實用方法的建立

實用方法的建立第一頁，共七十五頁，2022年，8月28日目錄1前言2HPLC方法建立的步驟2.1了解樣品的有關(guān)情況2.2明確分析目的2.3樣品的預(yù)處理與檢測2.4HPLC分析模式的選擇2.5色譜條件2.6方法的優(yōu)化，及色譜現(xiàn)象的解析和處理2.7定性和定量方法的建立及論證第二頁，共七十五頁，2022年，8月28日3色譜條件的選擇3.1流動相的選擇3.2檢測器的選擇3.3樣品的溶解及預(yù)處理3.4樣品的進樣量3.5色譜柱的選擇及保護與再生3.6泵的選擇3.7色譜工作站4分析方法建立的實例4.1等度分析4.2梯度方法的建立4.3色譜柱及pH的影響第三頁，共七十五頁，2022年，8月28日5色譜分析中各種圖譜現(xiàn)象的判斷和處理5.1基線噪音的產(chǎn)生和處理5.2基線漂移(上漂和下漂)5.3倒峰的產(chǎn)生和消除5.4鬼峰的產(chǎn)生和消除5.5峰前移和退后的判斷5.6前沿峰和拖尾峰的判斷5.7色譜雙峰的判斷5.8色譜峰變胖的判斷和處理第四頁，共七十五頁，2022年，8月28日1前言HPLC作為色譜的一個重要分支，在色譜分析中占有重要的地位，將逐步取代氣相色譜成為最重要的色譜分析手段。隨著HPLC技術(shù)的發(fā)展和科技的進步，使得HPLC廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域。HPLC實驗技術(shù)是一個實驗性很強的操作技能，現(xiàn)行的各類書籍并不能包羅一切知識，實踐經(jīng)驗非常重要；HPLC技能是一個綜合性的技能，需日積月累，厚積薄發(fā)，非一日之功。

