人源性漢坦病毒噬菌體抗體基因篩選測(cè)序和表達(dá)重點(diǎn)

人源性漢坦病毒噬菌體抗體基因精選、測(cè)序和表達(dá)要點(diǎn)人源性漢坦病毒噬菌體抗體基因精選、測(cè)序和表達(dá)要點(diǎn)10/10人源性漢坦病毒噬菌體抗體基因精選、測(cè)序和表達(dá)要點(diǎn)人源性漢坦病毒噬菌體抗體基因的精選、測(cè)序和表達(dá)人源性漢坦病毒噬菌體抗體基因的精選、測(cè)序和表達(dá)中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志1999年第1期第19卷出血熱作者：侯穎春楊為松白雪帆許國雙李光玉單位：侯穎春（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科）；楊為松白雪帆許國雙李光玉（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳生病科）要點(diǎn)詞：噬菌體；抗體；漢坦病毒；DNA；單鏈；免疫球蛋白可變區(qū)【綱領(lǐng)】目的為了獲得人源性HFRS基因工程抗體。方法直接從人體PBL建立人全套ScFv、VH噬菌體表面表現(xiàn)文庫，以panning方法篩至四級(jí)文庫，以ELISA方法判斷各克隆抗?jié)h坦病毒活性。結(jié)果獲得了14個(gè)ScFv陽性克隆和11個(gè)VH陽性克隆。其中ScFv最高陽性克隆A410值為0.44,VH最高陽性克隆A410值為0.50。對(duì)最高陽性克隆進(jìn)行了測(cè)序解析，證明連結(jié)和克隆正確，獲得了抗HTV人源性ScFv和VH抗體的基因片段?？寺≡俎D(zhuǎn)變于HB2151菌株，成功地進(jìn)行了分泌型抗體片段的表達(dá)。結(jié)論采用噬菌體抗體庫技術(shù)直接從人體克隆人源性漢坦病毒噬菌體抗體可行，對(duì)HFRS的防治有必然的實(shí)質(zhì)意義。Selecting,sequencingandexpressingofthehumanphageantibodyfragmentsagainstHTVHOUYingchun*,YANGWeisong,BAIXuefan,etal.*DepartmentofGeriatrics,XijingHospital,Xi'an710032【Abstract】ObjectiveToobtainthegeneticengineeringantibodyagainstHFRSvirus.MethodsRepertoiresofhumanScFvandVHdisplayedonpHEN1havebeengenerateddirectlyfromhumanPBL.Thetworepertoireswerepannedintograde-4repertoires.TheactivityofeachclonetobindHTVwasexaminedbyusingELISA.Results14positiveScFvclonesand11positiveVHcloneshavebeenfound.ThehighestvalueofA410inpositiveScFvcloneswas0.44,andinpositiveVHcloneswas0.50.Thetwoclonesweresequenced,andthesequencingresultsdemonstratedthatthegenesofScFvandVHwerethehumanantibodygenes,andthegeneligating,cloningandscreeningwerecorrectandsuccessful.ThesecretoryexpressionofScFvandVHwerealsocarriedout.ConclusionsTheexperimentalresultssuggestthattheskillsusedinthepaperaregoodtoobtainthegeneticengineeringantibedyagainstHFRS.AndtheantibodycouldbeusedforpreventionandtreatmentofHFRS.Fv

【Subjectwords】PhageantibodyVariableregionofantibody

Hantavirus

Singlechain相關(guān)漢坦病毒（Hantavirus,HV）的抗體曾有很多報(bào)道，但都為鼠源性抗體也許非真實(shí)意義上的基因工程抗體（即沒有繞過雜交瘤和人工免疫技術(shù)而制備的基因工程抗體）。這些抗體有很多眾所周知的不足所以使它們?cè)谂R床的應(yīng)用碰到限制。噬菌體全套抗體庫技術(shù)能夠繞過雜交瘤和免疫技術(shù)而制備真實(shí)意義上的人源性基因工程抗體，為基因工程抗體研究開避了廣闊的遠(yuǎn)景。我們從本院收治的來自不同樣樣疫區(qū)的10例腎綜合征出血熱（HFRS）病人的外周血淋巴細(xì)胞（PBL）提取RNA,以O(shè)ligod(T)15為引物合成cDNA第一鏈，以自行設(shè)計(jì)的數(shù)對(duì)人抗體V區(qū)通用引物擴(kuò)增出了人抗體VH、Vκ、Vλ基因，以自行設(shè)計(jì)的linker引物擴(kuò)增了linker,并經(jīng)過SOE反響（splicingbyoverlapextension）建立了單鏈抗體基因（ScFv）。以載體pHEN1與ScFv、VH重組，轉(zhuǎn)變大腸桿菌菌株TG1，經(jīng)過M13KO7的超傳染，成功地建立了人源性全套ScFv(VH-linker-Vκ)和VH噬菌體表面表現(xiàn)文庫〔1〕。