層析(包括：吸附層析、分配層析、離子交換層析、親和層析等)

層析技術(shù)（chromatography）一、簡(jiǎn)介1、層析法也稱色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。2、層析法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)，是分離各種生物大分子的主要手段之一，是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。3、40年代：兩位英國(guó)科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們首先提出了色譜塔板理論，獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。4、按照不同的標(biāo)準(zhǔn)層析法有不同的分類。根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積,可以定性及定量。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測(cè)出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時(shí)繪出層析圖。層析儀與電子計(jì)算機(jī)聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化，大大縮短分析時(shí)間。5、由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。近年來(lái)，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境化學(xué)、高分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。6、在層析法實(shí)驗(yàn)技術(shù)有凝膠層析法、離子交換層析法、高效液相層析法、親和層析法、聚焦層析法等二、原理及概念層析技術(shù)是一類物理分離方法,根據(jù)待分離混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別,使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相兩相中,由于各組分隨流動(dòng)相前進(jìn)的速度不同,從而得到有效分離。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼此分離的目的。層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動(dòng)相，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，當(dāng)待分離的混合物通過(guò)固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同，與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。基本概念固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。分配系數(shù)（distributioncoefficient）分配系數(shù)是指在一定的條件下（如溫度、壓力），某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值，分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)，常用K來(lái)表示Cs:溶質(zhì)在固定相中的濃度，Cm:溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度K值大表示其溶質(zhì)在固定相中濃度大，在洗脫過(guò)程中溶質(zhì)出現(xiàn)較晚

K值小表示某溶質(zhì)在流動(dòng)相中濃度大，故在洗脫液中出現(xiàn)較早有相似的K值，則表明兩組分層析峰會(huì)發(fā)生重疊，分離效果差分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)②固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)③層析柱的溫度。不同的層析機(jī)理，其K值函義不同:吸附層析中K值表示吸附平衡常數(shù)分配層析中K值表示分配系數(shù)離子交換層析中K表示交換常數(shù)親和層析中K表示親和常數(shù)。遷移率（Rf或比移值）是指：在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。常用Rf來(lái)表示遷移率實(shí)驗(yàn)中我們還常用相對(duì)遷移率的概念。相對(duì)遷移率是指：在一定條件下，在相同時(shí)間內(nèi)，某一組分在固定相中移動(dòng)的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動(dòng)的距離之比值。常用Rx來(lái)表示分配系數(shù)與遷移率的關(guān)系

K值大，就表明該組分與固定相結(jié)合力大，遷移率??；反之則結(jié)合力小，遷移率大

K增加，Rf減少；反之，會(huì)減少，Rf增加

不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。其差異越大，分離效果越理想。操作容量：在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量。每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)（或毫克數(shù)）。數(shù)值大，結(jié)合力強(qiáng)。膨脹度（Vβ)：在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積；即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。床體積（Vt)三、分類1、按兩相所處狀態(tài)分類

2、按層析原理分類名稱分離原理吸附層析法組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無(wú)親和力的其它組份分離3、按操作形式不同分類名稱操作形式柱層析法固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離薄層層析法將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離紙層析法用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離薄膜層析法將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離

凝膠層析（gelchromatography）凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）分子篩層析（molecularsievechromatography）凝膠過(guò)濾（gelfiltration）凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）凝膠層析的定義：凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析。葡聚糖凝膠（dextran）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide）瓊脂糖凝膠（agarose）SephacrylSuperdex聚苯乙烯凝膠一、凝膠的種類和性質(zhì)1.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）是指由葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。

G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l，3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷（見(jiàn)下式）為交聯(lián)劑將鏈壯結(jié)構(gòu)連接為三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物,交聯(lián)度由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制

葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來(lái)控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大。

G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表持水量（吸水率）乘以10（單位是mL/g干膠）,如G-25表示1g干膠持水2.5mL，吸水率是2.5mL/g干膠；G-100表示1g干膠持水10mL，依次類推。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。2.聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動(dòng)吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過(guò)自由基引發(fā)聚會(huì)形成聚丙烯酰胺凝膠。只要控制單體用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號(hào)的凝膠像Sephadex一樣，商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動(dòng)溶脹成膠。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從Bio-GelP-2至Bio-Ge1P-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度（按球蛋白或肽計(jì)算），所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大目前。瓊脂糖凝膠（Sepharose）瓊脂糖凝膠（agarosegel）可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區(qū)間擴(kuò)大到大分子和病毒顆粒，其最大范圍可達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量108，其結(jié)構(gòu)是由β-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結(jié)合的鏈狀多糖。它既具有瓊脂凝膠相同的分離區(qū)間，又沒(méi)有吸附作用。但其穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強(qiáng)酸強(qiáng)堿能引起結(jié)構(gòu)破壞。最好使用條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃。對(duì)樣品的吸附作用很小瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會(huì)發(fā)生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時(shí)洗脫速度可以比較快排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以0－30°C為宜二、凝膠層析的基本原理

凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的

凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。

當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。l分子大小不同混合物上柱；2洗脫開(kāi)始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3大小分子分開(kāi)：4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中幾個(gè)概念：外水體積、內(nèi)水體積、基質(zhì)體積、柱床體積、洗脫體積對(duì)某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積Ve、Vo和Vi之間的關(guān)系可用下式表示：

Ve＝Vo＋Kd.Vi可改寫為：（Ve-Vo）Kd=－－－－Vi當(dāng)Kd＝0時(shí)，Ve=Vo，說(shuō)明這種溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大，完全不能進(jìn)入凝膠顆粒微孔內(nèi)，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來(lái)；當(dāng)Kd＝1時(shí)，即Ve小分子＝Vo＋Vi=Vt，說(shuō)明這種溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量小，完全向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散，在洗脫過(guò)程中將最后流出柱外。當(dāng)0＜Kd＜l時(shí)，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散，Kd愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大,分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。對(duì)于凝膠層析，分配系數(shù)實(shí)質(zhì)上表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。在凝膠層析中，分配系數(shù)通常表示為：Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系：Kav＝－blgMW＋c

凝膠層析的分配系數(shù)排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離例如SephadexG-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來(lái)。排阻極限吸水率和床體積

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。凝膠顆粒的大小通常以目數(shù)（mesh）或者顆粒直徑（mm）來(lái)表示柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢一般比較常用的是100－200目三、凝膠的選擇、處理和保存1.凝膠的選擇選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號(hào)、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強(qiáng)度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖對(duì)生物樣品來(lái)說(shuō)，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開(kāi)，如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級(jí)分離。后者對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作要求都比較高組分離時(shí)要選擇能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，這樣分離效果好。一般常用排阻極限較小的凝膠類型例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無(wú)機(jī)鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無(wú)機(jī)鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用SephadexG-25凝膠作為分離固定相，因?yàn)樗姆蛛x范圍是1000～5000D。對(duì)于分子量小于5000D的肽類進(jìn)行脫鹽操作則常選用SephadexG-15凝膠。分級(jí)分離時(shí)則要根據(jù)樣品組分的具體情況來(lái)選擇凝膠的類型，凝膠的分離范圍一方面應(yīng)包括所要的各個(gè)組分的分子量，另一方面要合適，不能過(guò)大選擇凝膠型號(hào)時(shí)必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。Kd不要都接近于0或1。如果樣品中含有3個(gè)組分的話，最好一個(gè)接近全排阻，另一個(gè)接近全滲入，第三個(gè)為部分滲入。分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運(yùn)動(dòng)所受的約束很小，不易與低分子組分分開(kāi)。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開(kāi)。

不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖

凝膠使用前要首先要進(jìn)行處理。選擇好凝膠的類型后，首先要根據(jù)選擇的層析柱估算出凝膠的用量干膠用量（g）＝柱床體積（ml）/凝膠的床體積（ml/g）由于凝膠處理過(guò)程以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計(jì)算的基礎(chǔ)上再增加10％－20％。凝膠的處理葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。較快的做法是將干膠往水里加，邊加邊攪，以防凝膠結(jié)塊，然后放到沸水浴中加熱接近100℃，幾個(gè)小時(shí)就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用。但應(yīng)注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理膨化處理后，要對(duì)凝膠進(jìn)行純化和排除氣泡純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細(xì)小凝膠顆粒。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會(huì)影響分離效果，可以通過(guò)抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。1.層析柱的選擇層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對(duì)分辨率的要求來(lái)進(jìn)行選擇。層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高。（P102,圖6-5）層析柱長(zhǎng)度不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過(guò)慢等。三凝膠層析的基本操作新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過(guò)柱床。新裝好的柱要檢驗(yàn)其均勻性－可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對(duì)光檢查，看其是否均勻或有無(wú)氣泡存在。

凝膠柱的鑒定

在凝膠層析中流動(dòng)相只是起運(yùn)載工具的作用，一般不依賴于流動(dòng)相性質(zhì)和組成的改變來(lái)提高分辨率凝膠層析洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來(lái)說(shuō)只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。洗脫液的選擇一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右而分組分離時(shí)加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。樣品的粘度不能過(guò)大，否則會(huì)影響分離效果。

加樣量

樣品黏度對(duì)洗脫曲線的影響（1）終濃度為5%，相對(duì)粘度11.8;（2）終濃度為2.5%，相對(duì)粘度4.2;（3）使終濃度為1%.

