基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)第三講 分子生物學(xué)在藥理學(xué)中的應(yīng)用

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)第三講分子生物學(xué)在藥理學(xué)中的應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳法（SCGE)

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP)

mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR)

抑制消減雜交技術(shù)（SSH）

基因芯片技術(shù)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一、單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)單細(xì)胞凝膠電泳（Single-CellGelElectrophoresis,SCGE）：又稱慧星試驗(yàn)（cometassay），是一項(xiàng)較新的電泳方法。自1978年被Rydcbert等人成功地用于檢驗(yàn)單細(xì)胞DNA單鏈斷裂以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)，已成為一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)DNA損傷的方法，廣泛地應(yīng)用于DNA放射損傷、藥物的遺傳毒性評(píng)價(jià)、細(xì)胞凋亡鑒定等工作中。1.SCGE的基本原理有核細(xì)胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋結(jié)構(gòu)附著在核基質(zhì)中，用瓊脂糖凝膠將細(xì)胞包埋在載玻片上，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜及其它生物膜遭到破壞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)及其它成分進(jìn)入凝膠，繼而擴(kuò)散到裂解液中，但核DNA仍保持纏繞狀態(tài)附著在剩余的核骨架上，并留在原位。DNA超螺旋結(jié)構(gòu)細(xì)胞未受損傷:

電泳時(shí)，核DNA停留在核基質(zhì)中，呈圓形熒光團(tuán)，無(wú)拖尾現(xiàn)象。細(xì)胞受損:在中性電泳液（PH=8）中，DNA雙鏈斷裂時(shí)，斷片進(jìn)入凝膠，電泳時(shí)向陽(yáng)極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，形似彗星。在堿性電泳液（PH＞13）中，堿變性為單鏈，單鏈碎片進(jìn)入凝膠，電泳時(shí)離開(kāi)核DNA向陽(yáng)極遷移，形成拖尾。Singh等人1988年描述的SCGE具體操作方法(堿性SCGE法)

：細(xì)胞樣品處理：細(xì)胞染毒和細(xì)胞制備①細(xì)胞染毒：invitro,可直接將受試物加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，也可對(duì)包埋于瓊脂糖中細(xì)胞進(jìn)行染毒；invivo，以不同途徑給動(dòng)物染毒，間隔一定時(shí)間后，取組織分離細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活力，立即進(jìn)行SCGE分析。2.SCGE的簡(jiǎn)要操作步驟②細(xì)胞制備：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)時(shí)要注意胰酶消化和刮取收獲細(xì)胞的方式可誘導(dǎo)DNA損傷。制片：首先制備細(xì)胞懸液，然后制片。常用“三明治”凝膠：第一層，5％正常熔點(diǎn)瓊脂糖，第二層，細(xì)胞懸液與0.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖混合液（10：1）,第三層，0.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖。細(xì)胞裂解：堿性試驗(yàn)中，pH值為10～12的含去污劑的高鹽溶液做溶解液，以裂解細(xì)胞。電泳：電泳前先將玻片浸沒(méi)于堿性電泳緩沖液中，使DNA解螺旋，然后進(jìn)行電泳。中和，染色：用Tris緩沖液中和凝膠后，用染色劑染色。常用染色劑有溴化乙錠、吖啶橙、碘化丙啶（PI）等。圖像分析：在熒光顯微鏡下觀察單細(xì)胞電泳圖像3.SCGE的主要計(jì)算指標(biāo)

典型的DNA損傷細(xì)胞熒光圖像象慧星一樣頭尾分明。（1）形狀指標(biāo)比較粗略的指標(biāo)。細(xì)胞分類：慧星樣細(xì)胞和非慧星樣細(xì)胞；計(jì)數(shù)一定量細(xì)胞中慧星樣細(xì)胞所占的比例，即慧星樣細(xì)胞發(fā)生率，估計(jì)DNA的損傷程度。特點(diǎn)：可通過(guò)鏡下觀察直接得到，方便實(shí)用。（2）距離指標(biāo)

尾長(zhǎng)，即沿電泳方向“慧星”尾部最遠(yuǎn)端與頭部中心的距離；總慧星長(zhǎng)度，即“慧星”電泳方向上的最大長(zhǎng)度；尾長(zhǎng)與頭部直徑比值等，以評(píng)價(jià)DNA損傷程度。特點(diǎn)：泳動(dòng)距離易于測(cè)量，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備及圖像處理軟件，在損傷因素劑量較大時(shí)，這些數(shù)值的大小與作用劑量之間呈較為良好的線性關(guān)系。（3）強(qiáng)度指標(biāo)用“慧星”頭部中心處熒光強(qiáng)度與電泳方向上一定距離處熒光強(qiáng)度的比值來(lái)描述DNA的損傷；根據(jù)“慧星”尾部熒光強(qiáng)度將細(xì)胞分為五類，由弱到強(qiáng)分別計(jì)為0、1、2、3、4，將100個(gè)細(xì)胞的分值加在一起表示DNA的損傷程度，該數(shù)值與總慧星長(zhǎng)度有較好的相關(guān)性。特點(diǎn)：不同程度地反映了電泳中泳動(dòng)DNA的量。（4）“矩”類指標(biāo)

