天門冬氨酸生產(chǎn)工藝小總

天冬氨酸生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展一、 天冬氨酸簡(jiǎn)介天冬氨酸（Asparticacid）又稱氨基丁二酸，是構(gòu)成機(jī)體蛋白質(zhì)的主要氨基酸之一。結(jié)構(gòu)式為：HOOC-CH2-CH（NH2）-COOH，分子量133.10。它有兩種旋光異構(gòu)體：D型和L型。通常所說(shuō)的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物，為無(wú)色單斜棱柱形結(jié)品，溶于水，微溶于75%（w/w）乙醇，不溶于乙醚，熔點(diǎn)278°C?280°C；L型為無(wú)色菱形片狀結(jié)品，溶于水，微溶于醇，熔點(diǎn)269°C?271°C；D型溶于水、鹽酸，不溶于乙醇及乙醚，熔點(diǎn)251C。二、 合成方法2.1化學(xué)合成法化學(xué)法主要用于生產(chǎn)天冬氨酸的外消旋體DL-天冬氨酸。順丁烯二酸酐和過(guò)量氨水與NH￡反應(yīng)，反應(yīng)在一間歇反應(yīng)釜中，于140C、0.4MPa下反應(yīng)2.5h。將得到的混合物冷卻至70C后用鹽酸酸化至pH2.5,再冷卻全室溫，此時(shí)天冬氨酸沉淀析出，將沉淀過(guò)濾，4C下水洗后得到產(chǎn)品，產(chǎn)率為55%。成都有機(jī)化學(xué)研究所的鄧潤(rùn)華等采用微波法合成的收率為61.4%。該方法采用苯亞甲氨基乙酸乙酯為原料，在相轉(zhuǎn)移催化劑（TEBA）催化下進(jìn)行鹵化反應(yīng)，經(jīng)水解生成天冬氨酸外消旋體。2002年，浙江大學(xué)的邢亞軍等在一鈦材高壓釜中，對(duì)順丁烯二酸酐）進(jìn)行氨化反應(yīng)合成7DL-天冬氨酸。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)原有合成工藝作出了改進(jìn)，使產(chǎn)品收率提高到70%以上，并且對(duì)產(chǎn)品的分離提純采用順丁烯二酸（馬來(lái)酸）代替鹽酸進(jìn)行酸化結(jié)品從而提高了反應(yīng)物的利用和減少反應(yīng)剩余物的污染。2003年天津大學(xué)的王亞權(quán)等提出了一種簡(jiǎn)便的、不使用任何催化劑的化學(xué)合成法。實(shí)驗(yàn)在聚四氟襯里的250ml高壓釜中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將32.5g順丁烯二酸酐（分析純）溶于70ml水中，加入氨水（分析純）至pH8,充1MPa氮?dú)?，然后在電磁攪拌下加熱?53K，反應(yīng)6出反應(yīng)后冷卻全室溫，過(guò)濾后得無(wú)色品體，收率63.1%，熔點(diǎn)338C。產(chǎn)物的紅外光譜與DL-天冬氨酸的標(biāo)準(zhǔn)譜圖吻合，容量分析表明天冬氨酸含量N98%。2.2生物酶法生物酶法IC法（固定化細(xì)胞法或固定化酶法）1973年，ChibataI等將大腸桿菌中提純的天冬氨酸酶，包埋在交聯(lián)聚丙烯酰胺中制成固定化酶，富馬酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成L-天冬氨酸。1974年，ChibataI等進(jìn)一步將高天門冬氨酸酶活力的大腸桿菌直接用聚丙烯酰胺包埋，制成固定化細(xì)胞。提高了酶的穩(wěn)定性，避免了酶提取的復(fù)雜過(guò)程，首次實(shí)現(xiàn)了由富馬酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%，開創(chuàng)了細(xì)胞固定化應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。1979年，SatoT等對(duì)固定化細(xì)胞的方法進(jìn)行了改進(jìn)，用天然產(chǎn)物k-角叉菜膠代替聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌細(xì)胞，并用戊二醛、戊二醛及環(huán)己二胺處理固定化細(xì)胞，以可溶性天冬氨酸酶為對(duì)照，研究了這三種固定化細(xì)胞中酶的性質(zhì)。