本文將就該兩種文庫的精選、抗體活性判斷、序列測(cè)定以及分泌型表達(dá)等方面作一報(bào)道。資料與方法1.PBL分別和辦理、RNA提取、cDNA第一鏈合成、引物設(shè)計(jì)、PCR方法、SOE反響、M13KO7超傳染以及文庫的獲得：均拜會(huì)文件〔1〕。文庫的panning精選：以Chen、R22、76-118、Seoul等4株HV（鼠腦浸出物）混淆物對(duì)倍稀釋后包被90mm聚苯乙烯平皿，將文庫傾至平皿上10ml/皿），37℃置3小時(shí)，棄液體，以PBS-0.05%Tween20洗皿20次。以來自M9平板并經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的TG1菌液（10ml／皿）覆蓋平皿，37℃置2小時(shí),收液體，37℃搖床培養(yǎng)1小時(shí)，離心后積淀以2×YTAG(含100μg/ml氨芐青霉素、2%葡萄糖的2×YT)10ml重懸，37℃搖床培養(yǎng)留宿。給留宿培養(yǎng)物中加入4×1010PFU的M13KO7，37℃搖床1小時(shí)，離心棄上清。積淀以2×YTAK(含氨芐青霉素、卡那霉素各100μg/ml的2×YT)重懸，37℃搖床培養(yǎng)留宿，4℃、4000r/min離心10分鐘，收集上清即為次級(jí)文庫。上述包被、吸附、洗脫、再傳染、擴(kuò)大培養(yǎng)（擴(kuò)增）、超傳染、獲次級(jí)庫的全過程稱之為panning。本研究做了3輪panning至獲得四級(jí)文庫。3．單克隆化及克隆抗體活性判斷：?jiǎn)慰寺』許OBAG(含100μg/ml氨芐青霉素、2%葡萄糖的SOB)平板鋪板培養(yǎng)的方法進(jìn)行，獲得各克隆含重組pHEN1的上清。各克隆抗體抗HV活性判斷以常例ELISA方法進(jìn)行，其中包被抗原用Chen、R22、76-118、Seoul等4株病毒鼠腦浸出混淆物。二抗用羊抗M13抗體Pharmacia出品），酶標(biāo)抗體用驢抗羊-HRP（華麗企業(yè)出品）。陰性比較孔以0.5%BSA包被，陽性比較孔以羊抗M13抗體包被，底物為OPD（華麗企業(yè)供應(yīng)），測(cè)A410值。4．最高A410值克隆抗體基因序列測(cè)定參照Sambrook等所述制備單鏈測(cè)序模板〔2〕，按載體pHEN1克隆位點(diǎn)雙側(cè)序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，送北京賽百盛（美國）生物工程企業(yè)以雙脫氧尾端停止法在全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。5．分泌（可溶）型表達(dá)：將上述測(cè)序證明后的克浩大提重組子，轉(zhuǎn)變大腸桿菌HB2151菌株，在IPTG引誘下進(jìn)行分泌型表達(dá)，分別從培養(yǎng)上清和細(xì)菌周質(zhì)中收獲可溶性抗體片段。結(jié)果1．文庫的panning精選：ScFv文庫和VH文庫的庫容以建庫用PBL權(quán)衡均6×1012〔2〕。經(jīng)為10PBL，以建庫后其噬斑形成單位（PFU）權(quán)衡均約為5.5PFU過3輪panning精選，獲得四級(jí)文庫，ScFv四級(jí)文庫和VH四級(jí)文庫庫容分別約為2.5×1012PFU和3.5×1012PFU。2．單個(gè)克隆化及各克隆抗體活性判斷結(jié)果：四級(jí)文庫菌種經(jīng)100∶1和1000∶1稀釋后在SOBAG瓊脂板上鋪板培養(yǎng)，共收集了180個(gè)ScFv菌落和200個(gè)VH菌落。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)及M13KO7超傳染，獲得了380個(gè)克隆的含交融表達(dá)產(chǎn)物的重組子的上清。以4株HTV混淆物包被96孔板，以抗M13抗體為二抗，以驢抗羊-HRP為酶標(biāo)抗體，做常例ELISA檢測(cè)。結(jié)果獲得14個(gè)ScFv陽性克隆和11個(gè)VH陽性克隆，A410值見表1和表2。最高A410值克隆分別是BS22(0.44)和AV7(0.50)。表1ScFv交融表達(dá)陽性克隆ELISA檢測(cè)結(jié)果Table1.ResultofELISAexaminingforpositiveclonesofScFvNumbersofAS4BS12BS22CS4CS10CS12DS5ES1ES6positiveclonesValueof0.360.340.440.400.290.330.310.400.41A410表2VH交融表達(dá)陽性克隆ELISA檢測(cè)結(jié)果Table2.ResultofELISAexaminingforpositiveclonesofVHNumbersAV2AV7AV8AV9AV12CV8DV12EV3GVofpositiveclones0.410.500.400.420.390.340.330.310.49ValueofA4103．最高A410值陽性克隆測(cè)序解析:兩次小量制備單鏈測(cè)序模板每種約10μg。ScFv(700～750bp)測(cè)序用長(zhǎng)膠，VH(300～370bp)測(cè)序用短膠。測(cè)序結(jié)果如圖1、2。將序列測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)成多肽鏈序列，則如圖3，圖4。