《動(dòng)物細(xì)胞工程》知識(shí)拓展

《動(dòng)物細(xì)胞工程》知識(shí)拓展1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是如何發(fā)展起來的？1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織生存空間。1951年，厄爾（Earle）發(fā)明了體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomerat）設(shè)計(jì)了灌流小室，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細(xì)胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技術(shù)進(jìn)一步提高了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對(duì)組織培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動(dòng)作用。此后單層培養(yǎng)成為組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。20世紀(jì)60年代后，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)開始起步，并逐步發(fā)展。20世紀(jì)80年代后，隨著基因工程和其他細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、生物制藥及其他許多技術(shù)的基礎(chǔ)，在現(xiàn)代生物技術(shù)中發(fā)揮著重要的作用。2.為什么動(dòng)物細(xì)胞要分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質(zhì)？細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)可以分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用細(xì)胞群（團(tuán)）、組織塊培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，最終都為細(xì)胞培養(yǎng)。分散成單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群（團(tuán)）后容易培養(yǎng)，細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)部細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細(xì)胞在體外長(zhǎng)時(shí)間的生存和生長(zhǎng)就較困難。同時(shí)，分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可使得在細(xì)胞水平操作的其他技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。用酶消化的是細(xì)胞間基質(zhì)，細(xì)胞間基質(zhì)主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，從而使細(xì)胞相互分離。3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液是由哪些化學(xué)成分組成的？糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽、微量元素等。4.體細(xì)胞核移植技術(shù)為什么要選擇MII期的卵母細(xì)胞做受體細(xì)胞？細(xì)胞核移植技術(shù)中能用作受體細(xì)胞的通常有MII期卵母細(xì)胞和受精卵（合子）。早期核移植技術(shù)中常用受精卵，后來基本上用MII期卵母細(xì)胞取代了受精卵，主要因?yàn)閮烧叩募?xì)胞質(zhì)環(huán)境不同。有人認(rèn)為重組需要的因子存在于MII期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，而在原核形成時(shí)這些因子已被降解或用光，因此，原核擴(kuò)張后受精卵去核可引起胞質(zhì)中重組因子缺乏。成熟促進(jìn)因子（MPF）是卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中重要的胞質(zhì)影響因子，MPF的活性在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的MI期和MII期達(dá)到最高，受精或激活后，MPF迅速滅活，因此，MII期卵母細(xì)胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影響供體核染色質(zhì)的狀態(tài)和復(fù)制。MII期卵母細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)已成熟，而MI卵母細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)尚未成熟，其細(xì)胞質(zhì)不能支持胚胎的全程發(fā)育，因此，盡管MI期卵母細(xì)胞MPF活性也高，但不能用作受體卵母細(xì)胞。也有人認(rèn)為用去核合子做受體時(shí)，可能由于合子去核時(shí)一些早期發(fā)育必需的因子隨原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏發(fā)育能力。因此，目前廣泛采用MII期卵母細(xì)胞做受體。5.已成功的動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)例還有哪些？生物種類細(xì)胞來源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細(xì)胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細(xì)胞—畸胎瘤細(xì)胞1978年要知道更多的實(shí)例，需經(jīng)常查閱更多科研報(bào)道。