第四章 高效液相色譜

高效液相色譜法：

特指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。它在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。第四章高效液相色譜分析法HPLC

（HighPertormanceLiquidChromatography，）§4-1高效液相色譜法的特點(diǎn)

一、高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高壓、高速、高速、高效、高靈敏度。高壓：是HPLC一個(gè)突出的特點(diǎn)，供液壓力和進(jìn)樣壓力可達(dá)

150-350×105Pa高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測器—10-11g。二、液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動相，而液體和氣體的性質(zhì)不相同；此外，液相色譜所用的儀器設(shè)備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：1、應(yīng)用范圍不同

氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70~80%。2、液相色譜能完成難度較高的分離工作①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。②液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜并不可能。

③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。3、由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)對柱效的影響較大；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。4、液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。

綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途！1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置三、高效液相色譜儀流程圖四、HPLC的實(shí)際應(yīng)用1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分離極復(fù)雜體系中的痕量組分。正相色譜分離有機(jī)溶劑中的物質(zhì)反相色譜分離水溶液中的物質(zhì)----生化物質(zhì)。2、用離子型固定相建立的離子交換色譜和離子對色譜法分析離子型體的含量。（蛋白質(zhì)、氨基酸、常見陰陽離子等）3、利用多孔凝膠固定相建立空間排阻色譜法可分離高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分離具有手性的化合物?！?-2影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素基礎(chǔ)理論熱力學(xué)理論：塔板理論——平衡理論動力學(xué)理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論1.二、速率理論（與GC對比）使用細(xì)粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。減小B值，提高柱效的措施：使用分子量較大的載氣，增加載氣流速，降低溫度，增大柱壓。氣相色譜采用粒度小的填充物和相對分子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使Cg減小，提高柱效。一般采用表面積較大的載體來降低液膜厚度。應(yīng)控制適宜的柱溫。2.高效液相色譜的速率方程

氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì),影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。(2)

縱向擴(kuò)散項(xiàng)Hb——可忽略同于氣相色譜(1)渦流擴(kuò)散項(xiàng)A分子在液相中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣相中小4~5數(shù)量級。

傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cu）包含固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Hs）和流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Hm）(1)、固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)(3)傳質(zhì)阻力項(xiàng)

Cu減小Hs的措施：使用薄的固定相層，擴(kuò)散系數(shù)大的固定液，減小流動相的流速。(2)、流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Hm）流動的流動相中的傳質(zhì)滯留的流動相中的傳質(zhì)使用細(xì)粒的固定相，粒度規(guī)則，并填充均勻，固定相孔徑大，可減小Hm，提高柱效。

高效液相色譜速率理論公式可寫為:結(jié)論(提高柱效的措施)：提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性和減小粒度以加快傳質(zhì)速率；選用低黏度的流動相，或適當(dāng)提高柱溫以降低流動相黏度，都有利于提高傳質(zhì)速率；降低流動相流速可降低傳質(zhì)阻力相的影響，但又會使縱向擴(kuò)散增加并延長分析時(shí)間。圖３-１3.范氏方程曲線（H-u曲線）問題：氣相色譜與液相色譜的H-u曲線有何不同，是什么原因造成的？氣相色譜的H-u曲線，塔板高度H隨u呈雙曲線變化，曲線有一最低點(diǎn)，此時(shí)塔板高度最小，柱效最高，流速最佳。液相色譜的H-u曲線通常是流速u降低，塔板高度H總是降低，流動相流速增大，柱效平緩降低。出現(xiàn)這種情況主要是由于液相的流動相為液體，其擴(kuò)散系數(shù)很小，通常比氣體擴(kuò)散系數(shù)小4-5個(gè)數(shù)量級，所以分子擴(kuò)散項(xiàng)在低流速時(shí)也不起多大作用，未出現(xiàn)板高增加現(xiàn)象。在高流速時(shí)，固定相和流動相的傳質(zhì)都很快，傳質(zhì)阻力項(xiàng)小，故隨H-u曲線上升緩慢。柱外擴(kuò)展（柱外效應(yīng)）色譜柱外各種因素引起的峰擴(kuò)展。

(1)柱前峰展寬主要由進(jìn)樣引起的：進(jìn)樣器的死體積和進(jìn)樣時(shí)液流擾動引起的擴(kuò)散造成了色譜峰的不對稱和展寬。解決措施：將試樣直接注入色譜柱頂端填料上的中心點(diǎn)，或注入到填料中心之內(nèi)1-2mm。