“尾矩”（tailmoment，TM），尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積。特點(diǎn)：優(yōu)越，被廣泛接受。優(yōu)點(diǎn)：反映細(xì)胞群體中不同類型細(xì)胞對(duì)作用因素的不同反應(yīng)，為確定遺傳毒性因素的靶細(xì)胞提供可能；方便易行，對(duì)細(xì)胞所處生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有要求，也不需同位素標(biāo)記，適用于各種有核細(xì)胞；樣品用量少；試驗(yàn)周期短，靈敏、快速；對(duì)各種理化因素都較敏感，費(fèi)用少，非常適用于接觸遺傳性有害因素人群的生物檢測(cè)，并可用于篩檢對(duì)DNA損傷因素敏感的高危人群。4.SCGE方法的優(yōu)缺點(diǎn)不足：各實(shí)驗(yàn)室的操作方法差異極大，包括溶解液、電泳液的配方，電泳參數(shù)、DNA結(jié)合熒光染料的選擇都沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，有待改進(jìn)和完善5.SCGE在藥理學(xué)與毒理學(xué)中的應(yīng)用(1)DNA損傷與修復(fù)的研究很多化學(xué)物質(zhì)對(duì)DNA具有損傷作用，如氯乙烯(VCM)，交聯(lián)劑（如絲裂霉素C，MMC）、氧化劑等。(2)遺傳毒性評(píng)價(jià)(SCGE可能是研究低劑量遺傳效應(yīng)最有效的工具)如：二氯胺基酚≧50μg/ml，V79細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNA遷移，證明二氯胺基酚是DNA損傷劑。(3)生物檢測(cè)

放射檢測(cè)：以人外周血淋巴細(xì)胞作為檢測(cè)材料，γ射線照射－誘導(dǎo)突變；

環(huán)境因素對(duì)健康影響的早期檢測(cè)：長(zhǎng)期接觸苯的工人，其淋巴細(xì)胞DNA損傷比對(duì)照組顯著提高；

吸煙者比不吸煙者患肺癌的幾率高7－11倍；被動(dòng)吸煙者患癌癥的比例也在增加。

(4)細(xì)胞凋亡的研究

凋亡細(xì)胞DNA斷裂很有規(guī)律，發(fā)生在核小體之間，產(chǎn)生180～200bp大小的DNA片段，在SCGE試驗(yàn)中呈現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征。

？小頭大尾

熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有放射性原位雜交技術(shù)（insituhybridization,ISH）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。二、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)1.FISH技術(shù)基本原理通過(guò)熒光標(biāo)記的已知各類DNA和RNA單鏈核酸探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料（組織、細(xì)胞或染色體）中未知的單鏈核酸（DNA、RNA）在載玻片上進(jìn)行特異性結(jié)合（雜交），形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。2.探針?lè)诸惻c標(biāo)記

按結(jié)合位點(diǎn)分類：染色體特異性序列探針、由許多DNA大片段組成的全染色體探針和著絲點(diǎn)探針按制備方法分類：直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針直標(biāo)型探針：DNA探針直接共價(jià)連接熒光素基團(tuán)；低背景、高特異性間標(biāo)型探針：DNA探針先與某個(gè)半抗原（生物素或地高辛）連，再與熒光素基團(tuán)連接形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)。靈敏度高3.FISH簡(jiǎn)要操作步驟（1）探針的制備和標(biāo)記（2）原位雜交：變性處理染色體標(biāo)本和探針，復(fù)性雜交（3）熒光檢測(cè)：直標(biāo)型探針，熒光標(biāo)記的卵白素；間標(biāo)型探針，熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體。常用熒光標(biāo)記分子有異硫氰熒光素（綠光）、羅丹明（紅光）、德州紅（深紅）等。（4）熒光顯微鏡檢測(cè)：特定波長(zhǎng)光波激發(fā)4.FISH特點(diǎn)(1)避免使用放射性同位素帶來(lái)的問(wèn)題;(2)熒光試劑和探針標(biāo)記相對(duì)經(jīng)濟(jì)和安全；(3)快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特性高；(4)可同時(shí)分析中期和間期核，靈敏度高；(5)定位的DNA序列從1kb發(fā)展到整條染色體范圍；(6)根據(jù)基因組部位不同用不同顏色標(biāo)記探針，可在同一細(xì)胞核或中期染色體中顯示不同的顏色，可同時(shí)觀察代表不同染色體區(qū)域的熒光信號(hào)多色FISHM-FISH技術(shù)熒光原位雜交不同熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針顯示同一細(xì)胞

不同染色體區(qū)段上的DNA

5.FISH在藥理學(xué)與毒理學(xué)研究中的應(yīng)用（1）檢測(cè)有絲分裂中期細(xì)胞染色體畸變（2）檢測(cè)間期細(xì)胞染色體畸變常用間期分析方法是用特異染色體區(qū)域探針，如著絲重復(fù)序列探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)染色體非整倍體異常。5.FISH在藥理學(xué)與毒理學(xué)研究中的應(yīng)用（3）哺乳動(dòng)物精子非整倍體檢測(cè)是有效檢測(cè)人精子遺傳損傷尤其是染色體數(shù)目異常的可靠手段。如：用FISH技術(shù)評(píng)價(jià)吸煙、飲酒以及飲用咖啡等對(duì)精子染色體非整倍體的影響。（4）微核來(lái)源鑒定三、PCR-SSCP技術(shù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP):指單鏈DNA由于有鏈內(nèi)堿基配對(duì)而具有一定的空間構(gòu)象，當(dāng)DNA鏈上的堿基發(fā)生改變時(shí)，單鏈DNA會(huì)形成不同的構(gòu)象。