6.為什么不用兩個(gè)而要用多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞間的融合？就目前常用的細(xì)胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個(gè)細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個(gè)細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細(xì)胞類型。目前動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最有價(jià)值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上，但是每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個(gè)脾細(xì)胞（含B淋巴細(xì)胞）和一個(gè)瘤細(xì)胞雜交，我們不能確定該脾細(xì)胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，就可以從融合細(xì)胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。7.如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)及克隆化培養(yǎng)？融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。前沿動(dòng)態(tài)1.對(duì)稱融合與非對(duì)稱融合細(xì)胞融合在植物上可以克服有性雜交的不親和性，打破物種之間的生殖隔離，是擴(kuò)大遺傳重組范圍的一種有效手段，也稱之為體細(xì)胞雜交，由此再生出來的植株是體細(xì)胞雜種。進(jìn)行細(xì)胞融合的方式有兩種：一是將兩個(gè)物種的細(xì)胞除去細(xì)胞壁后，將完整的原生質(zhì)體融合在一起。在融合的細(xì)胞中含有兩個(gè)細(xì)胞核和兩種細(xì)胞質(zhì)，這種融合方式叫做對(duì)稱融合（symmetricfusion）。對(duì)稱融合往往由于細(xì)胞核分裂不同步而產(chǎn)生染色體排斥丟失，同時(shí)也由于兩個(gè)物種的全套基因組合在一起，好壞基因共處于一個(gè)雜種中，往往需要多次回交才能除去雜種中的不利基因，耗時(shí)長(zhǎng)，效率低。為了較好的解決對(duì)稱融合所帶來的問題，產(chǎn)生了另外一種融合方式──非對(duì)稱融合（asymmetricfusion）。非對(duì)稱融合是指融合雙方的親本一方為完整的原生質(zhì)體（包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)），而另一方只有部分染色體和細(xì)胞質(zhì)，或者無染色體只有細(xì)胞質(zhì)。這種融合方式可以較好的減少不利基因的重組，所得雜種只需要數(shù)次回交就可以達(dá)到改良作物的目的，耗時(shí)短，效率較高。除去染色體的方法可以用γ射線、χ射線、紫外線等物理方法，也可以用紡錘毒素等化學(xué)方法。2.單倍體的誘導(dǎo)方法及應(yīng)用價(jià)值單倍體（haploid）是指具有配子染色體數(shù)目的個(gè)體。單倍體可以自發(fā)產(chǎn)生，也可以誘發(fā)產(chǎn)生。動(dòng)物中（除蜜蜂、白蟻等外）的單倍體，由于生理上不正常，在胚胎發(fā)育時(shí)期就會(huì)死亡。植物上自發(fā)產(chǎn)生單倍體的植物很多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麥、小麥、油菜等，共有約10個(gè)科26個(gè)屬36個(gè)種的植物可以自發(fā)產(chǎn)生單倍體。除了自發(fā)產(chǎn)生單倍體外，人工誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的方法有：（1）種間和屬間雜交。由于遠(yuǎn)緣雜交，雖然不能受精，但在遠(yuǎn)緣物種的花粉誘導(dǎo)下，卵細(xì)胞可以在未受精情況下發(fā)育成胚，這種情況在馬鈴薯、大麥、小麥、玉米中都可以發(fā)生；（2）物理和化學(xué)誘變?；ǚ劢?jīng)射線照射或化學(xué)藥品處理失去受精能力，但仍可以刺激卵細(xì)胞發(fā)育成胚；（3）雙生苗篩選。有些植物可以產(chǎn)生多胚種子，即2～3個(gè)胚共處于一個(gè)種皮中，這樣的種子可以形成單倍體植株；（4）花藥或花粉培養(yǎng)。單倍體具有很好的應(yīng)用價(jià)值：在植物育種上，單倍體經(jīng)過加倍可以使后代迅速純合，縮短育種年限；由于單倍體經(jīng)加倍后，在理論上各基因位點(diǎn)應(yīng)處于純合狀態(tài)，對(duì)后代進(jìn)行選擇時(shí)，選擇到的個(gè)體代表著真實(shí)的變異，避免了雜交育種中雜交優(yōu)勢(shì)對(duì)選擇個(gè)體的干擾，提高了選擇效率；用單倍體作為轉(zhuǎn)基因的受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后基因即可純合，避免了體細(xì)胞作為受體，會(huì)由于后代分離需要多代選擇的麻煩。目前以油菜小孢子作為轉(zhuǎn)基因受體已得到轉(zhuǎn)基因植株。3.體細(xì)胞核移植與線粒體DNA目前出生的克隆動(dòng)物，沒有與核供體動(dòng)物完全一樣的，如在毛色花紋上就會(huì)有微細(xì)的差異。對(duì)多利羊的研究發(fā)現(xiàn)，其核外的少量DNA，即線粒體中的DNA來自于受體卵母細(xì)胞，而不像其他DNA一樣來自于供體核。法國(guó)某研究中心最近指出，現(xiàn)有的核移植技術(shù)普遍重視細(xì)胞核中的DNA，而忽視細(xì)胞質(zhì)中線粒體DNA的作用，因此無法真正克隆出一模一樣的動(dòng)物。該研究中心對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行了12年的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核DNA并非包含機(jī)體全部的遺傳信息，其