三種固定化細(xì)胞的酶促反應(yīng)的最適pH為9,而可溶性天冬氨酸酶的最適反應(yīng)pH為9.5。固定化酶的最適溫度比可溶性天冬氨酸酶高5C?10C。固定化細(xì)胞的表觀Km值大約為可溶性天門冬氨酸酶的Km值的5倍。細(xì)胞經(jīng)固定化后，熱穩(wěn)定性得到提高。固定化細(xì)胞柱在PH8.5時(shí)比在天冬氨酸酶反應(yīng)最適pH下操作穩(wěn)定性高。1981年?1983年居乃琥等利用大腸桿菌菌株，制備固定化大腸桿菌細(xì)胞，用于連續(xù)生產(chǎn)天冬氨酸，小試每g濕細(xì)胞的天冬氨酸的產(chǎn)量最高可達(dá)1007g（30天）。中試每g濕細(xì)胞的天冬氨酸產(chǎn)量為722g（25天）。該法所用的戊二醛的濃度和添加量，比一般方法的低。由于戊二醛用量少，交聯(lián)不充分，所以固定化細(xì)胞酶活力的回收率高，成本低，但穩(wěn)定性較差，使用壽命短，所以要適當(dāng)增加戊二醛的用量。1995年胡永紅，歐陽(yáng)平凱建立了固定化細(xì)胞分離L一蘋果酸生產(chǎn)中殘留富馬酸并將其轉(zhuǎn)化成L-天門冬氨酸的新方法。對(duì)生成L-天門冬氨酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)L-蘋果酸反應(yīng)液pH調(diào)至8~9,L-天門冬氨酸添加量為6-8g/L,碳酸銨加量為15-20g/L,Mg2+、M?、Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子加量為1mmol/L時(shí)，固定化細(xì)胞可將L一蘋果酸反應(yīng)液中殘留的20%左右的富馬酸幾乎全部轉(zhuǎn)化成L-天門冬氨酸，且L一蘋果酸含量的損失小于5%。1996年張波采用三種不同發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)不同發(fā)酵時(shí)間取樣測(cè)定酶活（EA）、pH、生物量（Biomass），確定選用培養(yǎng)基A；經(jīng)不同底物濃度、不同金屬離子對(duì)固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響的實(shí)驗(yàn)，確定使用較高濃度底物及含Mg2+的底物為佳，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得固定化細(xì)胞的使用壽命為3個(gè)月，即3個(gè)月之內(nèi)能保持轉(zhuǎn)化率在85%以上，固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化時(shí)間為3.5h。1997年石屹峰等［21］設(shè)計(jì)了用于固定游離細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的反沖式膜反應(yīng)器（圖1），利用膜將游離細(xì)胞阻擋于反應(yīng)器內(nèi)，同樣達(dá)到固定化目的而又不損傷細(xì)胞（酶）。菌種采用研究者自己選育的含高活力天冬氨酸酶的EscherichiacoliSF-D4,培養(yǎng)基為1%反丁烯二酸胺，1%玉米漿,0.7%蛋白胨,0.1%KHPO,0.5%（NH）SO,0.02%MgSO。pH7.2,37°C,搖床培養(yǎng)24h。細(xì)胞離24 42,?4 4心10,000r/min、10min收集,用生理鹽水洗2次。選擇0.22Lm微濾膜，最佳細(xì)胞濃度為35mg/mL。國(guó)］攪件反沖式膜反應(yīng)器Fig.ISchemari-cdiagramofmembraTiereaclorinbirredbackcpeTirrmnI-底凱2-蒞3-調(diào)節(jié)間4-過(guò)?慮臆反應(yīng)密f-假沌腮7-愜力攜打展-恒耕槽患-酶門。-產(chǎn)別張今等圍繞天冬氨酸酶的活性部位、末端缺失突變、蛋白質(zhì)工程菌的固定化等方面進(jìn)行了研究。將突變菌株用瓊脂凝膠包埋法進(jìn)行固定，固定菌量為95%,表觀酶活力為82000單位，半衰期184d。