第五頁，共七十五頁，2022年，8月28日2HPLC方法建立的步驟第六頁，共七十五頁，2022年，8月28日第七頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.1了解樣品的有關(guān)情況首先應(yīng)對樣品有足夠的了解，并明確分析目的（同一樣品，不同的測試要求，其方法也可能不一致）。樣品的重要性質(zhì)包括：所含化合物的數(shù)目；化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團）；分子量；UV光譜圖；被測組分在樣品中的濃度范圍；樣品的溶解度、沸點及其穩(wěn)定性；可能存在的干擾物質(zhì)及樣品的復(fù)雜程度等。第八頁，共七十五頁，2022年，8月28日1分析大分子、小分子還是生物分子一般常規(guī)的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝膠色譜(包括凝膠過濾、離子交換、親和層析、疏水層析）、生物大分子采用不能變性的色譜體系。2樣品是混合物、天然物質(zhì)還是基本是單一物質(zhì)。如果是天然物質(zhì)，一般分離完全采用梯度體系?；旌衔镏惺欠裼薪Y(jié)構(gòu)類似的異構(gòu)體，組分復(fù)雜的還是采用梯度，是否是系列反應(yīng)的產(chǎn)物。3測定是主成分、還是少量成分或痕量成分。主含量的測定一般比較容易；但少量要考慮分離完全的問題；痕量成分則要考慮檢測器的類型，采用何種提取方法和檢測的靈敏度等。第九頁，共七十五頁，2022年，8月28日4分離化合物是極性，弱極性、非極性還是離子化合物、兩性化合物。非極性化合物以正相體系較多，如果溶于反相體系的溶劑，可采用反相體系。弱極性、極性化合物采用反相較為方便，可在流動相中添加改性劑，調(diào)節(jié)合適的pH。離子化合物可以采用離子交換，也可添加離子對試劑；或者采用反相調(diào)節(jié)pH。兩性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的則考慮離子交換；也可考慮衍生后測定。對于極性的糖類物質(zhì)，可用NH2柱，有條件的用聚合物的糖柱。多糖類的則要采用凝膠系統(tǒng)。大分子的極性化合物、離子化合物，往往采用特定的色譜柱，多為聚合物柱子。手性化合物，則要用手性流動相或者采用手性柱。第十頁，共七十五頁，2022年，8月28日5樣品的溶解度、沸點樣品在不同溶劑中的溶解度，對色譜條件的選擇非常重要，測定其溶解的性能，則可以判斷其化合物可能的類型。非極性樣品不溶于水，但溶于有機溶劑。如果只能溶于非極性溶劑，一般建議做正相。溶于極性溶劑，以反相為上策。極性化合物在水和極性溶劑中一般都有一定的溶解度。極性和離子化合物一般都溶于水，但在不同pH下區(qū)別可能很大。從溶解度可以判斷出采用何種體系為佳。易揮發(fā)性的低沸點的物質(zhì)在ELSD中難以檢測。第十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日6樣品的穩(wěn)定性如果樣品存在水解、光解、醇解、氧化、分解則測定時需注意。對光敏感物質(zhì)，用棕色瓶避光保存，不宜存放過久，隨配隨做。易水解的物質(zhì)，、要選擇合適的溶解溶劑。有些樣品可能存在醇解，流動相不能用甲醇，而要用乙腈。易氧化的物質(zhì)，溶解時可考慮加抗氧劑，調(diào)節(jié)pH，如PAP（對氨基苯丙酮）的測定。胺類化合物。產(chǎn)品不穩(wěn)定的化合物，分析越快越好。第十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日7化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團）常見的基本結(jié)構(gòu)是苯環(huán)、雜環(huán)、多環(huán)芳烴?；鶊F有COOH、OH、NH2、SO3H、Cl（Br）、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。親水性的基團在反相中出峰時間前移，疏水性的基團出峰后移。從存在的結(jié)構(gòu)可以判斷出其在溶劑中的溶解度。8化合物的pK值知道pK值，有助于方法的建立，尤其流動相pH的選擇。pK的差異是官能團造成的。第十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日9UV光譜圖知道其吸收波長的曲線有助于檢測，如果有DAD則關(guān)系不大。多組分的樣品，宜多選幾個波長。同一樣品在不同的流動相及pH最大波長可能不一致。有雙鍵共軛的結(jié)構(gòu)紫外吸收較大，單鍵的則在低紫外區(qū)有一定的吸收10樣品的復(fù)雜層度梯度方法分析預(yù)處理,分成幾個部分分析痕量物質(zhì)的富集總之，充分了解了被分離樣品的性質(zhì)，將可能提供一個參考的分析條件，縮短分析時間和分析難度。第十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.2明確分析目的1定量分析？檢出某種物質(zhì)？未知物的確定？純化制備？光譜鑒定？2是否將所有組分分開，定性？一種條件有困難？分組分析？3定量分析的準確度和精密度？（主成分在1～2％）4不同樣品基質(zhì)對分離的影響（如原料藥、粗品、精品、殘留、環(huán)境樣品等）5分析的工作量，少數(shù)還是大量？時間和效率與分離的選擇。6實驗室的條件，如HPLC儀器的配置和檔次；色譜柱系統(tǒng)；是否有恒溫；是否可以做梯度；分析成本；實驗室人員的操作技能；方法的移植等等。第十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.3樣品的預(yù)處理與檢測樣品來源的形式1可直接進樣的溶液（注意是否與流動相匹配）2需稀釋、pH緩沖、加內(nèi)標或其它操作3固體樣品－選擇合適的溶劑4需提取分離的樣品5預(yù)處理，除去干擾物尤其對儀器和柱子有損害的物質(zhì)?？傊?，將樣品溶于合適的溶液；或者用合適的溶液提取出來、或者分離處理對測定有干擾的物質(zhì)，在處理中應(yīng)注意被測組分的穩(wěn)定性和提取率。第十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.4HPLC分析模式按照樣品的特性分為以下二類：A一般樣品