流速對(duì)洗脫曲線的影響凝膠保存方法濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦?，通常加?.02％的疊氮化鈉，4°C下保存。半收縮保存：水洗后濾干，加70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存；干燥保存：水洗后濾干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時(shí)，切忌一上來(lái)就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。1、生物大分子的純化

凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純2.分子量測(cè)定

在一定的范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav以及Ve與其分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。

Kav＝－blgMW＋cVe＝－b‘lgMW＋c’五、凝膠層析的應(yīng)用3.脫鹽及去除小分子雜質(zhì)4.去熱源物質(zhì)5.溶液的濃縮離子交換層析一、原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，液體為流動(dòng)相。離子交換層析原理示意圖纖維素—O—CH2—COO---Na+離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或功能基團(tuán)）和反離子構(gòu)成?；|(zhì)電荷基團(tuán)反離子羧甲基纖維素離子交換劑組成示意圖離子交換基團(tuán)不但可結(jié)合到纖維上，還可結(jié)合到交聯(lián)葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。近年來(lái)離子交換色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。

離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹(shù)脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。

物質(zhì)的離子交換過(guò)程有兩個(gè)階段──吸附和解吸附。

雖然交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，但在層析柱上進(jìn)行時(shí)，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進(jìn)行，直至完全。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來(lái)。離子交換色譜的分配過(guò)程是交換與洗脫過(guò)程。交換達(dá)到平衡時(shí)：K值是反映離子交換劑對(duì)不同離子的結(jié)合力或選擇性的參數(shù)，所以稱K值為離子交換劑對(duì)B+、A+的選擇系數(shù)離子交換層析之所以能成功地把各種無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子或生命大分子物質(zhì)分開(kāi)，其主要依據(jù)就是離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力。或者說(shuō)不同物質(zhì)在同一離子交換劑上的選擇系數(shù)是不同的

但更多的是通過(guò)增加離子強(qiáng)度，使加入的離子與物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)離子交換劑上的電荷位置，使吸附的物質(zhì)與離子交換劑解開(kāi)。

不同物質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個(gè)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。

對(duì)于呈兩性離子的蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)，由此可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)改變它們的結(jié)合力或選擇不同類型的交換劑二、離子交換的分類實(shí)用的離子交換劑應(yīng)滿足的要求：

有高度的不溶性，在各種溶劑中進(jìn)行交換時(shí)，不發(fā)生溶解

有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換

有較多的交換基團(tuán)

有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，在使用過(guò)程中，不因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解或變形等現(xiàn)象分為陽(yáng)離子交換劑(cationexchange)（含酸性基團(tuán)）和陰離子交換劑(anionexchange)（含堿性基團(tuán)）。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，具體又可以分為：強(qiáng)、中、弱陽(yáng)和強(qiáng)、中、弱陰1、按活性基團(tuán)分類：2、按交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)分：（1）疏水性離子交換劑基質(zhì)是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹(shù)脂物質(zhì)。常用的是苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物（2）親水性離子交換劑基質(zhì)是一類天然的或人工合成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。常用的有纖維素、交聯(lián)葡聚糖等疏水性離子交換劑，以引入電荷基團(tuán)的性質(zhì)又分為：

陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(包括：強(qiáng)、中、弱）

陰離子交換樹(shù)脂(包括：強(qiáng)、中、弱)

鰲合離子交換樹(shù)脂（對(duì)金屬離子有較強(qiáng)的選擇性）a、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交聯(lián)劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電

強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：R-SO3H（磺酸基）和R-CH2SO3H（次甲基磺酸基）R代表基質(zhì)（樹(shù)脂）

中酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：R-PO3H2，R-POH2

弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：R-COOH，R-OCH2COOH，R-C6H5OH等弱酸性基團(tuán)；強(qiáng)酸性：R-SO3-H+＋Na+——R-SO3-Na+＋H+

弱酸性：R-COOH＋Na+——R-COONa＋H+b、陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換劑中引入的是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等鹼性基團(tuán)。強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)為季胺基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基中堿性陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)為叔胺基團(tuán)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)為伯胺或仲胺R-N+(CH3)3OH-＋Cl-——R-N+(CH3)3Cl-＋OH-強(qiáng)鹼性＃201號(hào)國(guó)產(chǎn)樹(shù)脂和國(guó)外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強(qiáng)鹼型陰離子交換劑。疏水性離子交換劑的特點(diǎn)：含大量的活性基團(tuán)、交換容量高、機(jī)械強(qiáng)度大、流動(dòng)速度快

