第四章酶的分離純化

Chapter4

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的提取、分離和純化1Contentsofchapter4第一節(jié)酶的提取與分離純化技術(shù)路線第二節(jié)細(xì)胞破碎第三節(jié)酶的提取第四節(jié)酶的分離方法GoGoGoGo第五節(jié)酶的濃縮、干燥與結(jié)晶Go第六節(jié)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)Go2第一節(jié)酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。3酶的純化過程，約可分為三個(gè)階段：(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein):取樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用

鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各種

柱層析法。(3)均質(zhì)酶(homogeneous):目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段4第二節(jié)細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)5機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理6利用搗碎機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。用于破碎動(dòng)物內(nèi)臟、植物葉芽等比較脆嫩的組織細(xì)胞，也可以用于微生物，特別是細(xì)菌細(xì)胞的破碎。利用研缽、石磨、球磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎?？梢约尤刖剖⑸啊⑿〔Ａ?、氧化鋁等作為助磨劑。常用于微生物和植物組織細(xì)胞的破碎。7細(xì)胞對(duì)破碎方法的敏感性細(xì)胞聲波機(jī)械滲透壓凍融————————————————————?jiǎng)又参?+++++++++++革蘭氏陰性菌++++++++革蘭氏陽性芽孢菌

++++++酵母++++革蘭氏陽性球菌+-++菌絲-++-++孢子----8有機(jī)溶劑可以使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，使胞內(nèi)酶等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到細(xì)胞外。為了防止酶的變形失活，操作過程應(yīng)在低溫的條件下進(jìn)行。表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而增加細(xì)胞膜的透過性。表面活性劑有離子型和非離子型之分，離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞破碎效果較好，但是會(huì)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶的催化活性。所以在酶的提取方面，一般采用非離子型的表面活性劑。9細(xì)胞破碎確認(rèn)

1.直接測(cè)定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：

破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)；破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。2.測(cè)定導(dǎo)電率：利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測(cè)定破碎程度。3.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測(cè)定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。10酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。第三節(jié)酶的提取11提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。采用低溫下（0--10℃）操作。12一、酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶13鹽溶:當(dāng)加入少量鹽時(shí)，增多了蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)，因而增大了蛋白質(zhì)在水中溶解度，出現(xiàn)“鹽溶”現(xiàn)象。鹽析:當(dāng)鹽濃度增加到一定濃度時(shí)，一方面大量的水同鹽分子結(jié)合，使得蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水膜，容易沉淀出來；另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質(zhì)分子，相互磁撞時(shí)即發(fā)生相互聚集沉淀出來，這樣就出現(xiàn)了“鹽析”現(xiàn)象。141516二、影響提取的主要因素1、溫度

提取時(shí)的溫度對(duì)酶的提取效果有明顯影響。一般來說，適當(dāng)提高溫度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的擴(kuò)散速度，但是溫度過高，這容易引起酶的變形。在不影響酶的活性的條件下適當(dāng)提高溫度，有利于酶的提取。2、Ph

在等電點(diǎn)的條件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有其各自不同的等電點(diǎn)。為了提高酶的溶解度，提取時(shí)應(yīng)該避開酶的等電點(diǎn)，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜過高或過低，以免引起酶的變形失活。173、提取液體積增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般總用量為原料體積的3-5倍。在酶的提取過程中，含酶原料的顆粒體積越小則擴(kuò)散面積越大，有利于提高擴(kuò)散速度；適當(dāng)?shù)臄嚢杩梢允固崛∫褐忻阜肿友杆匐x開原料顆粒表面，從而增大兩相界面的濃度差，有利于提高擴(kuò)散速度；適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間，可以使更多的酶溶解出來。18第四節(jié)酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go191、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離201.1鹽析

Ks分段鹽析：在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值)使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。Ks：代表鹽析效率。其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。β：表示溫度一定時(shí)，離子強(qiáng)度為0時(shí)某一蛋白質(zhì)的溶解度.β分段鹽析：在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（I為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。2122有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等，丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。介電常數(shù):介質(zhì)在外加電場(chǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生感應(yīng)電荷而削弱電場(chǎng)，原外加電場(chǎng)(真空中)與最終介質(zhì)中電場(chǎng)比值.1.2有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）23優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高