1.基本原理

將DNA單鏈放入非變性溶液，它將以序列特異方式折疊，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。而如果一個(gè)堿基發(fā)生改變，該分子折疊的形狀和大小就會(huì)有所不同。用非變性凝脈電泳分離時(shí)，不同形狀的DNA分子可能以不同的速度移動(dòng)，電泳完畢，這些片段位置就會(huì)不同，借此可以顯示片段中是否有堿基改變。2.簡(jiǎn)要操作步驟以檢測(cè)P53基因突變?yōu)槔海?）PCR擴(kuò)增目的片段DNA；（2）將樣品的1/10（約5μl）稀釋于15-40μl0.1%SDS，10mMEDTA溶液；（3）按1:1將上述溶液與98%甲酰胺、89mMTris、2mMEDTA、89mM甲酸、0.05%溴酚蘭、0.05%二甲苯青上樣液混合；（4）95℃熱變性2分鐘（產(chǎn)生單鏈，變性應(yīng)徹底）；（5）上樣（a）6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，（b）6%非變性聚丙烯酰胺凝膠加10%甘油；（6）在室溫電泳，8W8-16小時(shí)；（7）放射自顯影或銀染法3.影響SSCP分析結(jié)果的因素（1）片段大小最重要的因素Sheffield等人（1993年）對(duì)3個(gè)基因64個(gè)突變的研究結(jié)果復(fù)合而成的。最佳片段大小為155bp。（2）凝膠的孔徑/交聯(lián)度：10％凝膠，1.3％交聯(lián)度較好

（3）堿基組成和凝膠中甘油濃度（高G+C含量，蔗糖比甘油好）（4）電泳條件：溫度和電泳緩沖液的離子強(qiáng)度等

條件優(yōu)化：室溫5-10%甘油或4℃無(wú)甘油的情況下進(jìn)行電泳會(huì)獲得比較好的分析結(jié)果

（5）突變和鄰近序列效應(yīng)（corctexteffects）突變所在片段的性質(zhì)及突變所處的位置對(duì)檢測(cè)有影響4.SSCP方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，步驟少，無(wú)復(fù)雜的理論，無(wú)需特殊設(shè)備，突變條帶與野生型分開(kāi)后可用于分析，可以不用放射標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定，即銀染法；缺點(diǎn)：

突變位置未知，分析片段的大小受限制（150～200bp），強(qiáng)烈依賴實(shí)驗(yàn)條件的選擇，可能會(huì)漏檢突變，有時(shí)電泳結(jié)果比較復(fù)雜難于解釋。5.在藥理學(xué)和毒理學(xué)中的應(yīng)用（1）癌基因和抗癌基因突變的鑒定趙永良等大鼠氣管上皮細(xì)胞p53基因突變，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中p53基因Exon8的單鏈條帶有差異，經(jīng)證實(shí)G265C，精氨酸脯氨酸。α粒子輻射（2）化學(xué)致癌劑的致癌機(jī)理研究Maino等在1992年用化學(xué)致癌劑誘發(fā)小鼠鱗狀細(xì)胞癌，用SSCP法檢測(cè)出了特異性H-ras基因的第13密碼子發(fā)生了突變。（3）P450酶基因的突變研究

人CYP4F12基因組8個(gè)突變四、mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）

高等生物,30000個(gè)基因，10%的基因表達(dá)，按時(shí)間和空間順序有序進(jìn)行。包括新出現(xiàn)的基因表達(dá)與表達(dá)量有差異的基因表達(dá)。生物體表現(xiàn)出的各種特性，由基因的差異表達(dá)引起。藥物/毒物和環(huán)境因素引起的基因改變和新基因的出現(xiàn),未知；未知新基因的發(fā)現(xiàn)、分離和克隆是一項(xiàng)非常重要和具有創(chuàng)造性的工作。

常見(jiàn)差異性表達(dá)mRNA方法：

（1）mRNA差異顯示（mRNA-DifferentialDisplay，mRNA-DD）（2）抑制性消減雜交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）（3）cDNA代表性差異分析（cDNARepresentationalDifferenceAnalysis，cDNA-RDA）（4）cDNAmicroarray

原理：

真核細(xì)胞mRNA3’端具有多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)合成12種下游引物，即3′-錨定引物，通式為5’-TnMN-3′(n=10~20,M=dA/dC/dGN=dA/dC/dG/dT)。

5’-端隨機(jī)引物：20種，10bp

創(chuàng)始人LiangP和PardeeA

（一）傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）DDRT-PCR的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn):（1）速度快,較易操作；（2)由于PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高；（3)可同時(shí)比較兩種以上不同來(lái)源的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異。

缺點(diǎn):

（1）出現(xiàn)差別條帶太多,假陽(yáng)性率高達(dá)70%左右,重復(fù)性差,且對(duì)高拷貝數(shù)的mRNA具很強(qiáng)的傾向性；（2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個(gè)基因是已經(jīng)研究過(guò)的，哪些是未知基因；（3）得到的有差異的擴(kuò)增條帶短,一般在110～450bp之間；（4）局限性，只適合含PolyA尾的真核生物。

