quantity-one中文使用說明

*首先把做出的圖片用“圖片轉(zhuǎn)化器Version3.1〔可下載〕轉(zhuǎn)換為TIF格式，顏色框選中“真彩TIFFRESSE**凝膠電泳是根本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，比較知名的比方BandScan、BandLeader、SigmaGel等等。今日要向大家介紹的是來自Bio-Rad1DQuantityOn〔Bio-Rad還有一個做2DPDQuesBio-Rad4.52版。3030天以后照舊可以以BasicMode連續(xù)使用，關(guān)鍵功能如Lane、Band、VolumeContour功能一個不缺，只是無法保存和打印結(jié)果〔HyperSnap等截屏保存分析結(jié)果。QuantityOne的分析功能顧名思義主要用來進展凝膠或者培育皿的熒光定量分析。它的分析功能或者4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線直接定量法；菌落計數(shù)；分子量測定等高線定量法〔VolumnContour〕：通過半自動描繪電泳條帶的等高線邊緣來得到等高線區(qū)域內(nèi)部無法同等得排解不同泳道的背景亮度；等高線的繪制處于“半自動”狀態(tài)，即需要人為推斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的邊緣；最致命的是在幾個電泳條帶距離格外接近的時候幾乎無法繪制單一條帶的輪廓〔常消滅連續(xù)的幾個條帶等高線相連而無法分別出單獨條帶的輪廓〕。泳道/條帶軌跡定量法〔TraceTracking〕：---電泳條帶識別兩個連續(xù)的步驟才能進展定量。然而這種方式的最大優(yōu)點在于它可以完全拋棄人為主觀因素進展全自動定量。他的定量方式為：首先依據(jù)不同電泳條帶的光密度值繪制光密度曲線，然后計算光密度曲線下面積作為電泳條帶的定量依據(jù)。大家可能會問他能不能排解泳道背景？答案是確定的，它能夠最大程度的排解不同泳道之間的背景差異，讓各個泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎一樣的起跑線上進展比照。這個背景排解不是一個等級的。等高線法只能排解同一泳道上的背景，而不能均等的排解不同泳道的背景〕。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以結(jié)合GaussModelBands對嚴密相連的電泳條帶進展分析，而這種條帶也是等高線法無法分析的。我們此次重點學(xué)習(xí)這個方法。菌落計數(shù)〔ColonyCounting〕。這個功能其實很有用，可以分析藍白篩選的結(jié)果。QuantityOne還可以通過回歸曲線。QuantityOne常用的根本菜單操作。QuantityOneBio-RadQuantityOne可以自動輸入來自Bio-Rad公司的凝膠的數(shù)據(jù)。具體支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”里面設(shè)置。假設(shè)您的試驗室沒有承受Bio-Rad的硬件設(shè)施也沒關(guān)系您只要將電泳圖片用ACDSee等程序轉(zhuǎn)換TIFQuantityOneQuantityOne816TIF文件。提示:QuantityOne似乎有一個小bug，就是在按“Open”之后并沒有馬上彈出資源治理器讓你選擇目標(biāo)文件的位置。其實你只要將鼠標(biāo)在屏幕右下方點擊一下，資源治理器就會乖乖彈出來了。提示:QuantityOne只能分析白色背景+黑色條帶的電泳圖。而我們正常狀況下得到的一般都是黑色背景+白色條帶的電泳圖。我們可以在“Image-InvertdataQuantityOne進展分析了。文字注釋：QuantityOne供給根本的文字注釋功能。您可以在您的電泳圖片上記錄您的分析結(jié)果比如電泳條帶的分子量、光密度值、物質(zhì)的量等等。這個功能可以通過“Edit-TextOverlayTools”來實現(xiàn)。在彈出的浮開工具欄中選擇“ABC”或者“\”就可以進展文字輸入和畫標(biāo)記線的操作。Density”的下級菜單中大家會見到幾個和電泳條帶光密度值相關(guān)的顯示選項。大家可以分別選擇不同的選項感受一下它們之間的差異。選擇方法是點擊相應(yīng)的下級菜單比方“PlotCrossSection”，然后將變成帶一個藍色感慨號的鼠標(biāo)移到您想知道光密度的位置，點擊一下就會顯示該處的光密度相關(guān)信息。在下面這幅圖片中我們可以觀看兩條黃線穿插處的電泳條帶的相關(guān)信息。上方的一串曲線是不同泳道之間在同一水平線上的光密度比值曲線；左邊是黃線穿插處所在泳道的幾個電泳條帶的光密度分布狀況。3DViewer：在“View-3DViewer”3DViewer。這個玩意按照Bio-Rad的說法可以關(guān)心區(qū)分幾條嚴密相連在一起的電泳條帶的分布狀況。大家只要選擇了這個命令后鼠標(biāo)就會一個“+”QuantityOnegauss噱頭多于有用。