可采用基本標準的方法。（中性的、離子的）－反相、離子對、正相、離子交換。B特殊樣品

無機離子、異構(gòu)體、對映體、生物樣品、肽類、核苷酸、大分子、蛋白質(zhì)、核酸、糖類，合成聚合物。第十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.5色譜條件色譜條件主要包括以下幾個方面：流動相的組成及流速、溫度等。色譜柱的類型樣品處理方法檢測器的確定和參數(shù)數(shù)據(jù)處理方法的穩(wěn)定性及其它第十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.6方法的優(yōu)化，及色譜現(xiàn)象的解析和處理優(yōu)化包括合理縮短分析時間、提高靈敏度、分離度，成本優(yōu)化，方法的穩(wěn)定性，對出現(xiàn)的各種色譜現(xiàn)象，包括儀器和樣品的穩(wěn)定性等提出切實可行的辦法。建立合理的數(shù)據(jù)處理方法等。第十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.7定性和定量方法的建立及論證對方法的檢測限、靈敏度、定量重復(fù)性、偏差、回收率、樣品的穩(wěn)定性、方法的穩(wěn)定性、線性關(guān)系等求證。建立可靠的穩(wěn)定的分析方法。第二十頁，共七十五頁，2022年，8月28日3色譜條件的選擇3.1流動相的選擇3.1.1流動相的試劑類型以常見的HPLC為例，正相、反向、離子對。正相的試劑有正己烷、環(huán)已烷、正庚烷、戊烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六圜，也可加一些極性試劑如乙酸、乙醇、異丙醇、四氫呋喃等注意：這些有機試劑的純度非常重要，一是含水的問題，（水的含量將影響保留時間，重復(fù)性差）二是其中芳香環(huán)雜質(zhì)對紫外檢測的干擾，國產(chǎn)分析純的試劑一般質(zhì)量很差，不能直接用于低波長的紫外檢測，需重新處理（用硅膠柱過濾其雜質(zhì)）。最好采用色譜純的試劑，但成本很高。第二十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日離子對試劑對強堿性和酸性的離子化合物，除了采用離子交換色譜外，也可在流動相中添加離子對試劑，用C18柱進行分離。離子對試劑可分為二大類酸性和堿性分離多羧基、磺酸基的化合物一般添加長鏈的胺鹽，如四丁基氫氧化胺、四丁基溴化胺、四丁基氯化胺等。還可以添加Na2SO4等無機鹽，調(diào)節(jié)合適的pH。分離堿性的胺類化合物，一般添加八烷基磺酸鈉，十二烷基磺酸鈉等。第二十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日反相色譜試劑有機試劑最主要的是甲醇、乙腈、其他的有四氫呋喃、異丙醇，乙醇、二氧六圜很少見到。甲醇優(yōu)質(zhì)的分析醇基本可以滿足分析，乙腈必須是色譜純（示差、蒸發(fā)光散射？可以用分析純），四氫呋喃應(yīng)用新的，建議為色譜純，也可以自己蒸餾處理。分析純的THF少量的添加在高波長勉強可以。水理論上要求超純水，但在實際中，我們認為HPLC－MS（飛行時間質(zhì)譜）和HPLC－ELSD必須用超純水。其它的用純水和蒸餾水及類似水質(zhì)也可以，用優(yōu)質(zhì)的桶裝蒸餾水、純水是能滿足分析要求的。去離子水勉強可以，不能在低波長下使用。第二十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日酸，可添加一定量的無機酸和有機酸。無機酸有H3PO4、H2SO4、HClO4，HCl中Cl對不不銹鋼管路有腐蝕作用，HNO3有氧化性很少見到。一般濃度在0.1%，pH在2－3之間。有機酸有甲酸、乙酸、三氟醋酸、檸檬酸等。弱酸濃度在0.5－10％。三氟乙酸是強酸用量同無機酸。加酸的作用一是在低pH下，抑制被弱酸性物質(zhì)的電離；延長保留時間抑制拖尾。