實(shí)驗(yàn)重組與細(xì)胞轉(zhuǎn)化年博

實(shí)驗(yàn)重組與細(xì)胞轉(zhuǎn)化年博1第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)一：DNA重組與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)二：重組DNA提取與鑒定實(shí)驗(yàn)三：基因組DNA制備實(shí)驗(yàn)四：PCR實(shí)驗(yàn)五：SDS實(shí)驗(yàn)六：WesternBlot實(shí)驗(yàn)七八：SouthernBlot課程負(fù)責(zé)人：潘鑾鳳教師：邵紅霞（秘書）王松梅支秀玲2第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)流程圖質(zhì)粒重組轉(zhuǎn)化鑒定制備探針實(shí)驗(yàn)一、二SouthernBlot實(shí)驗(yàn)七、八

細(xì)胞培養(yǎng)基因組DNA的制備濃度測定

PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)三、四3細(xì)胞總蛋白提取濃度測定SDSWesternBlot實(shí)驗(yàn)五、六3第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日溫馨提醒女廁在3、5樓西側(cè)；男廁在2、4樓西側(cè)寄包柜密碼僅一次有效，再次寄存需重新啟動。非貴重物品建議不要寄存，可放置旁邊的架子上走廊左側(cè)有飲水機(jī)4第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)注意事項1.實(shí)驗(yàn)用品分組（3人一組）標(biāo)記，放于實(shí)驗(yàn)桌上。實(shí)驗(yàn)開始時清點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束，請各組同學(xué)將用品歸于原位，整理好本組桌面后再離開。需要回收的器皿初步?jīng)_洗后浸泡在水槽內(nèi)的盆中（如玻璃耗材等，有疑問請咨詢帶教老師）實(shí)驗(yàn)開始前請勿亂翻動！每組2個盆，1個桶，分別放冰，液體垃圾，固體垃圾，結(jié)束時每組自行清理5第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日2.實(shí)驗(yàn)試劑：常規(guī)試劑通常3人一組放在桌上，部分試劑一大桌放一管需要低溫放置的試劑在講臺，需到講臺來加樣，特別是酶，加完及時放回原位有些常規(guī)用試劑（如水，加樣buffer），可室溫保存，多次使用6第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日3.離心機(jī)的正確使用：（注意安全和儀器保護(hù)）

平衡——15ml連同托架一起平衡，1.5ml目測體積，對應(yīng)位置放置離心機(jī)蓋（包括內(nèi)蓋）

最高速度不能超限離心時，請等到達(dá)設(shè)定轉(zhuǎn)速并運(yùn)轉(zhuǎn)正常后再離開離心結(jié)束如是低溫離心，請先開機(jī)將離心機(jī)預(yù)冷，離心間歇階段關(guān)機(jī)蓋，離心結(jié)束，請打開機(jī)蓋晾干7第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日4.加樣槍Pipet的正確使用

當(dāng)加樣槍轉(zhuǎn)到它的最高體積時，絕對不能再往前轉(zhuǎn)，不然這把加樣槍就會被損壞，完全不能再用。選用合適量程的加樣器正確進(jìn)行刻度調(diào)節(jié)（不能旋過頭）清潔愛護(hù)加樣器吸樣品和加樣品時的手勢合理8第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日加樣槍的保護(hù)：吸取樣品時，加樣槍不要碰到管口或瓶壁吸取酚、氯仿等腐蝕性液體時，要慢吸快放刻度調(diào)試和清洗消毒保證吸取樣品量的準(zhǔn)確并且不造成試劑浪費(fèi)

9第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日加樣前，先將EP管輕彈幾下混勻，然后再進(jìn)行短暫離心后才能吸取樣品吸取樣品的時候，為保證吸取量的準(zhǔn)確，需盡可能將槍頭深入液體深部吸取粘稠的樣品如DNA時，宜慢慢吸取以保證量的準(zhǔn)確，還可用同批槍頭吸取水分以觀察液體在槍頭上的位置以保證吸取量的準(zhǔn)確先加體積大的樣品，特別是水，然后再加小體積的樣品或酶等小體積的樣品或酶要加入到液體中，并需輕輕吹打幾次以混勻關(guān)于加樣槍使用，以下說法正確嗎？√×√√×10第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日5.實(shí)驗(yàn)中請注意化學(xué)試劑對人體的傷害。（帶手套）