(2)柱后峰展寬主要由連接管、檢測器流通池體積引起。解決措施：減小連接管的體積、檢測器的死體積4.影響高效液相色譜擴(kuò)展的其它因素一、液液分配色譜及化學(xué)健合相色譜法（LLC）

(liquid-liquidpartitionchromatography,chemicalbondedphasechromatography二、液固吸附色譜法（LSAC）

(liquid-solidadsorptionchromatography)三、離子對色譜法（IC）(ionpairchromatography)四、離子交換色譜法(IEC)(ion-exchangechromatography)五、離子色譜法(IC)(ionchromatography,)六、空間排阻色譜法（SEC）（stericexclusionchromatography七、親和色譜法(AC)§4-3高效液相色譜法的主要類型及其分離原理一、分配色譜原理：

根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過程。2.流動相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。正相分配色譜：流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離。反相分配色譜：流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比k增加。

在HPLC分析中，有時(shí)要在流動相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，為什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。3.固定相常用的固定液只有幾種，按極性由高到低為：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。

1）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。2）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。

這種固定相分離機(jī)理既不是簡單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機(jī)理為主。通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動相時(shí)，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。二、液-固色譜分離原理：根據(jù)各物質(zhì)的吸附作用不同進(jìn)行分離。分離對象：相對分子量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。缺點(diǎn)：由于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象。三、離子交換色譜

既適于無機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：

對陽離子，滯留順序?yàn)椋篎e3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

對陰離子，滯留順序?yàn)椋簷幟仕岣?SO42-,C2O4,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

2.固定相按離子交換劑類型分四種：

按固定相制作方法可分為：多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹脂；離子交換鍵合型。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團(tuán)多——交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+樹脂薄層(1-2m)多孔型=惰性核+硅膠微球+樹脂薄層?？朔硕嗫仔碗x子交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷。3）離子交換鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆3.流動相離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度。pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。離子強(qiáng)度I：對保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對—R+或—R-的競爭能力，使組分保留值減小。通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因?yàn)椴煌镔|(zhì)對交換劑的親和能力不同。有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子L：當(dāng)大量L、組分X隨流動相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換：RM-L+XRM-X+L該法用于分離各種氨基酸或堿類。四、離子色譜

離子色譜(IC)分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測器檢測。

存在的問題：由于流動相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高2個(gè)數(shù)量級，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信號。

抑制型離子色譜：在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。

例如：分析陽離子時(shí)，以無機(jī)酸為流動相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：

R+—OH+HCl(流動相)——R+—Cl

-+H2O

R+—OH+MCl(待測物)——R+—Cl

-+M+OH-

可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。

不足：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度。非抑制型離子色譜：沒有抑制柱，用電導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液)作流動相。思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子時(shí)，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？五、離子對色譜法（IPC）

分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。

1.原理：將與待測物離子A電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）加入到流動相中，使待測離子A與對離子B形成離子對AB，該AB離子對的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加入與待測離子A-有相反電荷的離子B+：

由于離子對AB具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測離子A1，A2，A3……..因與B離子間的成對能力不同，而形成不同疏水性的離子對，使得各待測物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達(dá)到分離的目的。思考：有一強(qiáng)極性有機(jī)酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來形成離子對？六、尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜又稱凝膠(滲透)色譜，主要用于大分子的分離。1.分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測物分子按分子大小(分子量大小)先后從柱中流出。2.固定相3.流動相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠)、粘度小(增加擴(kuò)散速度)。

七、親合色譜主要用于生物大分子與固定相之間的特異親合力進(jìn)行選擇性分離及純化的方法。分離原理：于載體表面先鍵合具有一般反應(yīng)性能的環(huán)氧或聯(lián)氨（稱為間隔臂），然后再連接上配基，如酶、抗原或激素。當(dāng)含有復(fù)雜混合試樣的流動相流經(jīng)這種經(jīng)固定化的配基時(shí)，其中具有親合力特性的生物大分子與配基相互作用而被保留，無此作用的則被洗出；隨后，改變流動相pH或組成，再將被保留的大分子組分以純品的形式洗脫出來。特點(diǎn)：選擇性過濾、純化效果好。該類固定相常用的載體有下列幾類：①表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為3040m的實(shí)心玻璃球和厚度約為12m的多孔性外層所組成。由于比表面積較小，試樣容量低，需要高靈敏度的檢測器。

②全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑3050m的多孔型顆粒。③全多孔型微粒載體，由nm級的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為510m。由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。1.液-液分配、化學(xué)鍵合及離子對分離色譜的固定相§4-4液相色譜法固定相微孔型大孔型薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆

2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

3.離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂（2）離子交換鍵合固定相樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂

(強(qiáng)酸性、弱酸性)（2）陰離子交換樹脂

(強(qiáng)堿性、弱堿性)

4.空間排阻分離固定相（1）軟性凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半剛性凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）剛性凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。

1.流動相特性

（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）流動相的極性小于固定相的極性，為正相色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）流動相的極性大于固定液的極性，為反相色譜法，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。§4-5液相色譜法流動相2.流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、四氯化碳、己烷等

采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。3.流動相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)4.選擇流動相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題

（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。

（4）溶劑的黏度小些為好。

（5）流動相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動相不應(yīng)有紫外吸收。

HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;

進(jìn)樣系統(tǒng);

分離系統(tǒng);

檢測系統(tǒng);

此外還配有梯度淋洗、自動進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。其工作過程如圖所示?！?-6高效液相色譜儀自學(xué)提綱1、高效液相色譜儀有哪幾部分構(gòu)成？2、何謂梯度洗脫？適用于哪些樣品的分析？與程序升溫有什么不同？3、高效液相色譜儀的檢測器有哪些？各自的特點(diǎn)和使用范圍如何？有何缺點(diǎn)？通用型檢測器有哪些？選擇型檢測器有哪些？4、高效液相色譜儀使用的流動相為什么要預(yù)先脫氣？常用的脫氣方法有哪些？1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔很約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（氣泡會影響檢測）。3）高壓泵：對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。

恒壓泵(類似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動時(shí)，會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。

恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵(見下圖。每分鐘往復(fù)25~100次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈動阻尼器)。馬達(dá)往復(fù)式拉動密封溶劑球閥脈動阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖4）梯度淋洗裝置：在分離過程中逐漸改變流動相組成的裝置。如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個(gè)或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。2.進(jìn)樣系統(tǒng)與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。動畫3.色譜柱1）對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為10~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：平衡密度法：非平衡密度法：

填充方法：填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進(jìn)入(影響填充均勻性)。常用分離柱4.檢測器液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測器等。1）紫外檢測器其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10L。

HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測器應(yīng)用很廣。

在選擇測量波長時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液波長可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖2）熒光檢測器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個(gè)數(shù)量級。3）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。4）安培檢測器(amperedetector)

由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5L）組成。該檢測器是利用待測物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。采用安培檢測器時(shí)，流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有電活性的物質(zhì)。接參比電極和對電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)5）電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜的檢測。其原理是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時(shí)，該檢測器不夠靈敏。其它檢測器還包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、極譜等。1、選擇色譜方法的主要依據(jù)有哪些？2、根據(jù)相對分子質(zhì)量如何選擇色譜法？3、根據(jù)溶解性如何選擇色譜法？4、根據(jù)分子結(jié)構(gòu)如何選擇色譜法？§4-7

液相色譜分離方法的選擇

要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。一、相對分子質(zhì)量

對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下）、揮發(fā)性比較好、加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。二、根據(jù)溶解性選擇水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液-液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。三、根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液-液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液-固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液-液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。書中所列的各類化合物使用的是什么色譜法，何種色譜柱及檢測器？§4-8

HPLC的應(yīng)用

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測器：示差折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。2.稠環(huán)芳烴的分析——稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水~100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器§4-9制備型液相色譜儀

preparativeliquidchromatography

獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。半制備柱(內(nèi)徑8mm，長度15~30cm)，一次制備量０.1~１mg。1.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）

對分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量；對制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量；超載：進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。2.液相制備色譜的方法收集組分時(shí)，通常有以下情況：（1）可獲得良好分離，主峰使用制備柱，超載提高效率；（2）兩主成分之間的小組分；超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備。3.制備型液相色譜儀

制備型液相色譜儀：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長50cm。一、高效毛細(xì)管電泳基本原理電泳：電解質(zhì)溶液中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。

毛細(xì)管電泳：以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)試樣中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離、分析物質(zhì)的一類液相技術(shù)，是經(jīng)典電泳和現(xiàn)代微柱分離的結(jié)合?！?-10高效毛細(xì)管電泳2.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。1.經(jīng)典電泳分離法的不足

所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。3.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電滲流：石英毛細(xì)管在pH>3時(shí),內(nèi)壁帶負(fù)電荷與接觸的緩沖溶液形成雙電層，在高電場的作用下，雙電層中的水合陽離子層引起溶液在毛細(xì)管內(nèi)整體向負(fù)極方向流動而形成電電滲流。速度V電滲流。4.分離過程電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反，V電滲流>V電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。5.分離類型(1)毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）