原理：

首先以oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

再用限制性內(nèi)切酶酶切cDNA，然后在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進(jìn)行擴(kuò)增。

（二）改進(jìn)的限制性酶切片段差異顯示技術(shù)（RFDD-PCR）參考文獻(xiàn)：胡岳山;李杰芬;王劍.限制性酶切片段差異顯示及其應(yīng)用.生物技術(shù)通訊.2004,15(1):65-66改進(jìn)的限制性酶切片段差異顯示技術(shù)（RFDD-PCR）RFDD-PCR優(yōu)點(diǎn)（1）采用優(yōu)先切割翻譯序列的限制性內(nèi)切酶（如TaqI），優(yōu)先展示編碼區(qū)，更加適合于下游功能分析；（2）使用標(biāo)記引物來(lái)擴(kuò)增，使差異條帶檢測(cè)更便利、靈敏；（3）重復(fù)性更高，極大地降低了假陽(yáng)性率。原理：

基于抑制PCR,并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化(normalization或equalization)和消減雜交(substractivehybridization)。抑制PCR通過(guò)利用含引物序列的雙鏈接頭(adaptor)充當(dāng)引物模板,使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段具有反向末端重復(fù)序列,PCR中不能擴(kuò)增,從而達(dá)到抑制非目的片段而選擇性擴(kuò)增目的片段的目的。標(biāo)準(zhǔn)化步驟平衡了目的基因群(tester)中cDNA的豐度,即低豐度差異表達(dá)的基因不會(huì)丟失,而高豐度差異表達(dá)的基因又不會(huì)被過(guò)量分離。消減雜交則扣除了目的基因群(tester)與驅(qū)趕基因群(driver)間的同源序列。

由Diatchenko等于1996年以mRNA差異顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的篩選未知差異表達(dá)基因的新技術(shù)。

（三）抑制消減雜交技術(shù)（SSH）suppressionsubtractivehybridization（SSH）SSH的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):（1）在雜交過(guò)程中，高豐度的雜交雙方較低豐度者容易退火，因而經(jīng)第一次消減雜交后，未雜交的高、低中度豐度序列濃度趨向一致；（2)操作容易掌握，步驟簡(jiǎn)便。無(wú)需像DDRT-PCR那樣，對(duì)每一條片段單獨(dú)進(jìn)行克隆；（3)敏感性較高；（4)重復(fù)性和可靠性高，真陽(yáng)性率可達(dá)90%以上。缺點(diǎn):（1）所需mRNA樣品量較多（1~2μg）（2)同DDRT-PCR和RDA等方法一樣，SSH中產(chǎn)生的cDNA片段以基因3’端序列為多。

（3)一次只能比較兩個(gè)樣本（1）腫瘤相關(guān)基因的篩選；（2）外源化合物或環(huán)境因素誘導(dǎo)的特異基因的研究；周等將人肺A549細(xì)胞暴露于鎳化合物，Ni3S2與NiCl2均可誘導(dǎo)出Cap43基因，另外的12種金屬化合物未能誘導(dǎo)出。結(jié)論：Cap43是鎳化合物誘導(dǎo)的特異基因。（3）細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的差異分析；（4）藥物/毒物作用機(jī)理研究和細(xì)菌耐藥機(jī)理研究。差異顯示技術(shù)在藥理學(xué)和毒理學(xué)中的應(yīng)用如：差異表達(dá)基因篩選－大腸桿菌對(duì)喹噁啉類耐藥分子機(jī)制研究檢測(cè)對(duì)象（tester）：大腸桿菌79O4-2驅(qū)趕者（driver）：大腸桿菌79~20

篩選到44個(gè)差異片段，其中18個(gè)為物質(zhì)合成相關(guān)基因，11個(gè)為物質(zhì)代謝相關(guān)基因，3個(gè)為膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，3個(gè)為參與鞭毛裝配的蛋白基因，1個(gè)為質(zhì)粒上的遷移蛋白基因，5個(gè)為功能未知的假定蛋白基因，3個(gè)在Genbank中未找到顯著相似序列。18個(gè)物質(zhì)合成相關(guān)基因分別參與蛋白質(zhì)、硫辛酸、類脂A、腸道菌共同抗原、脂肪酸、海藻糖和CTP的生物合成，11個(gè)物質(zhì)代謝相關(guān)基因分別參與損傷蛋白及時(shí)清除、糖原分解、氧化磷酸化過(guò)程。差異片段同源性分析推測(cè)耐藥機(jī)理：通過(guò)啟動(dòng)鐵硫簇結(jié)合蛋白、硫辛酸合成蛋白（LipA）和海藻糖合成蛋白（OtsA）的表達(dá)，抵抗氧化損傷

五、基因芯片技術(shù)

基因芯片(Genechip)：又稱DNA芯片（DNAChip）或生物芯片(Biologicalchip）?；蛐酒夹g(shù)是隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展而發(fā)展起來(lái)的，是90年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一。融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)。

1.基本原理：采用原位合成（insitusynthesis）或顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針固化于支持物（substrate）表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品按堿基配對(duì)的原理進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、高通量、高效的檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。

2.基因芯片的主要類型：

以片基(substrate)的不同分類：可以分為無(wú)機(jī)片基和有機(jī)合成物片基。片基探針固定方式探針密度顯色及檢測(cè)方式無(wú)機(jī)片基如玻片、半導(dǎo)體硅片等原位合成（insitusynthesis）高熒光，激光共聚焦掃描、定量分析；生物傳感器等有機(jī)合成片基如NC、Nylon膜等離片合成后點(diǎn)樣(off-chipsynthesis)低熒光基因芯片的主要類型及其簡(jiǎn)要特點(diǎn)以探針不同分類：主要有基因芯片（DNA和cDNA），蛋白質(zhì)或肽芯片、組織芯片等。3.