2）沉淀不需脫鹽3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。

影響因素：（1）溫度：低溫（0℃）操作。（2）pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。（3）離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度目的防止蛋白質(zhì)變性（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml24252、離心分離

離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。26相對(duì)離心力以往離心機(jī)的轉(zhuǎn)速常以每分鐘多少轉(zhuǎn)表示，現(xiàn)在常用相對(duì)離心力（RCF）表示。兩者互換公式如下：RCF=1.2×10-5×R×N2N表示轉(zhuǎn)速，單位為轉(zhuǎn)/分(r/min);R表示離心半徑，即離心管底端至軸心的距離，單位為厘米（cm）；RCF表示相對(duì)離心力，單位用重力加速度g（g＝9.8m/s）27常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī),其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。2.1離心機(jī)的選擇常速離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)28高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。29303132離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：和離心速度相配大小：和轉(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋332.2常用離心方法

差速離心法沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法等密度梯度離心34（1）差速離心

（differentialcentrifugation）

采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。2）貼壁嚴(yán)重。3）沉降的顆粒受到擠壓。35

差速離心分離示意圖（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時(shí)間后顆粒的沉降情況

3637（2）密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。

特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。3839密度梯度離心

步驟：A.形成密度梯度B.加樣C.離心D.收集樣品40Densitygradientultracentrifugation41（3）等密度梯度離心

又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點(diǎn)：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。42根據(jù)顆粒間存在密度差異，在梯度液中進(jìn)行離心分離時(shí)顆粒到達(dá)各自等密度區(qū)域后就不再移動(dòng)了，形成一層層顆粒區(qū)帶。等密度梯度分為自成形梯度與預(yù)成形梯度。自成形梯度是將梯度介質(zhì)與樣品混在一起，通過離心，介質(zhì)形成密度梯度，樣品顆粒分布在各自不同等密度位置上。預(yù)成形梯度是預(yù)先將梯度液按下重上輕鋪置于離心管內(nèi)。它又分線性梯度與階梯梯度。線性梯度由梯度儀制備或階梯梯度經(jīng)過擴(kuò)散作用而形成，階梯梯度多用手工鋪置而成。43

等密度梯度離心示意圖

（a）離心前；（b）離心后

44密度梯度離心等密度梯度離心梯度介質(zhì)通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降樣品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降樣品離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度分離依據(jù)密度相近，但沉降系數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)45總結(jié)：等密度梯度離心是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。差速離心是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。463、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)47膜分離

借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場(chǎng)膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴(kuò)散膜分離透析483.1加壓膜過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜49微濾(Microfiltration，MF)一種靜態(tài)過濾，隨過濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞50超濾(ultrafiltration，UF)

一種動(dòng)態(tài)過程，由泵提供推動(dòng)力，在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力：一個(gè)是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個(gè)是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。

51常規(guī)過濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB52反滲透（Reverseosmosis，RO）

利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑(通常是水)的性質(zhì)，對(duì)溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。53滲透與反滲透54ReverseOsmosis(RO)Nanofiltration(NF)Ultrafiltration(UF)Microfiltration(MF)553.2擴(kuò)散膜分離--透析（dialysis）溶質(zhì)分子Y從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動(dòng)56蛋白質(zhì)透析57透析方法及裝置

透析袋透析簡(jiǎn)單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖

583.3電場(chǎng)膜分離（1）電滲析：在外加直流電場(chǎng)的作用下，利用膜的選擇透過性，使離子從一部分水中遷移到另一部分水中的物理化學(xué)過程。

＋—電滲析半透膜（2）離子交換膜電滲析：用離子交換膜代替一般的半透膜。應(yīng)用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。594、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。60色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒

用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。61層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離62吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離混合物中各組分的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

4.1吸附層析6364654.2分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，分配系數(shù)是一常數(shù)。66

在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析6768離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。4.3離子交換層析697071凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。4.4凝膠層析7273747576凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時(shí)的洗脫液體積（ml）77凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時(shí),即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時(shí),即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。782.常用凝膠1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextrangel)商品名:Sephadex型號(hào)SephadexG－10至G-200G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。792）瓊脂糖凝膠（agarosegel)商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美國(guó)）依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。803）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）