最普遍、最基本的一種分離模式。(2)毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）

將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測定蛋白質(zhì)、DNA等。

在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。由于電泳流和電滲流的方向相反，且V電滲流>V電泳，則帶負(fù)電的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長。用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。(3)毛細(xì)管膠束電動色譜（MECC）(4)毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）(5)毛細(xì)管等速電泳（CITP）(6)毛細(xì)管電滲色譜（CEC）二、主要特點(diǎn)和應(yīng)用高分辨率：理論n高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊；高靈敏度：可檢測出低至10-21

mol/L濃度的物質(zhì)；高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19

種陽離子；4分鐘可分離10種蛋白質(zhì)；試樣用量少：僅需幾nL（10-9

L）的試樣；操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動液。不足之處：進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對較窄。分析陰離子時(shí)，由陰極進(jìn)樣，在陽極檢測。但電滲流方向與陰離子受電場力作用移動方向相反，出峰時(shí)間較長。三、儀器設(shè)置一、紙層析和薄層層析分離過程§4-11紙層析和薄層層析法

紙層析和薄層層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動力源。將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點(diǎn)時(shí)，帶動試樣向上運(yùn)動。紙層析和薄層層析流動相的移動是依靠毛細(xì)作用用薄層色譜法分離混合離子，若混合離子的極性大小順序是A＜B＜C，用極性有機(jī)溶劑作展開劑，其比移值Rf值大小順序?yàn)椋ǎ?。A＜B＜C二、操作技術(shù)1.層析紙和層析板

特制的色層濾紙。按需要剪裁成長條形（或筒型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200～250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。2.展開劑

由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時(shí)，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。3.點(diǎn)樣

用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm。

4.顯色、檢測

有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。三、特點(diǎn)及應(yīng)用1、平板色譜簡單、方便、及操作費(fèi)用低；2、可以在一塊層析板上同時(shí)展開多個(gè)試樣及將多條濾紙同時(shí)展開；3、采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果；

4、試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。缺點(diǎn)：分離效率較低，不適用揮發(fā)性試樣分離。定性定量不便。應(yīng)用：平板色譜法在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸堿類化合物、糖類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)及中草藥中有效成分的分離分析中經(jīng)常被使用。也可以用于無機(jī)離子的分離。還經(jīng)常作為高效液相色譜的一種預(yù)試方法。

思考題1.現(xiàn)需分離分析一氨基酸試樣，擬采用哪種色譜？2.提高液相色譜中柱效的最有效途徑是什么？3.何謂反相液相色譜？何謂正相液相色譜？4.在液相色譜法中，梯度淋洗適用于分離何種試樣？5.在液相色譜中，范氏方程中的哪一項(xiàng)對柱效能的影響可以忽略不計(jì)？(p66)6.對下列試樣，用液相色譜分析，應(yīng)采用何種檢測器：（l）長鏈飽和烷烴的混合物（2）水源中多環(huán)芳烴化合物。7.對聚苯乙烯相對分子質(zhì)量進(jìn)行分級分析，應(yīng)采用哪一種液相色譜法？8.什么是化學(xué)鍵合固定相？它的突出優(yōu)點(diǎn)是什么？9.什么叫梯度洗脫？它與氣相色譜中的程序升溫有何異同？10.指出下列各種色譜法，最適宜分離的物質(zhì)。（l）氣液色譜；(2)正相色譜；（3）反相色譜；（4）離子交換色譜;（5）凝膠色譜；(6）氣固色譜；(7）液固色譜。1、在LC中，提高色譜柱的柱效率最有效的途徑是___A.減小載體粒度

B.適當(dāng)升高柱溫

C.降低流動相的速度

D.降低流動相的粘度

A一、分配色譜原理：根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過程。2.流動相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。2.固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。

根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。1）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。

為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。2）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機(jī)理為主。通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動相時(shí)，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。3.正相和反相鍵合色譜法正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比k增加。

在HPLC分析中，有時(shí)要在流動相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，為什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。何為正相色譜，何為反相色譜？正相色譜低極性流動相反相色譜高極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。二、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：對陽離子，滯留順序?yàn)椋篎e3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

對陰離子，滯留順序?yàn)椋簷幟仕岣?SO42-,C2O4,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

思考：待測陽離子電荷越小、其水合離子的半徑越大，則越先出峰？對嗎？2.固定相按離子交換劑類型分四種：

按固定相制作方法可分為：多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹脂；離子交換鍵合型。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團(tuán)多——交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+樹脂薄層(1-2m)多孔型=惰性核+硅膠微球+樹脂薄層?？朔硕嗫仔碗x子交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷。3）離子交換鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。微孔型