相流速，高壓泵需提供幾十MPa或數(shù)百大氣壓力的柱前壓。因而HPLC儀器比其他類型的色譜儀要復(fù)雜和昂貴。20.2.高效液相色譜儀HPLC示意圖第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日20.2.高效液相色譜儀第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日

現(xiàn)代高效液相色譜儀配備一或多個流動相儲液器，一般為玻璃瓶，亦可為耐腐蝕的不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成的容器。每個儲瓶容積500~2000mL。儲液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動時易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過放空閥排出。儲器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲液器的溶劑導(dǎo)管入口處裝有過濾器，以進(jìn)一步除去溶劑中灰塵或微粒殘渣，防止損壞泵、進(jìn)樣閥或堵塞色譜柱。20.2.1.流動相貯器和溶劑處理系統(tǒng)第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日

通用HPLC儀輸液泵系統(tǒng)的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液壓；輸出無脈動恒定的液流；流速范圍0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系統(tǒng)組件耐腐蝕(密封性良好的不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產(chǎn)生的液體高壓沒有爆炸危險，因為液體的壓縮性極小。最重要的是系統(tǒng)密封性能好。目前常使用的有三種類型的輸液泵，即往復(fù)柱塞泵、氣動放大泵、螺旋注射泵，它們各有優(yōu)、缺點。往復(fù)柱塞泵20.2.2.高壓泵系統(tǒng)1.電機，2.往復(fù)凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液單向閥，5.溶劑入口，6.脈動阻尼器,7.接色譜柱。第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

進(jìn)樣閥20.2.3.進(jìn)樣系統(tǒng)六口旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥示意圖第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離的性能不受影響。20.2.4.高效液相色譜柱第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日1.色譜柱類型

按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類型。20.2.4.高效液相色譜柱2.保護柱

一般在分析柱前裝上較短的保護柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護較昂貴的分析柱，延長使用壽命。3.柱恒溫器

對色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。20.2.5.液相色譜檢測器第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日

l.光吸收檢測器：紫外吸收檢測器，光二極管陣列檢測器，紅外吸收檢測器2.熒光檢測器

3.示差折光率檢測器4.蒸發(fā)光散射檢測器5.電化學(xué)檢測器

20.2.5.液相色譜檢測器第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日20.3.1.高效液相色譜固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

20.3.高效液相色譜固定相和流動相第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：1.化學(xué)惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。2.適用的物理性質(zhì)，包括沸點較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無紫外吸收等，以降低UV檢測器本低響應(yīng)，提高檢測靈敏度;對樣品具有適當(dāng)溶解能力等。3.溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價廉等，便于操作和安全。20.3.2.液相色譜流動相第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日20.3.2.液相色譜流動相第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日

研究最多、應(yīng)用最廣泛的高效液相色譜類型?？煞譃橐?液色譜和化學(xué)鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學(xué)鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面?；瘜W(xué)鍵合相色譜巳成為占絕對優(yōu)勢的分配色譜類型。20.5.分配色譜(PartitionChromatography)第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日液一液分配色譜法（LLPC）在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體，能適用于各種樣品類型的分離和分析（極性的和非極性的、水溶性和油溶性的、離子型的和非離子型的化合物）。（1）分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日（2）固定相由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β,β一氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈?。為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。代替了固定液的機械涂漬，它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。約有3/4以上的分離分析是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。第二十頁，共二十二頁，2022年，8月28日（3）流動相在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相與固定相盡可能不互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。第二十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日

體積排阻或排除色譜(Size-ExclusionChromatography,SEC),亦稱為凝膠色譜或凝膠過濾色譜,是分析高分子化合物的色譜技術(shù)。SEC