二是調(diào)節(jié)流動相的pH，起到緩沖作用。注意：流動相的pH一般不能低于2，否則將縮短色譜柱的壽命。第二十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日無機鹽和有機鹽種類很多，常用的是鉀鹽和鈉鹽。磷酸鹽、硫酸鹽醋酸鹽。Na2HPO4,NaH2PO4,K2HPO4,KH2PO4,Na2SO4,NaAC,檸檬酸鈉，EDTA鈉。胺類試劑三乙胺、二乙胺、NH4OH等，類似離子對的作用，在C18中，并能抑制峰的拖尾。其次調(diào)節(jié)流動相的pH。流動相的選擇原則是，非極性的一般有機溶劑和水能解決。極性樣品，要添加改性劑，并控制pH值。離子樣品，C18柱用離子對試劑，也可控制pH值來處理，或者用離子交換樹脂。第二十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.1.2流動相的平衡甲醇水系統(tǒng)一般比較容易，30分鐘內(nèi)完全可以，短柱時間比較快。如果流動相添加離子對試劑，在實際操作中，建議先用一定比例的水平衡，15分鐘以上，再換成加離子對試劑的流動相，開始有機相比例可以低些，初步平衡后，調(diào)到合適的濃度。如果加酸，相對平衡時間比較快，直接上一般問題不大。如果是改性劑，pH緩沖液，平衡時間取決于緩沖液的濃度和pH值，先用水平衡一段時間，再換上緩沖液，濃度低的和pH近中性的時間就比較長，濃度大的時間相對短些。鹽的濃度一般在0.01~0.05M之間，過高的鹽濃度，在有機相高、溫度低時易析出，杜塞柱子。分析完后，先用含水流動相洗去無機鹽，再用有機溶劑。第二十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.2檢測器的選擇目前常見HPLC的檢測器有UV、DAD、ELSD、RI、MS。使用最多的是UV，主要因為大部分的物質(zhì)在紫外可見區(qū)200－700，有較強的吸收，一般合成的化合物（含苯環(huán)最多）大多數(shù)有紫外吸收。紫外檢測器有單波長和多波長之分，最低可到190nm，高可達900nm，多波長檢測器可同時選定幾個波長測定注意不同物質(zhì)其紫外吸收曲線不一，靈敏度差異極大，同一物質(zhì)不同的流動相吸收曲線也不一致。第二十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日紫外檢測器是使用最多的一種，關(guān)鍵是波長的選擇。其一般的規(guī)律如下：典型的含苯結(jié)構(gòu)的化合物在254nm，具有共軛結(jié)構(gòu)。一般有幾個環(huán)，就有幾個吸收峰。如果存在對稱結(jié)構(gòu)，最大波長往往在230nm以下。嘧啶環(huán)，雜環(huán)類似苯環(huán)結(jié)構(gòu)。含COOH、C=S、C=C都有紅移現(xiàn)象，如果共軛則更明顯。，一般選擇210－230nm。染料其最大波長在可見光區(qū)，低紫外吸收反而小，一般從顏色可以判斷出。第二十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日DAD－二極管陣列檢測器（512，1024）其特點是能進行光譜掃描，能得到三維的色譜圖。其作用除了紫外的功能外（靈敏度低于紫外），并能得到分離物質(zhì)的紫外光譜圖，對被分離物質(zhì)光譜圖的比較鑒別峰的純度，有一定的選擇性。其最大的優(yōu)點是，在分析時，可避免因波長選擇的關(guān)系，漏掉了一些色譜峰，得到未知物的最大吸收波長。但檢測器的價格比UV高。第二十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日示差檢測器質(zhì)量型檢測器，主要用于非紫外吸收的物質(zhì)的檢測，如糖、酯類等。靈敏度比紫外低一個數(shù)量級，對所有物質(zhì)響應(yīng)。對溫度敏感，儀器平衡時間長，不能梯度分析。