技術(shù)路線以核酸雜交為原理的檢測(cè)技術(shù)，其主要過(guò)程為：

樣品制備：擴(kuò)增的靶序列或樣品標(biāo)記雜交：標(biāo)記靶序列或樣品與探針雜交

芯片清洗

圖象的分析:

激光共聚焦顯微鏡對(duì)芯片掃描并進(jìn)行分析。

GeneExpressionMicroarry技術(shù)路線

4.優(yōu)缺點(diǎn)：（1）高通量：一次可以對(duì)大量的DNA分子或RNA分子進(jìn)行檢測(cè)分析；（2）自動(dòng)化程度高；（3）高效率；（4）需專用的儀器設(shè)備；（5）需專用的程序軟件分析，成本高（6）要求全基因組序列已知（1）大規(guī)模篩選差異表達(dá)基因以及環(huán)境有害因素對(duì)基因表達(dá)的影響研究

mRNA差異顯示、cDNA代表性差異分析、SSH：只能對(duì)少數(shù)基因的表達(dá)進(jìn)行分析；針對(duì)性不強(qiáng)，效率低下，絕大部分工作都是繁瑣重復(fù)勞動(dòng)。5.基因芯片技術(shù)在藥理學(xué)和毒理學(xué)中的應(yīng)用基因芯片技術(shù)：能夠從整個(gè)基因組水平上對(duì)某一刺激或疾病進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)基因芯片分析正常組織和藥物處理組織基因表達(dá)情況的差異，能夠從表達(dá)異常的基因中發(fā)現(xiàn)新的藥物作用相關(guān)基因（靶點(diǎn)）。Brown等就正常人與病人的T細(xì)胞標(biāo)本對(duì)表達(dá)的變異與數(shù)千個(gè)遺傳、遺傳流行病和環(huán)境條件的圖像進(jìn)行比較，以確定與二氧化物和汞接觸的關(guān)系。（2）用于基因突變的檢測(cè)及基因組多態(tài)性的分析對(duì)人BRCAⅠ基因外顯子11、CFTR基因、β-地中海貧血、酵母突變菌株間、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測(cè)、耐藥突變點(diǎn)的檢測(cè)等；對(duì)人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等。

（3）研制的毒理芯片的應(yīng)用原理：根據(jù)cDNA微陣列可以測(cè)定基因表達(dá)，反過(guò)來(lái)特定的基因表達(dá)就可以作為被測(cè)試樣品毒性信息的標(biāo)記物。通過(guò)構(gòu)建大量模型化合物的毒理效應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析大量某類化學(xué)物質(zhì)，揭示出遭受特定暴露時(shí)開(kāi)放或關(guān)閉的基因模式。一類毒性終點(diǎn)的基因表達(dá)變化具有其共性的“標(biāo)記”，一旦建立起毒物標(biāo)記庫(kù)，可以在同一模型系統(tǒng)下將未知藥物所引起的基因表達(dá)與庫(kù)中的數(shù)據(jù)相對(duì)比，通過(guò)這種對(duì)比匹配，能獲得未知藥物的毒理作用機(jī)制。（3）研制的毒理芯片的應(yīng)用不同機(jī)制的化合物都有其特定的基因指紋圖譜，如果得到所有藥物的基因指紋，就得到了輪廓或識(shí)別模式，有了這一模式，當(dāng)對(duì)一個(gè)新藥物進(jìn)行測(cè)試時(shí)，通過(guò)微陣列芯片測(cè)定得到基因表現(xiàn)性輪廓，就能預(yù)測(cè)出該藥物的毒理性質(zhì)。

應(yīng)用：研究受檢毒物的毒作用機(jī)制；確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性毒理芯片的局限性毒理芯片僅能用于檢測(cè)在mRNA水平上基因的變化，不能檢測(cè)由該基因翻譯的功能蛋白質(zhì)所發(fā)生的變化；許多藥物是通過(guò)與蛋白質(zhì)的結(jié)合或改變大分子的結(jié)構(gòu)來(lái)表現(xiàn)最初毒性的，而并不是直接誘導(dǎo)基因表達(dá)或使基因表達(dá)發(fā)生改變；對(duì)于多機(jī)制作用藥物的分析，利用基因表達(dá)圖譜則很難描繪出藥物最初的毒性作用；雖然在單一因素下能夠根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)和基因表達(dá)圖譜預(yù)測(cè)出藥物毒性，但如果實(shí)驗(yàn)條件不同則不能肯定其預(yù)測(cè)性。（4）其它應(yīng)用藥物靶標(biāo)篩選藥物抗性的鑒定環(huán)境毒理學(xué)檢測(cè)生態(tài)毒理學(xué)檢測(cè)六、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1.定義

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal）：是指在體內(nèi)基因組中穩(wěn)定地整合有外源基因的遺傳工程動(dòng)物，其外源基因可遺傳給后代。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物集整體、細(xì)胞和分子水平于一體，更能體現(xiàn)生命整體研究的效果。2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)展簡(jiǎn)史：

1974年,Jaenisch等將病毒SV40的DNA注入小鼠的胚泡，首次成功地培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

1982年，Palmiter等用顯微注射法成功地得到了7只轉(zhuǎn)基因小鼠。

此后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)迅速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)方面。

3.