商品名為Bio-Gel,型號(hào)從Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。81親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物,酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段,RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.4.5親和層析82配基83親和層析的四個(gè)要素84Affinitychromatography85根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：

分子對(duì)親和層析免疫親和層析

共價(jià)親和層析疏水層析

金屬離子親和層析染料親和層析凝集素親和層析

8687大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，但分子內(nèi)部存在一個(gè)疏水核心，欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁（hydrophobicpatch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。疏水層析原理:88在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進(jìn)行解吸附。89904.6層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的層析技術(shù)。在層析系統(tǒng)中，柱內(nèi)裝上多緩沖離子交換劑，當(dāng)加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液流過層析柱時(shí)，在層析柱內(nèi)形成穩(wěn)定的PH梯度。欲分離酶液中的各個(gè)組分在此系統(tǒng)中會(huì)移動(dòng)到（聚焦于）與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙?，從而使不同等電點(diǎn)的組分分離。91在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。+-5、電泳分離顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。925.1電泳的分類按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。

以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。

93③瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。94水平板式電泳槽垂直板式電泳槽955.2SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡(jiǎn)稱SDS－PAGE。是目前測(cè)定蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量（relativemolecularmass,Mr）的一種最好的辦法。96SDSseparatesproteinsbyMw97原理：

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長(zhǎng)度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。98兩者關(guān)系：蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對(duì)遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。991001015.3等電聚焦

(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI

的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。102原理

兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)不再泳動(dòng)，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。103兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。(2)導(dǎo)電性能好——以保持電場(chǎng)強(qiáng)度的均勻性。(3)分子量小——電泳后易分離除去。(4)化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測(cè)定。(5)與樣品中的化學(xué)組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。104等電聚焦電泳1056、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個(gè)液相。有時(shí)也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：

有機(jī)溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取

反膠束萃取

1066.1雙水相萃取，又稱水溶液兩相分配技術(shù)（partionoftwoaqueousphasesystem）

用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran），濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系，由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%?90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。

107雙水相萃取的聚合物不相容性：根據(jù)熱力學(xué)第二定律，混合是熵增過程可以自發(fā)進(jìn)行，但分子間存在相互作用力，這種分子間作用力隨相對(duì)分子質(zhì)量增大而增大。當(dāng)兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時(shí)，由于相對(duì)分子質(zhì)量較大的分子間的排斥作用與混合熵相比占主導(dǎo)地位，即一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱為聚合物的不相溶性。由于聚合物分子的空間阻礙作用，使他們無法相互滲透，不能形成均一相，從而有相分離的傾向。108各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉1091106.2反膠團(tuán)萃?。?）反膠團(tuán)：又稱反膠束（ReversedMicelles）指表面活性劑（由親水的極性基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)兩部分組成）分散在連續(xù)有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級(jí)的聚集體。

反膠團(tuán)模型親水基團(tuán)向內(nèi)聚集111112（正）膠束反膠束形成表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。構(gòu)造表面活性劑極性基團(tuán)在外，非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成非極性核心。表面活性劑非極性基團(tuán)在外，極性基團(tuán)在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（waterpool）。功能溶解非極性物質(zhì)溶解極性物質(zhì)113p154114（2）萃取過程第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相中，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的反萃取過程。1157超臨界流體萃取超臨界流體是介于氣液之間的一種既非氣態(tài)又非液態(tài)的物態(tài)，這種物質(zhì)只能在其溫度和壓力超過臨界點(diǎn)時(shí)才能存在。超臨界流體的密度較大，與液體相仿，而它的粘度又較接近于氣體。因此超臨界流體是一種十分理想的萃取劑。116超臨界流體的性質(zhì)

1）超臨界流體條件下的溶解度溶質(zhì)在一種溶劑中的溶解度取決于二種分子之間的作用力，這種溶劑一溶質(zhì)之間的相互作用隨著分子的靠近而強(qiáng)烈地增加,相互作用隨著分子的靠近而強(qiáng)烈地增加，也就是隨著流體密度的增加而強(qiáng)烈的增加。2)傳遞性質(zhì)值的范圍在氣體和液體之間臨界流體中的擴(kuò)散系數(shù)比在液相中要高出10-100倍,但是黏度就比其小10-100倍.117超臨界流體的溶劑強(qiáng)度取決于萃取的溫度和壓力。改變萃取劑流體的壓力和溫度，就可以把樣品中的不同組分按在流體中溶解度的大小，先后萃取出來.在低壓下弱極性的物質(zhì)先萃取，隨著壓力的增加，極性較大和大分子量的物質(zhì)與基本性質(zhì).所以在程序升壓下進(jìn)行超臨界萃取不同萃取組分，同時(shí)還可以起到分離的作用.118第五節(jié)酶的濃縮、干燥與結(jié)晶