第三十頁，共七十五頁，2022年，8月28日ELSD檢測器是90年代后期才普及的一種質(zhì)量型檢測器，主要是替代RI檢測器，其優(yōu)點是對所有不揮發(fā)性的物質(zhì)有相應(yīng)，同其質(zhì)量有關(guān)，往往呈非線性關(guān)系?？蛇M行梯度分析，對不揮發(fā)的、紫外吸收很小的物質(zhì)效果尤其好。但其缺點是，揮發(fā)性的物質(zhì)損失而檢測不到、極易氧化的物質(zhì)變質(zhì)。流動相要求高，不能含有不揮發(fā)的鹽類，因此流動相有較大的限制。ELSD目前主要有Alltech2000（500），PL1000，DDL31和SEDEX55，65，75等，有分流和不分流二大類。第三十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日質(zhì)譜檢測器HPLC中的質(zhì)譜檢測器同GC中不同，主要有APCI和ESI二種，每種有正離子和負離子二種模式。正離子一般以加Na、加鉀或加氫方式出現(xiàn)。其它類型的檢測器第三十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.3樣品的溶解及預(yù)處理樣品的類型前面已經(jīng)提到，并作了分類。對于復(fù)雜的樣品，根據(jù)分析的要求和對象，必須有合理的提取方法，溶劑萃取、索氏提取、過層析柱、超聲萃取、皂化、衍生等，這里不一一談了。對于直接可以溶解進樣的樣品，這里需要注意以下幾點：被測樣品的成分必須全部溶解，除非特意處理。樣品溶解的原則是相似相溶，首選流動相，如直接不行，或溶解度低，可先用其他溶劑溶解，再用流動相稀釋。在特殊的情況下，可用流動相相互溶的溶劑溶解樣品，并進樣，但注意二者極性的差異。否則將得到錯誤的分析結(jié)果。易氧化分解的物質(zhì),配后立即分析。第三十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.4樣品的進樣量如果是含量的定量分析，有自動進樣器最好，手動進樣的操作要求高，生手往往做的精度差。如果樣品溶劑與流動相不一致，極性大時，進樣體積不要太大，極易出雙峰和前沿峰。面積歸一化法，建議進樣量不要太大，尤其在低波長分析時，防止溶劑進樣峰的的干擾，尤其樣品溶劑與流動相相差很大時，進樣體積必須很小。第三十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.5色譜柱的選擇及保護與再生3.51色譜柱的選擇首選C18，或C8，以15cm為佳，可解決80％的樣品分析，柱效應(yīng)大于50000。如有條件采用進口色譜柱。特殊樣品用特定的柱子。不同柱子其保留性差異很大，相同條件，不同柱子比例會不一樣。堿性化合物用BDS柱，糖用NH2柱。不同色譜柱，其合適的pH范圍不一，一般在2.5-7.5之間，有的色譜柱比較耐堿，kromasil可以到10，而雜化xterra在1－12,XDB在pH3-11。一體化的柱子也比較耐堿?，F(xiàn)在新型色譜柱不斷出現(xiàn)，雖是C18類型，但差異會很大。第三十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.52色譜柱的保護、平衡和保存純樣品分析不加保護柱也許可以，復(fù)雜和天然樣品必須加上保護柱（有各種類型），延長分析柱的壽命。色譜柱的平衡在流動相中已經(jīng)提到了，注意流動相的pH值，過低和過高將損傷柱子。當有機相比例很高時，鹽濃度不能太高，否則溫度低的話，鹽析出將引起柱子和管路的杜塞，壓力大增。含鹽的流動相在分析完后，應(yīng)用水洗去鹽，再換成有機溶劑。色譜柱的保存，參照說明書，反相柱一般在甲醇或乙腈中。第三十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.53色譜柱的清洗用比你使用的流動相更強的溶劑沖洗對于分析柱每種溶劑至少用25ml沖洗用沒有緩沖鹽的流動相100%Methanol甲醇100%Acetonitrile乙腈100%Isopropanol異丙醇75乙腈：25％異丙醇100%MethyleneChloride★二氯甲烷100%Hexane★