如酚有腐蝕性；溴化乙啶有致癌之嫌；丙烯酰胺有神經(jīng)毒性；某些酸堿，尤其濃酸濃堿的腐蝕性；等等。（嚴(yán)防手套造成二次污染）6.紫外線會造成眼睛損傷。在紫外檢測儀上觀察電泳條帶時要蓋好有機(jī)玻璃板，或戴上防護(hù)面罩。7.值日生將按組輪流，負(fù)責(zé)整理實(shí)驗(yàn)室。值日生負(fù)責(zé)清理實(shí)驗(yàn)室，倒垃圾，最后離開11第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)報告撰寫實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)時間、學(xué)生姓名、學(xué)號、專業(yè)、帶教老師等實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)器材和試劑（可不寫）、實(shí)驗(yàn)步驟（簡單）、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)注意事項等實(shí)驗(yàn)討論（對實(shí)驗(yàn)過程、結(jié)果的討論；自己的體會等）（重點(diǎn)）實(shí)驗(yàn)報告要求每人獨(dú)立完成，分四次上交12第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日儀器及位置介紹恒溫氣浴搖床412室超凈工作臺13第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日410室制冰機(jī)低溫冰箱14第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日402室PCR儀微孔板分光光度計+Take3?超微量多體積檢測板15第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日交聯(lián)儀雜交爐402室16第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日水浴鍋實(shí)驗(yàn)室側(cè)邊臺脫色搖床17第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日1.5ml離心機(jī)臺式（低溫）離心機(jī)實(shí)驗(yàn)室側(cè)邊臺微波爐18第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日電熱恒溫培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)室側(cè)邊臺分光光度計19第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日15ml離心機(jī)臺式（低溫）離心機(jī)實(shí)驗(yàn)室后面邊臺20第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)室桌上漩渦振蕩器常溫低速小離心機(jī)21第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日可調(diào)微量加樣器和加樣頭實(shí)驗(yàn)室桌上22第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日接種環(huán)推棒實(shí)驗(yàn)室桌上23第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日長玻璃試管刻度吸管滴管實(shí)驗(yàn)室桌上離心管24第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞（E.coliHB101）2．目的基因與載體的連接

（c-myc＋pSV；粘端連接）3．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選轉(zhuǎn)化體

（HB101；Ampr）實(shí)驗(yàn)一 DNA重組與細(xì)胞轉(zhuǎn)化第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、基因工程技術(shù)的基本內(nèi)容質(zhì)粒載體（pSV）的構(gòu)建目的基因（c-myc基因片段）的獲取載體與目的基因的連接（粘端連接）重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞（CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞）重組體的鑒定目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的分離、鑒定26第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日pBR322pSV3.5kbBamHIXbaIc-mycDNA片段4.8kbT4DNA連接酶大腸桿菌HB101CaCl2法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化Amp平板轉(zhuǎn)化推板孵育過夜8.5kbBamHIXbaIpSV27第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日pSV-c-mycBamHIXbaIc-myc基因片段4.8kbpSV2載體片段3.5kbpSVcmyc1[pmetD](ATCC?41029?)-TCTAGA--AGATCT-粘性末端防止載體的自身環(huán)化目的基因定向插入28第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日目的基因（c-myc基因片段）的獲取c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一c-myc基因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)本實(shí)驗(yàn)采用的4.8kbc-myc基因位于2,3外顯子區(qū)域BamHI和XbaI雙酶切處理29第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日

載體與目的基因的連接構(gòu)建重組子1.平端連接

增加DNA濃度或提高連接酶濃度以提高連接效率2.粘端連接

效率較高，加入連接酶后可立即轉(zhuǎn)化，即有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)3.粘-平連接30第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日連接酶的選擇：

T4DNA連接酶：適用粘端、平端連接

可用于DNA-RNA，RNA-RNA雜交體大腸桿菌DNA連接酶：適用粘端連接（也可用于平端，效率低）連接溫度：

一般12~16℃，也可提高溫度到22℃載體與目的基因的比例：

摩爾比約1：1~1：531第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化：將異源DNA分子引入另一細(xì)胞，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀。感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)特殊方法（如電擊、CaCl2等處理，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，允許帶外源DNA的載體分子進(jìn)入的狀態(tài)，稱之。轉(zhuǎn)化體的篩選：選擇性培養(yǎng)基

如：Amp抗性平板32第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)步驟

（詳見實(shí)驗(yàn)講義）

1.目的基因c-myc與pSV質(zhì)粒載體的連接(粘端)目的基因片段（4.8kb），20ng/μl3μL載體DNA（3.5kb），20ng/μl1.5μL10×buffer1μLT4DNA連接酶（5U/μl)0.5μL

ddH2O4μL

總體積：10μL

混勻，22℃水浴中溫育1小時，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

注意：加樣前短暫離心加樣順序保證每個樣品加入其中加樣完成后混勻后離心33第三十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日2.CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞注意：最好在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，或火焰旁5cm無菌圈注意無菌操作和冰浴離心前必須平衡34第三十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日倒入經(jīng)冰預(yù)冷的15mL離心管，冰浴10min37℃振搖約2h，細(xì)菌長至云霧狀取0.1mL大腸桿菌HB101培養(yǎng)物，加至5mLLB培養(yǎng)液中4℃，4000rpm，離心10min棄上清，在紙巾上倒置1min，重懸于200μL0.1mol/LCaCl2分裝成50μL/管沉淀重懸于冰預(yù)冷的1mL，0.1mol/LCaCl2，混勻轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，冰浴10min4℃，4000rpm，離心10min棄上清，在紙巾上倒置1min35第三十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞5μL連接產(chǎn)物或陽性對照質(zhì)粒1μL分別加入50μL感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min42℃90sec立即冰浴1~2min分別加入LB培養(yǎng)液150μL，37℃振搖45min分別取100μL鋪板于含Amp的LB平板轉(zhuǎn)移要快，溫度要準(zhǔn)確37℃溫箱培養(yǎng)過夜36第三十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日影響轉(zhuǎn)化效率的因素1.感受