2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌

B.桿菌C.弧菌課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基：1、培養(yǎng)基概念

按照微生物對(duì)

的不同需求，配制出供其

的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖2、培養(yǎng)基種類包括

培養(yǎng)基和

培養(yǎng)基等。3、培養(yǎng)基的化學(xué)成分一般都含有

、

、

和

四類營(yíng)養(yǎng)成分。還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)

、

及

等的要求。固體液體水碳源氮源無機(jī)鹽pH特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧氣標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型配制特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多微生物的分離、計(jì)數(shù)等半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少觀察微生物運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種、保藏菌種等液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學(xué)物質(zhì)培養(yǎng)、分離出特定的微生物選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入四環(huán)素、卡那霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞可抑制細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁主要成分肽聚糖的合成其細(xì)胞壁是由纖維素、幾丁質(zhì)、葡聚糖組成菌落:單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。（二）無菌技術(shù)1、無菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下四個(gè)方面（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的

、操作者的

，進(jìn)行清潔和

；（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、

和

等進(jìn)行

；（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在

附近進(jìn)行；（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與

相接觸。空間衣著和手消毒接種用具培養(yǎng)基滅菌酒精燈火焰2、消毒和滅菌（1）消毒：消毒是指使用

方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分

的微生物，

(包括；不包括)芽孢和孢子，常用的方法有

消毒法、

消毒法、

消毒法。（2）滅菌：滅菌是指使用

殺死物體內(nèi)外

，

(包括，不包括)芽孢和孢子，常用的方法有

滅菌、＿＿＿滅菌和

滅菌。較為溫和的物理或化學(xué)對(duì)人體有害不包括煮沸巴氏化學(xué)藥劑強(qiáng)烈的理化因素所有的微生物包括灼燒干熱高壓蒸汽[思維激活]

用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)者手臂屬消毒還是滅菌？70%與95%的酒精，哪一種效果更好？為什么？

提示酒精擦拭屬化學(xué)消毒，酒精消毒時(shí)，70%的酒精殺菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。消毒和滅菌的區(qū)別條件結(jié)果常用的方法消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學(xué)藥物消毒法滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌消毒的方法：1、煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min2、巴氏消毒法：70～75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用體積分?jǐn)?shù)為50%～70%酒精溶液等進(jìn)行皮膚消毒4、氯氣消毒水源5、紫外線消毒滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160～170℃下加熱1～2h3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15～30min3.常用的消毒與滅菌的方法：是指用紫外線（能量）照射殺滅微生物的方法，紫外線不僅能使核酸、蛋白質(zhì)變性，而且能使空氣中氧氣產(chǎn)生微量臭氧，從而達(dá)到共同殺菌作用。

1、灼燒滅菌：滅菌的方法：2、干熱滅菌：160～170℃下加熱1～2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃條件下維持15～30min。答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手思考：三、實(shí)驗(yàn)操作（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）1.計(jì)算2.稱量3.溶化4.滅菌5.倒平板操作步驟：配方：1000mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成培養(yǎng)基組分提供的主要營(yíng)養(yǎng)牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸鹽和維生素蛋白胨10g碳源、氮源和維生素NaCl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000mL氫元素、氧元素倒平板技術(shù)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。討論：3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。（二）純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法①平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.在數(shù)次劃線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.平板劃線操作1.將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅2.在火焰旁冷卻接種環(huán)、并打開棉塞3.將試管口通過火焰。5.將試管口通過火焰，并塞上棉花。4.將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取一環(huán)菌液。不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。6.左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。8.將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作。在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)域的劃線與第一區(qū)域相連。1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)劃線分離法注意事項(xiàng):其他畫線分離圖：1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。討論：2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。②涂布分離法:是指將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)的細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄菌種的保藏1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法1.提示：可以從微生物生長(zhǎng)需要哪些條件的角度來思考。例如，微生物的生長(zhǎng)需要水、空氣、適宜的溫度，食品保存可以通過保持干燥、真空的條件，以及冷藏等方法來阻止微生物的生長(zhǎng)。2.提示：可以從這三種培養(yǎng)技術(shù)的原理、操作步驟等方面分別進(jìn)行總結(jié)歸納。例如，這三種培養(yǎng)技術(shù)都需要為培養(yǎng)物提供充足的營(yíng)養(yǎng)，但無土栽培技術(shù)的操作并不需要保證無菌的條件，而其他兩種技術(shù)都要求嚴(yán)格的無菌條件。3.提示：這是一道開放性的問題，答案并不惟一，重點(diǎn)在于鼓勵(lì)學(xué)生積極參與，從不同的角度思考問題。例如，正是由于證明了微生物不是自發(fā)產(chǎn)生的，微生物學(xué)才可能發(fā)展成為一門獨(dú)立的學(xué)科；巴斯德實(shí)驗(yàn)中用到的加熱滅菌的方法導(dǎo)致了有效的滅菌方法的出現(xiàn)，而這一滅菌原理也適用于食品的保存等。旁欄思考題1．無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？解析許多微生物對(duì)人類是有害的，因此實(shí)驗(yàn)室中無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答案無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。2．請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。(1)培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿。(2)玻璃試管、燒瓶和吸管。(3)實(shí)驗(yàn)操作者的雙手。解析消毒和滅菌是無菌技術(shù)的兩項(xiàng)基本技術(shù)，實(shí)踐中需要根據(jù)無菌操作的對(duì)象合理地選擇使用。原則是既要考慮使用的效果，又要考慮無菌操作對(duì)象的承受能力。答案(1)、(2)需要滅菌；(3)需要消毒。倒平板操作討論題1．培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？答案可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2．為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答案通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3．平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答案平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4．在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答案空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。平板劃線操作討論題1．為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答案操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個(gè)菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2．在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答案以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3．在做第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答案劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。涂布平板操作討論題涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？答案應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。練習(xí)1．提示可以通過保持干燥、真空的條件，以及冷