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建（1）目的基因的構(gòu)建首先要構(gòu)建欲研究的目的基因，即“轉(zhuǎn)基因”（transgene）。標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因包括：編碼序列和使之有效表達(dá)的調(diào)控元件，如promoter、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、5’UTR、startcode、codingregion、stopcodeand3’UTR等。（2）目的基因的導(dǎo)入導(dǎo)入基因的不同方式：原核顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎干細(xì)胞植入法

①

原核顯微注射法：主要步驟：準(zhǔn)備假孕動(dòng)物；收集受精卵；用顯微注射的方法將外源基因直接注入受精卵的雄性原核內(nèi)；將注入目的基因的受精卵植入假孕動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使其生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)幼鼠進(jìn)行鑒定

對(duì)幼鼠的鑒定：幼鼠斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交，鑒定外源基因是否整合。建立鼠系，將帶有外源基因的小鼠與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的小鼠交配、傳代后，后代有50％概率帶有整合的基因供實(shí)驗(yàn)用。自小鼠內(nèi)臟提取RNA，與目的基因探針做分子雜交，以鑒定外源基因的表達(dá)和表達(dá)的組織特異性。表達(dá)產(chǎn)物可以測(cè)定活性的，也可直接自血液或組織測(cè)定活性蛋白質(zhì)，常用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫測(cè)定(RIA)等。原核顯微注射法優(yōu)點(diǎn)：任何DNA序列（大至50kb）均可直接導(dǎo)入原核；整合效率高（約25％的新生小鼠攜帶外源基因）；大部分轉(zhuǎn)基因小鼠的所有細(xì)胞包括生殖細(xì)胞都帶有外源基因；操作過(guò)程比較省時(shí)省力

缺點(diǎn)：對(duì)操作人員技術(shù)要求較高；受整合位點(diǎn)的影響：外源基因隨機(jī)整合到宿主染色體的某一位點(diǎn)上，可能破壞內(nèi)源基因序列或激活致癌基因，造成動(dòng)物發(fā)育障礙或死亡。②逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：應(yīng)用重組技術(shù)將目的基因、病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）和包裝序列整合在一起，形成完整的病毒顆粒，再用這樣的病毒去感染受體細(xì)胞就可以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的目的。

優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、不受胚胎發(fā)育階段的影響、轉(zhuǎn)移效率高，幾乎可達(dá)到100％；

缺點(diǎn)：易激活宿主癌細(xì)胞，外源基因片段的長(zhǎng)度受限制，一般不能超過(guò)10kb。③胚胎干細(xì)胞植入法：胚胎干細(xì)胞：人或動(dòng)物的胚胎中存在的一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞特點(diǎn)：體外可以分化形成肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞和神經(jīng)纖維細(xì)胞等各種體細(xì)胞；可以從早期胚胎胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹胚的原始生殖細(xì)胞中分離獲得；體外培養(yǎng)壽命比胎兒細(xì)胞和成體細(xì)胞要長(zhǎng)。胚胎干細(xì)胞是克隆哺乳動(dòng)物供核細(xì)胞最佳來(lái)源胚胎干細(xì)胞植入法步驟：選擇合適的載體，將目的基因與其重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒。(2)重組質(zhì)粒線性化后，用電穿孔、脂質(zhì)體等方法將其轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞中。(3)體外篩選穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細(xì)胞。(4)篩選出的胚胎干細(xì)胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育為一個(gè)完整的胚胎。(5)產(chǎn)出的嵌合體小鼠通過(guò)雜交，最終獲得穩(wěn)定整合外源基因的純合體轉(zhuǎn)基因小鼠。胚胎干細(xì)胞植入法1995年，我國(guó)分離出小鼠胚胎干細(xì)胞；1996年，

Campbell等克隆綿羊所使用的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)系類似于胚胎干細(xì)胞；1999年，Vogel獲得了完全由胚胎干細(xì)胞發(fā)育來(lái)的克隆小鼠；中國(guó)：將人體體細(xì)胞的細(xì)胞核放入去核的兔卵母細(xì)胞，讓融合后的細(xì)胞發(fā)育到胚泡階段，得到胚胎干細(xì)胞？?jī)?yōu)點(diǎn)：囊胚腔易于注射，整合效率高，可達(dá)50％；缺點(diǎn)：建立胚胎干細(xì)胞系比較困難。一般毒性研究模型致突變檢測(cè)模型致癌檢測(cè)模型可發(fā)光轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用與分類（1）一般毒性研究模型金屬硫蛋白(MT)基因的轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠：金屬和某些非金屬的研究。MT轉(zhuǎn)基因小鼠：抗鎘毒性抗性增強(qiáng)；MT基因敲除小鼠：對(duì)鎘、銀、汞、四氯化碳等的毒性敏感性增強(qiáng)（2）致突變檢測(cè)模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可確定靶器官以及對(duì)誘發(fā)的遺傳改變做精細(xì)分析等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是目前研究體內(nèi)基因突變唯一可行而有效的系統(tǒng)。1989年，Gosen等建立第一個(gè)以lacZ基因作為誘變靶基因的轉(zhuǎn)基因突變檢測(cè)模型，并應(yīng)用于體內(nèi)基因突變研究和化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性分析-----所攜帶的靶基因以λ噬菌體為載體趨勢(shì)：制備以質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變檢測(cè)模型

