地中海貧血電泳及結(jié)果分析

地中海貧血電泳及結(jié)果分析1、本實驗目的：

學習與掌握DNA電泳的技術(shù)方法，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測和凝膠成像系統(tǒng)判斷α地貧的基因類型。2、實驗原理：

電泳概念及種類影響瓊脂糖電泳遷移的主要因素原理DNA分子是兩性電解質(zhì)，在高于其等電點的溶液（pH8.0~pH8.3）中，堿基幾乎不解離，磷酸基團全部解離，DNA分子帶負電荷，在電場中向正極移動。電泳時DNA分子顆粒在電場中通過凝膠介質(zhì)而泳動。顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快，反之則泳動速度慢。瓊脂糖是從海藻中提取的、由D-和L-半乳糖殘基通過α和β糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物。瓊脂糖鏈形成螺旋纖維，然后再聚合成半徑為20-30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。

干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻?，室溫冷卻、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。原理瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。凝膠濃度

DNA分子大小

DNA分子的構(gòu)象緩沖液電泳電壓主要檢測：分子量，含量及有無影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移率的因素瓊脂糖濃度

相同大小的線狀DNA片斷在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移率不同.

瓊脂糖濃度(%)分離范圍（kb）

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-4

2.0

0.1-3DNA分子的大小雙鏈DNA分子在凝膠中遷移的速率與其堿基數(shù)的常用對數(shù)成反比。分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通過凝膠孔徑的效率低于較小的分子。DNA的構(gòu)象DNA的構(gòu)象不同構(gòu)象DNA分子在電場中移動的距離不同。具有相同分子量的線狀、開環(huán)狀和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度不同。遷移速度：超螺旋的DNA>線狀DNA>開環(huán)DNA。

電泳電壓低壓條件下，線狀DNA在瓊脂糖凝膠上泳動速度和電壓成正比。隨著電壓升高，高分子量的DNA片段泳動速度和電壓不成正比關(guān)系，分辯率下降了，因此為了得到良好的分離效果，電場電壓不要超過5V/CM。

緩沖液DNA的泳動受緩沖液的組成和離子強度的影響。最常用的緩沖也是TAE(Tris-醋酸-EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。指示劑常用的電泳上樣緩沖液含溴酚藍，有的還含有二甲苯青，這些指示劑可以指示電泳的速度，也可以利用其遷移率大致估計DNA的分子量，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。染色溴化乙淀（EB）是核酸的染色劑，能插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物，EB在紫外線照射下的發(fā)射熒光。熒光的強度與DNA的含量成正比，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置及估計出待測樣品的濃度。EB是強致癌劑。染色吖啶橙（AO）是一種熒光色素，可與核酸親和的熒光活體染料。熒光顯微鏡下核呈綠色，細胞質(zhì)呈黃色。吖啶橙AO常與溴化乙啶EB合用雙染.吖啶橙染液有毒，操作時要戴手套，需避光。電泳操作步驟(整個過程要求帶一次性手套)1、膠槽準備

①取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽中;②將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和板面有1mm的間隙;③將膠槽放在調(diào)整好的水平臺上。

2、凝膠準備

用1×TAE配制1％瓊脂糖凝膠。①稱0.15g瓊脂糖置三角瓶中，加15ml1×TAE;②微波爐加熱大約1分鐘，熔化瓊脂糖;③熔化的瓊脂糖自然冷卻到60～70℃時，加入EB5μl(0.5mg/ml

)，并輕輕混勻。

3、鋪膠：將冷卻致60℃的凝膠倒入準備好的膠槽內(nèi)，凝膠厚度3～5mm,室溫下靜置半小時左右，凝膠固化。4、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝膠的膠板置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負極，向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可。5、原梳齒處(樣品孔)即被緩沖液充滿，如發(fā)現(xiàn)有氣泡，應設(shè)法去除。

6、樣品準備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/10的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻。

7、上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。9、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。8、蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳

開始電泳前，再次確認凝膠樣品孔處于電場的負極。電泳條件：電壓5v/cm；時間40-60分鐘左右10、電泳結(jié)果分析：

①紫外檢測儀直接觀察電源條帶②攝影記錄

電泳結(jié)果分析電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。

α地貧電泳結(jié)果分析電泳條