圖1ScFv-BS22序列測(cè)定結(jié)果Fig1.ThesequencingresultofScFv-BS22cloneThesequencebeforelinkerisVH,theoneafterlinkerisVκ圖2VH-AV7序列測(cè)定結(jié)果Fig2.ThesequencingresultofVH-AV7clone圖3ScFv-BS22多肽鏈序列推譯Fig3.TheinferenceofpolypeptidesequenceforScFv-BS22ThesequencebeforelinkerisVH,theoneafterlinkerisVκ圖4VH-AV7多肽鏈序列推譯Fig4.TheinferenceofpolypeptidesequenceforVH-AV7以上DNA序列經(jīng)與gene-bank中抗體基因家族以及文件資料比較解析，發(fā)現(xiàn)各FR區(qū)均符合人抗體相應(yīng)FR區(qū)特點(diǎn)，提示均為人抗體基因，證明基因的拼接、克隆、精選均獲成功。31×103和4．抗體片段的分泌型表達(dá)（可溶性表達(dá)）：將ScFv-BS22和VH-AV7克隆的宿主菌由TG1改換為HB2151后，在IPTG引誘下進(jìn)行分泌型表達(dá)。來自培養(yǎng)上清和細(xì)菌周質(zhì)的可溶性表達(dá)產(chǎn)物均經(jīng)三蒸水透析48小時(shí)。聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定ScFv-BS22和VH-AV7可溶性表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分別約為15×103，與預(yù)期符合。談?wù)撌删w抗體庫技術(shù)屬于當(dāng)前分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的新技術(shù)，該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)有：①大大提高了抗體基因文庫的精選效率；②繞過了雜交瘤和免疫技術(shù)而制備抗體；③模擬了天然抗體庫〔3～5〕。本研究直接從人PBL建立了人源性全套ScFv(VH-linker-Vκ)和VH噬菌體表面表現(xiàn)文庫，由于使用了通用引物，采血對(duì)象是來自不同樣樣疫區(qū)的特異性IgG陽性的HFRS恢復(fù)期患者、建立ScFv時(shí)基因可再自由配對(duì)，所以，關(guān)于精選抗HV抗體來說，該庫庫容（106PBL）已足夠大。文件一般對(duì)所建文庫panning兩次至三級(jí)文庫用作克隆精選，我們?yōu)榱穗S后克隆精選的便利，對(duì)兩個(gè)文庫panning了3次，獲得四級(jí)文庫，文庫中目的重組子克隆所占比重（相對(duì)）已足夠大。共篩出了14個(gè)ScFv和11個(gè)VH抗HTV陽性克隆，其中ScFv-BS22和VH-AV7是各自陽性克隆群中活性較高者（為了下一步表達(dá)產(chǎn)物活性較高并最后獲得活性較高抗體，這里特選A410值最高者），其序列經(jīng)與genebank中人抗體基因家族成員以及文件資料〔3，4〕比較解析，發(fā)現(xiàn)各片段FR區(qū)均符合人抗體各相應(yīng)FR區(qū)特點(diǎn)。隨后進(jìn)行的分泌型表達(dá)產(chǎn)物的分子量的測(cè)定也與預(yù)期分子量相符。以上結(jié)果提示所獲基因片段均為人抗體基因片段，表示基因的拼接、克隆、精選是成功的。ScFv和VH片段均無Fc區(qū)，故以M13抗體對(duì)交融表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行ELISA檢測(cè)，所以種表達(dá)產(chǎn)物是抗體片段與噬菌體外殼蛋白（CPⅢ）的交融表達(dá)產(chǎn)物。這種檢測(cè)方法有必然誤差，由于國內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件所限，當(dāng)前還沒有更好的方法。0.44和0.50這樣水平的活性指標(biāo)，顯然不夠理想，有待于以分子生物學(xué)方法（如點(diǎn)突變法等）進(jìn)一步提高其活性。在漢坦病毒(HV)抗體方面，過去的研究還沒有走開雜交瘤技術(shù)。采用噬菌體抗體庫技術(shù)直接從人體克隆人源性抗HV的基因工程抗體，獲得了有必然HV結(jié)合活性的ScFv(VH-linker-Vκ)和VH2種抗體片段，進(jìn)一步對(duì)表達(dá)產(chǎn)物特點(diǎn)進(jìn)行研究對(duì)HFRS的防治將有必然的理論及實(shí)質(zhì)價(jià)值。本課題受兩項(xiàng)國家自然科學(xué)基金（39370619，39400117）資助參照文件侯穎春，白雪帆，楊為松，等.出血熱恢復(fù)期患者全套噬菌體抗體庫的建立.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1997，13(4)∶7-12.[2]SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning-alaboratorymanual.2nded.ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，576-847.[3]MarksJD,HoogenboomHR,BonnertTP,etal.By-passingimmunization:humanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage.JMo