實驗高效液相色譜法

實驗高效液相色譜法第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.掌握高效液相色譜法測定飲料中糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的原理和方法

2.熟悉高效液相色譜儀的使用方法

3.了解高效液相色譜儀的儀器結構[目的與要求]第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日[方法原理]

在適宜的條件下,高效液相色譜可同時分離飲料中的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸。樣品超聲除去二氧化碳和乙醇,調pH至近中性,過濾后進高效液相色譜儀,經反相C18液相色譜分離后,紫外檢測器230nm波長處檢測。

以色譜峰的保留時間定性,利用色譜峰面積在一定范圍內與濃度呈線性關系進行定量第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.儀器:

高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測器;

超聲波清洗儀;50ml容量瓶;50ml燒杯;50μl微量進樣器[儀器與試劑]第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日

糖精鈉標準儲備溶液(10.0mg/ml):

準確稱取于120℃烘干4h后的糖精鈉(C6H4CONNaSO2·2H2O)0.5000g,加水溶解后定容至50ml

苯甲酸標準儲備溶液(5.0mg/ml):

準確稱取0.2500g,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解,

定容至50ml

山梨酸標準儲備溶液(5.0mg/ml):

準確稱取0.2500g山梨酸,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解,定容至50ml

標準混合使用液

(含糖精鈉1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):準確吸取各標準儲備溶液5.0ml,加水定容至50ml2.試劑:

稀氨水(1+1);碳酸氫鈉溶液:20g/L;甲醇(色譜純)第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日2.配制標準系列:

取9只50ml容量瓶分別編上號碼,按下表配制標準系列。

編號012345標混液(ml)0.001.252.551020蒸餾水(ml)50.048.7547.5454030第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日標混號苯甲酸(mg/mL)A苯甲酸山梨酸(mg/mL)A山梨酸糖精鈉(mg/mL)A糖精鈉000000010.01254380870.01257343030.02554975620.0258530790.02514735790.05112703330.0516729440.0529072820.1224629940.133921910.159096180.2459902550.267411970.2117674600.49167288

混合標樣中各物質的濃度第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日樣品苯甲酸山梨酸糖精鈉標準曲線方程Y=3×107X-55.2Y=6×107X-37513Y=2×107X-53409r111線性范圍(mg/mL)0～0.20～0.20～0.4第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.樣品處理:吸取10.00～20.00ml汽水,放入50ml燒杯中,超聲除去二氧化碳,用稀氨水調pH7.0,加水定容至50ml,用濾膜(0.45μm)過濾,備用。[操作步驟]第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.插好電極,打開電源開關,按模式鍵切換到pH測量狀態(tài)2.用兩點法進行校正(b=2)(pH4.01,6.86,9.18)3.按模式進入b=24.將電極浸入標準緩沖液中(pH=6.86),按“校正”,當到達終點時顯示屏上顯示相應校正結果;將電極放入第二種標準緩沖液(pH=4.01或9.18),按“校正”,當到達終點時顯示屏上顯示相應校正結果;按“讀數”,保存校正結果并退回到正常的測量狀態(tài)5.將電極插入到被測液中,調節(jié)pH到所需值pH計的使用第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日(1)過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。前處理濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水溶劑尼龍66濾膜：適用于絕大多數有機溶劑和水溶液，可以用于強酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日3.測定色譜條件:

色譜柱:C18,4.6mm×150mm;流動相:

甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(5+95);流速:1ml/min檢測波長:230nm

取樣品處理液和標準系列溶液各10μl注入高效液相色譜儀進行分離,以其標準溶液峰的保留時間為依據進行定性。以標準溶液的濃度為橫坐標,相應的峰面積為縱坐標,分別繪制標準曲線(或計算回歸方程),從標準曲線上查出(或根據回歸方程求出)樣液中被測物質的含量,按下式計算:第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日式中:Cx為樣品中被測物的含量,g/kgC為在標準曲線上查得的相對應的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/mlV0為樣品定容體積,mlV為取樣體積,ml第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日[思考題]1.為什么被測溶液需要除去二氧化碳?2.采用230nm為測定波長,對樣品中山梨酸的測定有何影響？第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日[注意事項]1.流動相使用前必須經過脫氣。如果流動相中含有氣體,在較高的柱壓下會產生氣泡,使流動相流動受阻,對分離樣品產生不利影響2.應通過預實驗調整和最后確定流動相實際配比,以使各分析組分的分離效果最佳3.被測溶液pH值對測定和色譜柱使用壽命均有影響,以中性為宜4.苯甲酸、糖精鈉的靈敏波長為230nm,山梨酸靈敏波長為254nm,在此波長測定時苯甲酸和糖精鈉的靈敏度較低,因此采用230nm為測定波長第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日(2)脫氣：

除去流動相中溶解或因混合而產生的氣泡

氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產生基線波動A.示差折射率檢測器*使折射率變化B.UV檢測器（200nm以下）*溶解氧氣有吸收C.熒光檢測器*溶解氧氣有消光作用第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.吸氣器法（流動相抽濾）

*可以抑制制做流動相時產生的氣泡

*只是暫時的脫氣法

*不能解決因溶解氣體造成的問題2.超聲脫氣法3.使用氟樹脂膜的減壓脫氣法溶劑前處理-脫氣第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日★使用超聲波震蕩器，一般超聲震蕩15分鐘左右★注意流動相在超聲震蕩脫氣過程中，溫度會升高，應待其降至室溫后再上機使用?！镉捎谝后w對氣體的溶解作用，時間長后氣體會再溶入流動相中，應引起注意。溶劑前處理-脫氣第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日溶劑前處理-脫氣使用氟樹脂膜的減壓脫氣法氟樹脂膜真空室真空泵流動相往送液泵第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日緩沖液的使用使用前必須過濾使用后一定要進行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:

用含5%甲醇的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min用純水沖洗泵頭清洗管路易受到細菌和霉菌的影響不能直接用有機溶劑沖洗緩沖鹽溶液緩沖液第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日流動相的更換不互溶的流動相不能直接更換緩沖鹽不能直接用有機溶劑更換水正己烷異丙醇緩沖鹽有機溶劑水第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日液相色譜簡易流程圖輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數據處理廢液第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日液相系統(tǒng)維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器手動進樣器檢測器色譜柱第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日泵工作示意圖

凸輪柱塞桿柱塞密封圈單向閥

泵頭流動相入口流動相出口第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日LC-20AT串聯式柱塞往復泵LC-20AD并聯式微體積柱塞往復泵柱塞泵的基本結構LC-10ATvp

LC-10ADvp

單向閥單向閥單向閥1_at.flv1_ad.flv第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日單向閥單向閥結構球座吸液沖程排液沖程出口單向閥進口單向閥泵頭拋光面寶石球流動相單向閥工作原理第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日單向閥結構請不要分解閥心A和閥心B重新組裝后性能不被保證，輸液可能不穩(wěn)定注意：第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日線路過濾器故障：堵塞現象：系統(tǒng)壓力偏高措施：異丙醇（或5％稀硝酸），超聲波清洗判斷依據：關閉排液閥，斷開出口管路，設定流速1mL/min，如壓力>0.5MPa，則堵塞。排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相線路