已烷當用已烷或二氯甲烷柱子時,必須先用異丙醇沖洗,然后再用你的反相流動相第三十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.54色譜柱的維修-物理阻塞在安裝之前前后測試壓力差如果柱壓太高,反裝色譜柱,并用10-20倍體積的流動相沖洗色譜柱,監(jiān)測壓力變化.若出現(xiàn)沉淀,(如:蛋白凝聚、細胞物、聚合物)設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如0.1%TFA／80％乙腈，6M鹽酸胍、THF等）若還無效，更換過濾片第三十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.55色譜柱修復(fù)和再生--化學(xué)變化-I

由于鍵合相的水解或硅膠的溶解而造成的色譜柱填料的變化是不可逆的。由于污染而產(chǎn)生的色譜柱變化可以通過適當?shù)那逑词怪迯?fù)。梯度洗脫的方式(水->強有機溶劑)通常最有效。低pH流動相,如0.1%TFAor0.01MH3PO4,也是有效的。（也有使用0.01MH2SO4的）升高溫度（60-80℃）第三十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日

色譜柱的修復(fù)和再生--化學(xué)變化–IIExample:4.6mmIDx15cmZorbax300SB-C18Flowrate:1mL/min;Temp:~80℃A:0.1%TFAinwaterB:0.1%TFAinacetonitrile100%Afor30min.;0-100%Bover30min.;Hold100%Bfor30min.,Returnto100%Ain5min.Repeat3times。6M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白質(zhì)的沉積。有機聚合物等填料可使用高pH水溶液/有機溶液，如：0.01MNaOH50%異丙醇/水溶液，硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時間(15-30min)。第四十頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.56色譜柱使用的幾個注意點樣品和流動相過濾柱子反做(當正做實在不行時)當柱壓明顯升高時，對柱頭塞板清洗及更換部分填料。少使用離子對試劑色譜柱避免強酸強堿接觸，選擇合適保存條件。分析時，避免長時間色譜柱進大量氣泡，長時間不用，檢查是否有流動相，防止柱子干掉。第四十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.6泵的選擇泵可分為單泵、雙泵和四元泵。方法建立建議用雙泵或四元泵。泵也可分為高壓混合和低壓混合。四元泵是低壓混合。高壓混合不易出氣泡，低壓混合應(yīng)嚴格脫氣，最好用在線脫氣機。為避免氣泡產(chǎn)生，可在柱后接反壓柱。分析完后，避免鹽類在管路中過夜。泵的運行壓力建議不超過極限值的50－60％。第四十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日4分析方法建立的實例4.1等度分析色譜柱：C18，4mm×30mm流動相：乙腈/水，不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱流速：2ml/min樣品：①對羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)第四十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日改變?nèi)萘恳蜃?/p>

K'第四十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日改變選擇性∶a通過改變流動相改變選擇性同樣強度的不同溶劑改變色譜柱第四十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日4.2梯度方法的建立梯度洗脫的特點優(yōu)點單位時間的分離能力增加檢測靈敏度提高缺點儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式柱需再生（平衡）定量分析的重復(fù)性相對較低分析時間長第四十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度第四十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度洗脫的可變參數(shù)A及B(可能還有C和D液)的成分和化學(xué)特性梯度的陡度梯度的變化形狀第四十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日如不用梯度：分離不理想第四十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度條件的優(yōu)化第五十頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度曲線的變化∶凹線第五十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度曲線的變化∶凸線第五十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度平衡時間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時間色譜圖不重復(fù)第五十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度平衡時間的影響（二）平衡時間∶6分鐘平衡時間∶7分鐘平衡時間∶8分鐘平衡時間∶9分鐘平衡時間從6到7分鐘，第一個峰的保留時間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個時間時，平衡充足。第五十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日有機污染物的影響（一）50ml超純水的有機物污染狀態(tài)第五十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日有機污染物的影響（二）“三蒸水”有大量的有機污染物不適合梯度分析第五十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日有機污染物的影響（三）典型的“實驗室水”有大量的有機污染物不適合高靈敏度梯度分析第五十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第一步開發(fā)一個有9個烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100%水-乙腈)，分離不理想。整個色譜峰組保留時間太長，分離度也不好第五十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第二步為使色譜峰前移，提高起始時乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個化合物出了10個色譜峰，說明有雜質(zhì)存在，很可能是流動相水中的。第五十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第三步