phage(+galoperon)細(xì)菌藍(lán)色

用含乳糖操縱子的噬菌體培育一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，當(dāng)噬菌體在體內(nèi)由于受化學(xué)物的處理而受到損害，不能抄錄正常的半乳糖苷水解酶，這種噬菌體在體外裝配后，其感染細(xì)菌的菌落為無(wú)色。因此根據(jù)藍(lán)色和無(wú)色菌落的多少，來(lái)判斷某些化學(xué)物基因毒性的強(qiáng)弱。以λ噬菌體為載體的轉(zhuǎn)基因突變檢測(cè)模型原理（3）致癌檢測(cè)模型過(guò)量表達(dá)癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型基因敲除動(dòng)物致癌檢測(cè)模型用于生殖毒性研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物①過(guò)量表達(dá)癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型TG，AC小鼠，HK-fos轉(zhuǎn)基因小鼠，ras-H2轉(zhuǎn)基因小鼠，攜帶激活的H-ras原癌基因小鼠，攜帶激活的Pin-1腫瘤基因小鼠等，對(duì)化學(xué)致癌劑敏感性增強(qiáng)很多倍。②基因敲除動(dòng)物致癌檢測(cè)模型用同源重組的方法，將一段DNA整合到目的基因，使該基因不能表達(dá)具有正常功能的蛋白質(zhì)，用這種方法培養(yǎng)的動(dòng)物稱基因敲除動(dòng)物?；蚯贸齽?dòng)物P53(+/-)和正常動(dòng)物P53(+/+)：致癌劑二硝基二甲胺處理，P53(+/-)平均壽命29周，P53(+/+)的平均壽命42周，其腫瘤的發(fā)生與分布也有很大的差異。③用于生殖毒性研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物ZP3基因敲除小鼠、雌激素受體基因或孕酮受體基因敲除小鼠、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因敲除小鼠等。（4）可發(fā)光轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

原理：將熒光素酶基因整合到細(xì)胞，微生物，或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物上，當(dāng)熒光素酶基因表達(dá)時(shí)，在有底物熒光素存在的情況下，會(huì)產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象。利用高靈敏度CCD和軟件系統(tǒng)可對(duì)這些光學(xué)信息進(jìn)行采集和分析，從而獲取生物體內(nèi)的基因表達(dá)、疾病發(fā)展，新藥的藥效等信息。活體成像系統(tǒng)原理

將熒光素酶基因連接于啟動(dòng)子下游，穩(wěn)定整合到細(xì)胞染色體內(nèi)，使熒光素酶得到持續(xù)表達(dá)。體內(nèi)表達(dá)外源注入底物活躍細(xì)胞體內(nèi)發(fā)光全球首例轉(zhuǎn)基因克隆兔研究策略先從一種特殊水母中提取綠色熒光蛋白基因，然后經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)處理，把該基因轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的兔成纖維細(xì)胞中，再挑選出發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞，將其細(xì)胞核移植到成熟的去核兔卵母細(xì)胞中，最終構(gòu)成了轉(zhuǎn)基因胚胎。胚胎經(jīng)過(guò)手術(shù)，移植入“代孕兔”體內(nèi)。經(jīng)過(guò)30天的發(fā)育，剖腹產(chǎn)獲得轉(zhuǎn)基因克隆兔。特點(diǎn)：為研究人員提供觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生的生物學(xué)現(xiàn)象的窗口，使在分子水平上實(shí)時(shí)跟蹤生物學(xué)過(guò)程成為可能。應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于多個(gè)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，如藥理,藥效,藥物代謝，安全性/毒性評(píng)價(jià)，給藥方式等。農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域：遺傳育種、人類疾病模型體外試驗(yàn)在藥理學(xué)和毒理學(xué)中的應(yīng)用

體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法在藥理學(xué)與毒理學(xué)中的應(yīng)用