一、酶的濃縮(一)蒸發(fā)濃縮

通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用真空濃縮。即在一定的真空條件下，使酶液在60℃以下進(jìn)行濃縮。119（二）

超濾濃縮

超濾(ultrafiltration)濃縮以壓力差為動(dòng)力，將待濃縮溶液通過超濾膜，酶分子較大被滯留，水分子和小分子選擇性透過，達(dá)到濃縮目的。圖4-61

酶的超濾濃縮

120（三）吸水劑

1.膠過濾濃縮：

利用葡聚糖凝膠SephadexG-25或G-50等的吸水特性。將干膠直接加入樣品溶液，吸水膨潤(rùn)后，再過濾或離心分出濃縮的酶液。1212.聚乙二醇濃縮：聚乙二醇（polyethyleneglycol），簡(jiǎn)稱PEG

。

利用PEG的吸水特性。將PEG涂于裝有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和鹽類，酶溶液即被濃縮。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液。122（四）反復(fù)凍融濃縮利用酶溶液相對(duì)于純水冰點(diǎn)較低的原理使酶分子與小分子物質(zhì)分離。

（五）沉淀法鹽析法，有機(jī)溶劑法123二、酶的干燥在固體酶制劑的生產(chǎn)過程中，為了提高酶的穩(wěn)定性，便于保存、運(yùn)輸和使用，一般都必須進(jìn)行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥;冷凍干燥;噴霧干燥;氣流干燥;吸附干燥等。

酶的干燥多采用冷凍干燥法。

將酶溶液在較低溫度下（-10℃~-50℃）凍結(jié)成固態(tài)，然后在高度真空條件下，將其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)而除去，也稱酶的升華干燥。

124125三、酶的結(jié)晶

結(jié)晶（Crystallization）是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)從蒸汽或溶液中析出的過程。

126

晶體沉淀——分子排列有規(guī)則蛋白質(zhì)沉淀

非晶體沉淀——分子排列無規(guī)則（無定形沉淀）

晶體內(nèi)部有規(guī)律的結(jié)構(gòu)決定了晶體的形成必須是相同的原子、離子或分子。

過飽和溶液的形成是結(jié)晶的原推動(dòng)力和首要條件。

127（一）結(jié)晶的條件酶的純度

純度越高越易結(jié)晶（>50％

）

2.酶的濃度（恰到好處）

濃度越高越易結(jié)晶，控制在飽和區(qū)以上，過飽和區(qū)以下的介穩(wěn)區(qū)內(nèi)。3.結(jié)晶溫度4.溶液pH5.離子強(qiáng)度

6.晶核

7.結(jié)晶時(shí)間128（二）結(jié)晶的方法

1.除去一部分溶劑，如蒸發(fā)濃縮使溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出晶體;2.不除去溶劑，而在溶液中加入沉淀劑，如中性鹽、有機(jī)溶劑等。鹽析法如，前述的有機(jī)溶劑法均可用于結(jié)晶等電點(diǎn)

129常用的結(jié)晶方法：透析平衡結(jié)晶法將酶液裝進(jìn)透析袋，對(duì)一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使酶液逐步達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶的過程。前提：酶液要達(dá)到一定純度（經(jīng)過純化）。酶液要濃縮到一定濃度。130Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）一、設(shè)計(jì)分離純化工藝的基本要求第六節(jié)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)131二、純化方案的設(shè)計(jì)（一）純化方法的選擇依據(jù)根據(jù)有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異調(diào)節(jié)溶解度：沉淀法2.根據(jù)分子大小、形狀的不同：

離心分離，膜分離，凝膠過濾3.根據(jù)分子電荷性質(zhì)的不同：

離子交換層析，電泳4.根據(jù)專一性結(jié)合的方法：親和層析5.其它：吸附層析，疏水層析132133（二）純化方法的排序

先選用粗放、