主要分離無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷等小分子物質(zhì)

其次用于從蛋白質(zhì)溶液中除表面活性劑、兩性電解質(zhì)等

也可用于分離某些不易變性的蛋白質(zhì)親水性離子交換劑根據(jù)基質(zhì)性質(zhì)分為：a、纖維素離子交換劑樹(shù)脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)可分為陽(yáng)離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類。特點(diǎn)：骨架松散、親水性強(qiáng)、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高常用的有：甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、二乙基氨基乙基纖維素（DEAE）

骨架為交聯(lián)葡聚糖G-25或G-50，根據(jù)功能基團(tuán)的不同，亦可分為陽(yáng)離子交換和陰離子交換樹(shù)脂命名方法：交換活性基團(tuán)+骨架+原骨架編號(hào)特點(diǎn)：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率常用：CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-50等b、交聯(lián)葡聚糖離子交換劑是將電荷基團(tuán)（DEAE-或CM-等基團(tuán)）附著在SepharoseCL-6B上形成，如：DEAE-Sepharose（陰離子）CM-Sepharose（陽(yáng)離子）具有硬度大，性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。c、瓊脂糖離子離交換劑：性質(zhì)1、顏色、形狀—珠狀2、交聯(lián)度是表示離子交換樹(shù)脂中交聯(lián)劑的含量交聯(lián)度越大,凝膠的網(wǎng)結(jié)構(gòu)愈緊密,吸水后膨脹愈小,能分離的分子量越小,反之交聯(lián)度越小,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈疏松,吸水后膨脹愈大3、吸水量或膨脹度：離子交換樹(shù)脂含有大量親水基團(tuán)，與水接觸即吸水膨脹。測(cè)定膨脹前后樹(shù)脂的體積比，可得出膨脹度。與基質(zhì)和電荷基團(tuán)的性質(zhì)及溶液的pH值和離子強(qiáng)度密切相關(guān)。4、交換容量：指離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。交換容量是表征樹(shù)脂交換能力的重要參數(shù)，其表示方法有質(zhì)量交換容量（mmol/g干樹(shù)脂）和體積交換容量（mmol／mL樹(shù)脂）它又有“總交換容量”、“工作（有效）交換容量”和“再生交換容量”等三種表示方式?？偨粨Q容量，表示每單位數(shù)量(重量或體積)樹(shù)脂能進(jìn)行離子交換反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)的總量。--與本身性質(zhì)有關(guān)，不受測(cè)試條件影響

工作交換容量，表示樹(shù)脂在某一定條件下的離子交換能力，它與樹(shù)脂種類和總交換容量，以及具體工作條件如溶液的組成、流速、溫度等因素有關(guān)。5、流速：離子交換層析過(guò)程的流速一般是由離子交換劑的性質(zhì)、操作壓、層析柱體積和分離樣品的要求等因子控制。流速常用體積流速（mL/h）或線性流速（cm/h）表示。交換劑顆粒大，流速快洗脫液黏度大，流速慢適當(dāng)?shù)牧魉倏梢蕴岣邔游龅姆蛛x效果6、穩(wěn)定性7、比重（三）、離子交換劑與緩沖液的選擇提高有效成分的得率與分辨率（1）、陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇（2）、強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇（3）、不同離子型交換劑的選擇（4）、不同載體離子交換劑的選擇1、離子交換劑的選擇選用的平衡溶液的pH和離子強(qiáng)度等能使樣品中有效成分與離子交換劑進(jìn)行結(jié)合，而不能或較難與樣品中雜質(zhì)與離子交換劑結(jié)合?；蜻x用的平衡溶液的pH和離子強(qiáng)度，只能使有效成分與離子交換劑進(jìn)行松散結(jié)合，而雜質(zhì)與離子交換劑可牢固結(jié)合。關(guān)鍵在于了解有效成分的等電點(diǎn)。2、緩沖液的選擇新出廠的樹(shù)脂是干樹(shù)脂，要用水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有一些雜質(zhì)，所要要用水、酸、鹼洗滌。一般手續(xù)如下：新出廠干樹(shù)脂用水浸泡2小時(shí)后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無(wú)離子水洗至澄清，去水后加4倍量2NHCl攪抖4小時(shí)，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2NNaOH攪抖4小時(shí)，除鹼液，水洗到中性備用。（四）交換劑的處理，再生與轉(zhuǎn)型對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。將樹(shù)脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉(zhuǎn)型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；陽(yáng)離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H+型交換劑。用過(guò)的樹(shù)脂使其恢復(fù)原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、鹼液洗滌，往往只要轉(zhuǎn)型處理就行了。離子交換劑的再生離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/lNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/lNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。（五）裝柱加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來(lái)推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。（六）加樣與洗脫已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡(jiǎn)單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。洗脫：最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液；第一個(gè)容器與柱相連，兩容器連通；當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來(lái)補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。洗脫時(shí)應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。③梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。用來(lái)分離離子或可離解的化合物，凡是在流動(dòng)相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離廣泛地應(yīng)用于：無(wú)機(jī)離子、有機(jī)化合物和生物物質(zhì)(如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等)的分離及測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。離子交換色譜法的應(yīng)用