體外基因重組技術(shù)在藥理學(xué)中的應(yīng)用體內(nèi)試驗(yàn)（invivotest）：又叫整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，利用整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供的資料，判斷外源物及其制品和混合物對(duì)健康是否有損害作用。體外試驗(yàn)（invitrotest）：利用體外的方法，如體外細(xì)胞培養(yǎng)、亞細(xì)胞組分、離體臟器灌流等，研究外源化合物的藥理與毒理機(jī)制。(一)體外試驗(yàn)的目的和分類目的確定藥/毒理學(xué)性質(zhì)確定安全接觸限量探究藥/毒理學(xué)機(jī)制（二）基本原理藥/毒理學(xué)效應(yīng)是外源物和/或其活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位（如酶）作用的結(jié)果將敏感細(xì)胞或細(xì)胞的分子靶部位，在體外條件下，維持其正常功能，觀察外源物對(duì)靶部位的作用及靶部位對(duì)外源物的反應(yīng)。（三）體外試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)能控制環(huán)境因素可同時(shí)和/或反復(fù)多次采樣可排除體內(nèi)各系統(tǒng)相互干擾較為快速、簡(jiǎn)便減少整體動(dòng)物的使用，經(jīng)濟(jì)可利用人體細(xì)胞缺點(diǎn)體外到體內(nèi)外推的問(wèn)題：如體外濃度與體內(nèi)劑量間的換算；缺乏毒理學(xué)反應(yīng)的調(diào)控因素：不同細(xì)胞間的相互影響、細(xì)胞與組織的修復(fù)等；難以預(yù)測(cè)慢性毒性：缺乏體外試驗(yàn)的理論依據(jù)，長(zhǎng)期生理狀態(tài)難以維持。（四）體外試驗(yàn)系統(tǒng)臟器灌流：肝臟灌流、腸灌流臟器切片：肝、腎、腦、心等原代細(xì)胞培養(yǎng)：肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞傳代細(xì)胞（細(xì)胞系）培養(yǎng)：腎細(xì)胞、胚胎細(xì)胞組織勻漿：對(duì)細(xì)胞酶系統(tǒng)的毒理作用研究亞細(xì)胞組分：微粒體、線粒體（五）體外細(xì)胞培養(yǎng)1.常用細(xì)胞（系）：

細(xì)胞系（CellLine），原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功,細(xì)胞系可泛指一般可能傳代的細(xì)胞。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。細(xì)胞株（CellStrain），通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物，細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。各種物種的成纖維細(xì)胞系：如V79中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）：由Puck在1957年建立的細(xì)胞株HeLa細(xì)胞系：1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成其它細(xì)胞：淋巴（母）細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。2.培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定目的觀察培養(yǎng)有無(wú)變化，以決定是否終止培養(yǎng)觀察培養(yǎng)條件變化對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響鑒定內(nèi)容污染鑒定：真菌、細(xì)菌或支原體污染生存鑒定：臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)、酶漏檢試驗(yàn)、MTT法測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力細(xì)胞性質(zhì)：形態(tài)、生長(zhǎng)特性、染色體等形態(tài)學(xué)成纖維樣細(xì)胞單層培養(yǎng)時(shí)，長(zhǎng)度＞2倍寬度上皮樣細(xì)胞多角形淋巴樣細(xì)胞圓形生長(zhǎng)特性克隆效率測(cè)定由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的克隆接種效率克隆數(shù)目/植入細(xì)胞數(shù)目×100％

其他染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目、DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量測(cè)定3.應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞類型的選擇：一般藥/毒理研究應(yīng)用細(xì)胞系，但代謝機(jī)理研究多不用細(xì)胞系，P450酶活性代謝活化：加肝S9，與原代細(xì)胞混合培養(yǎng)等受試物給與：有機(jī)溶劑濃度應(yīng)低于0.1％設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組：如環(huán)磷酰胺

毒性指標(biāo)的選擇：IC50、細(xì)胞膜損傷、大分子合成與降解的速度、代謝能力、形態(tài)學(xué)觀察IC50：經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長(zhǎng)速率減至對(duì)照組一半時(shí)所需受試物的濃度。生長(zhǎng)速率可用蛋白總濃度來(lái)表示

細(xì)胞膜損傷：臺(tái)盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放、鈣泵的變化等指標(biāo)大分子合成與降解的改變：選用[14C]亮氨酸蛋白試驗(yàn)和[3H]尿嘧啶摻入RNA試驗(yàn)等指標(biāo)代謝能力：可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)，還可選擇毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，了解受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。4.細(xì)胞培養(yǎng)在毒理學(xué)中的應(yīng)用一般毒性急性細(xì)胞毒性器官特異性毒性毒作用機(jī)理生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成遺傳毒性程序外DNA合成測(cè)定繁殖毒性比較毒性、光敏毒性本身有毒的化合物：

核苷酸同位素標(biāo)記法b.

本身無(wú)毒，代謝后有毒的化合物：

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入肝細(xì)胞抽提液以幫助代謝毒物；或用少量原代細(xì)胞與被檢的傳代細(xì)胞混合培養(yǎng)，由引入的原代細(xì)胞提供代謝酶。如：化學(xué)物的基因毒性研究

c.建立細(xì)胞株：能合成某種單一的酶，有針對(duì)性地研究毒物的毒性作用。把轉(zhuǎn)錄某種代謝酶的DNA連接到基因載體上(多為質(zhì)?；虿《?，通過(guò)一定的方式引入到體外培養(yǎng)細(xì)胞，利用細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)這種特異的酶。

人CYP1A1，2A6，2E1，3A4等，已成功引入人淋巴樣細(xì)胞株、鼠胎盤細(xì)胞株、倉(cāng)鼠肝癌細(xì)胞株等，靈敏度高。如:硝基二甲基胺的毒性檢測(cè),2A6(+)細(xì)胞≧500×2A6(-)細(xì)胞株（敏感性）和2E1（＋）細(xì)胞株（500倍）硝基二甲基胺要代謝以后才能顯示毒性；2A6是能將硝基二甲基胺轉(zhuǎn)化為毒性代謝物的代謝