從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測靈敏度下，共有兩個雜質(zhì)峰。說明流動相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會對檢測有影響。第六十頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第四步

空白梯度圖同樣品的色譜圖進行對照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個峰）中的第一個小峰對第8個色譜峰有干擾，會使其定量分析結(jié)果不準確。第六十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第五步根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前(曲線5，50-100%B)，但是小峰仍沒有分出來。第六十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第六步

根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前，改用50-95%B見到好的現(xiàn)象。第六十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日梯度方法開發(fā)實例-第七步最后用50-90%B，曲線4，得到好的結(jié)果。第六十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日HPLC條件-試驗1流動相：乙腈：20mM磷酸鉀緩沖液pH2.5(65:35)流速: 1.0mL/min柱溫:

30°C紫外檢測器: 254nm進樣量: 10μL樣品(mg/mL):

尿嘧啶(0.025),3-丁基吡啶(0.067),苯酚(0.90),4-苯基丁酸(2.1),N,N-二乙基間甲苯酰胺(0.66),1,4二羥基蒽醌(0.20),丙基苯(5.0),丁基苯(6.7)用流動相溶解

4.3不同PH對實驗的影響第六十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日HPLC條件-試驗2流動相:乙腈:20mM磷酸鹽緩沖液,pH7.0(65:35)流速: 1.0mL/min柱溫:

30°C紫外檢測器:254nm進樣體積: 10μL樣品(mg/mL):

尿嘧啶(0.05),3-丁基吡啶(0.02),苯酚(1.0),4-苯基丁胺(4.0),N,N-二乙基間甲苯酰胺(1.0),

1,4-二羥基蒽醌(0.20),丙基苯(4.0),丁基苯(4.0)用流動相溶解第六十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日Column: Alltima?C18,5m,150x4.6mm1.

尿嘧啶2.3-丁基吡啶3.

苯酚4.4-苯基丁酸5.N,N-二乙基間甲苯酰胺(DEET)6.

1,4二羥基蒽醌7.

丙基苯8.

丁基苯Column: Adsorbosphere?C18,5m,150x4.6mm

pH2.5

的色譜圖第六十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日pH7

的色譜圖Column: Alltima?C18,5m,150x4.6mmColumn: Adsorbosphere?C18,5m,150x4.6mm1.

尿嘧啶2.

苯酚3.4-苯基丁胺4.N,N-二乙基間甲苯酰胺5.3-丁基吡啶6.

1,4二羥基蒽醌7.

丙基苯8.

丁基苯第六十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日5色譜分析中各種圖譜現(xiàn)象的判斷

5.1基線噪音的產(chǎn)生和處理可能產(chǎn)生的原因及處理辦法1流動池臟，用極性試劑清洗。當有填料進入，拆開流通池。2檢測器燈有問題，如能量偏低，更換氘燈。3周期性的波動，則起源于泵的脈沖，檢修泵或更換墊片等。4溫度對檢測器的影響，控制溫度。5氣泡經(jīng)過檢測器，用大流量沖洗。6流動相本底高，如水的純度不夠，換超純水?；蛟噭┘兌炔粔颍瑩Q色譜純的試劑。7注意數(shù)據(jù)采樣和連接問題。Time(min.)第六十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日5.2基線漂移（上漂和下漂）1柱中的流動相沒有平衡，延長平衡時間，尤其在流動相中添加了有紫外吸收的添加劑。2在梯度洗脫中，基線上漂是正常的，在空白梯度中有可能是柱子中有雜質(zhì)洗出。其次是流動相中有干擾物。換流動相。3溫度不穩(wěn)定（示差檢測器），控溫。4在等度分析中，樣品緩慢洗出，改變淋洗液強度或用梯度分析。5樣品進入檢測器，吸附在池中，可能每進樣一次，本底一次比一次高，很少見。第七十頁，共七十五頁，2022年，8月28日5.3倒峰的產(chǎn)生和消除1