實(shí)驗(yàn)表明，1kg固定化細(xì)胞，每24h約得L-天冬氨酸30kg，日本三菱石化公司已用黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)發(fā)酵法生產(chǎn)L-天門冬氨酸。以往常用的細(xì)菌是大腸桿菌(E.coli),因它的細(xì)胞壁脆弱，要循環(huán)使用必須將菌固定化于載體上，而該公司所用黃色短桿菌有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，故無(wú)需用昂貴的固定化方法，經(jīng)離心分離反復(fù)可供反應(yīng)使用。所以，用這種制造方法生產(chǎn)成本下降。FWC法(游離細(xì)胞法或游離酶法)1996年，南京化工大學(xué)徐虹等使用發(fā)酵培養(yǎng)基：富馬酸2%，，玉米漿4%,KHPO;0.2%,MgSO,0.025%,用氨水調(diào)節(jié)pH至7.2~7.5。培養(yǎng)溫度為37C，培養(yǎng)時(shí)間為426h左右。以大腸桿菌培養(yǎng)液作酶源，采用游離酶法由富馬酸轉(zhuǎn)氨生成天冬氨酸。取培養(yǎng)26h左右的培養(yǎng)液，37°C酶反應(yīng)6d,可轉(zhuǎn)化富馬酸9kg/L。2000年，王雪根、徐虹等又實(shí)現(xiàn)了游離整體細(xì)胞法工業(yè)化生產(chǎn)L-天冬氨酸，發(fā)酵培養(yǎng)基:富馬酸銨0.4%，富馬酸鈉2.0%,蛋白胨0.9%，牛肉膏0.4%，玉米漿1.4%,KH2PO40.05%,MgSO4#7H2O0.05%泡敵0.01%;pH7.0~7.5。發(fā)酵工藝：在搖床上培養(yǎng)5-10L種子,接種于800L氣升式發(fā)酵罐。發(fā)酵條件:初始pH6.5-7.0,風(fēng)量0.6VVM，溫度37C，裝液量500-550L。L-天冬氨酸的生產(chǎn)流程見下圖。游離整體細(xì)胞可以在較短的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為較多的富馬酸，且轉(zhuǎn)化較為徹底，轉(zhuǎn)化率平均在99%以上，有的接近l00%。800L^?tf(氣升式〉 FWC反應(yīng)踢 產(chǎn)物溶 脫色抽 At t I搖瓶種子 底麟群液 干燥斜瓦神子 反丁烯二酸 成品圖I游離整體細(xì)胞法生產(chǎn)L-天冬氮酸的工藝流程2003年北京化工大學(xué)唐芳等利用較為便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作為氮源，用葡萄糖部分代替富馬酸作為復(fù)合碳源，培養(yǎng)產(chǎn)天冬氨酸酶的大腸桿菌。結(jié)果表明，改變培養(yǎng)基配比后，對(duì)菌體的總體酶活力(即對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力)影響不大，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上，通過(guò)上罐發(fā)酵初步估算可以節(jié)約培養(yǎng)基碳氮源成本大約60%2.3生物拆分法生物拆分法主要用來(lái)合成D-天冬氨酸利用L-Asp-P-脫羧酶進(jìn)行拆分自然界中含高活性L-Asp-P-脫羧酶的微生物較多。該酶能專一催化L-Asp脫除。位羧基生成L-丙氨酸(L-Ala)，因此可以利用該酶把DL-Asp中的L-Asp轉(zhuǎn)化成L-Ala，而獲得D-Asp。利用L-Asp-p-脫羧酶進(jìn)行的拆分是目前研究較為成熟的一種方法。2008年韓銘海等提出了一種利用L-天冬氨酸-P-脫羧酶生物轉(zhuǎn)化拆分DL-天冬氨酸得到D-天冬氨酸的方法。當(dāng)牛肉膏濃度為0.2%、玉米漿為1.0%、蛋白胨為1.0%時(shí)，發(fā)酵液酶活力可以達(dá)到最高。轉(zhuǎn)化過(guò)程最適pH值為6?7,轉(zhuǎn)化過(guò)程最適溫度50C，濃度6.0%以上的丙氨酸能顯著提高轉(zhuǎn)化過(guò)程中酶的熱穩(wěn)定性。利用D-天冬氨酸和L-丙氨酸的等電點(diǎn)的差異來(lái)分離提取D-