親和層析（affinitychromatography）親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。在生物體內(nèi)，許多大分子具有與某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補(bǔ)的DNA等，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結(jié)合能力稱為親和力。具有專一親和力的生物分子對(duì)主要有：抗原與抗體、DNA與互補(bǔ)DNA或RNA、酶與它的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等。親和色譜中兩個(gè)進(jìn)行專一結(jié)合的分子互稱對(duì)方為配基。如抗原和抗體，抗原可認(rèn)為是抗體的配基，反之抗體也可認(rèn)為是抗原的配基。將一個(gè)水溶性配基在不傷害其生物學(xué)功能的情況下與水不溶性載體結(jié)合稱為配基的固相化。欲分離的大分子物質(zhì)S和相對(duì)應(yīng)的專一物質(zhì)L（配體）以次級(jí)鍵結(jié)合，能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)-S，其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價(jià)鍵首先結(jié)合，而形成M-L-S復(fù)合物。根據(jù)L-S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理發(fā)展起來(lái)的層析方法稱為親和層析。親和層析是利用配基、配體之間專一可逆結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)分離的方法,因此其專一性、選擇性是極高的。柱體積小，上樣量大，洗脫流速快，操作步驟少缺點(diǎn)是要分離一種物質(zhì)必須找到適宜的配體，并將其制成固相載體之后方可進(jìn)行1、選擇配基；2、選擇偶聯(lián)凝膠；3、偶聯(lián)配基；4、裝填合適的柱；5、平衡（2-3倍體積緩沖液）；6、應(yīng)用樣品；7、洗滌未結(jié)合物質(zhì)；8、洗脫結(jié)合物質(zhì)→除鹽；9、再生；

一般推薦使用的程序如下：吸附層析（absorptionchromatography）任何兩個(gè)相都可以形成表面，其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)具有不同吸附力使混合物得到分離的現(xiàn)象就叫吸附層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)成柱的一種層析方法吸附→解吸→再吸附→再解吸→無(wú)數(shù)次洗脫→分開(kāi)

凡能將其他物質(zhì)聚集到自己表面的物質(zhì)稱吸附劑,包括硅皮,氧化鋁,活性炭,淀粉,纖維素及陶土;而聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱被吸附劑.吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外,還有化學(xué)作用,如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析中被分離的物質(zhì)之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵.常用術(shù)語(yǔ)：（p37-38）固定相，流動(dòng)相，層析，操作容量，床體積，洗脫體積外水體積，內(nèi)水體積，基質(zhì)體積，膨脹度，分配系數(shù)和遷移率吸附劑：吸附劑的選擇主要依據(jù)吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行選擇，極性強(qiáng)的易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性的易吸附非極性的物質(zhì)。吸附劑的活化，使用前需要活化，如硅膠，可在高溫烘烤1、吸附柱層析2、薄層層析（TLC）：是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，液體為流動(dòng)相的一種層析方法。特點(diǎn)：展開(kāi)時(shí)間短設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便溫度變化和溶劑飽和度對(duì)Rf值影響較小可使用腐蝕性顯色劑靈敏度高分類：聚酰胺對(duì)極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時(shí)，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競(jìng)爭(zhēng)形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過(guò)程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。聚酰胺薄膜層析聚焦層析是一種操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)的層析技術(shù)。它的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離的過(guò)程，因此本方法具有高分辨、高度濃縮和高度專一等特點(diǎn)。聚焦層析所用的凝膠首先用高pH溶液平衡，然后用多元緩沖液進(jìn)行洗脫，多元緩沖液pH呈梯度下降。聚焦層析聚焦層析所用凝膠主要有兩種：MONOP和多元緩沖液交換劑（PBE）。其中MONOP是帶孔小珠，孔中被帶正電荷的胺基填充，適用于高效聚焦層析。多元緩沖液