QuantityOne的等高線定量模式也有一種比較根本的背景排解方法。這個方法同樣也適用于泳道/條帶定量模式。現(xiàn)在我們就來學(xué)習(xí)這個方法。根本背景排解的功能位于“Image-Substractbackgroud...”和“Image-FilterWizard...”這兩個菜單。Image-FilterWizard：這個功能是對原始圖片做一些初步的加工，主要是除去一些圖片上的“斑點”。這些斑點主要有兩種類型：一種是深色的“胡椒面”型和淺色的“食鹽”型，兩種斑點都可以毫不遲疑地去除。從“Image-FilterWizard...”菜單調(diào)出向?qū)Р藛魏筮x擇“pepper”和“salt”，下面兩個選項可以依據(jù)程序默認的選項，然后“OK”就可以完成這第一步的降噪過程。Image-Substractbackgroud：這個功能是真正對圖片背景進展清理的工具〔區(qū)分于“Image-FilterWizar而在清理方式上它還是可以分成兩種不同的方式：BackgroudBox：“BackgroudBox”“BackgroudBox”放鼠標(biāo)后程序就會馬上對電泳圖片進展降低背景的處理；BackgroudStripe：相對于“BackgroudBox”“BackgroudBox”QuantityOne此時供給一種隨著凝膠濃度變化而變化的除背景方式就是“BackgroudStripe”和“BackgroudBox”類似，選擇右下角的“BackgroudStripe”按鈕，然后用鼠標(biāo)沿著電泳泳道拖放形成一個狹長的剪影帶〔Stripe〕，這個剪影帶內(nèi)部的光密度值順著泳道漸漸上升或降低。QuantityOneStripe可以動態(tài)的對整張圖片的背景進展剪影。比方泳道起始處光密度低，那么QuantityOneStripe向前延長，光密度值漸漸上升，QuantityOne也同樣不斷加大剪影的強度。這樣一來就可以排解由于梯度膠帶來的背景不全都的影響因素。QuantityOne之所以強大是由于它具有的泳道/條帶軌跡定量法。現(xiàn)在我們就來學(xué)習(xí)一下如何在電泳圖片上創(chuàng)立泳道〔Lane〕以及如何進展針對不同泳道的背景排解?！惨缘鞍踪|(zhì)電泳為例。然后選擇“Lane-AutoFramelanes”。這時假設(shè)您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話，QuantityOne就會自動識別出每條電泳泳道的位置，而且將各個泳道的路徑用一條紅線標(biāo)畫出來；假設(shè)您對軟件自動標(biāo)記的泳道不甚滿足，您可以通過“Lane-EditFrame”下級各個子菜單供給的功能對泳道框架位置、大小等進展調(diào)整。調(diào)整方法就是通過鼠標(biāo)的拖放來實現(xiàn)，大家可以自己體驗一下；假設(shè)您只需要分析其中幾個泳道的數(shù)據(jù)而不想其他泳道的標(biāo)記干擾您的視線，您可以通過“Lane-SingleLane-RemoveLane”刪除您不需要的泳道的標(biāo)記。提示:QuantityOne自動識別。在不能自動識別的狀況下，QuantityOne就會彈出對話框告知您它不能識別泳道。這時大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面一樣，同過“Lane-SingleLane-CreatLane”來實現(xiàn)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標(biāo)記紅線。排解背景“Image”菜單中使用的“SubstructBackgroud”有所不同。后者排解背景的對象是整個電泳圖片而非將各個電泳泳道的背景分別進展排解?，F(xiàn)在我們要學(xué)習(xí)的這個功能對我們以后的分析影響甚大，大家確定好好學(xué)習(xí)。首先我們要將我們的電泳圖片進展前面談到的泳道識別，不管是自動方式還是手工識別。然后選擇“Lane-LaneBackgroud...”命令。選擇該命令后，鼠標(biāo)即變成一個綠色的“+”，將鼠標(biāo)移到您打算進展背景排解的泳道〔4泳道〕，點擊左鍵一下，馬上就會彈出如以以下圖所示的對話框。其中“OpticalDensity”顯示得是該泳道光密度值的分布狀況。大家會留意到這個分布曲線并不是緊貼著縱“懸空現(xiàn)象”的緣由就是該泳道自身存在著確定的光密度“背景”。這個背景的存在導(dǎo)致該泳道上各個電泳條帶之間不能處于同一水平進展比照；假設(shè)考慮到相鄰的其他泳道更是由于不同背景的存在而無法比照不同泳道上的不同電泳條帶。如何去除這個背景呢？我們連續(xù)看右邊的“LaneBackgroudSubstruction”對話框。這個對話框的上方“AllLanes”表示可以對全部泳道進展一次性處理；下方的“SelectedLane”表示僅針對此次選中的這個泳道進展處理〔4泳道〕?！癛ollingDiskSize”里填上“5”，再按“回車”將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布格外準(zhǔn)確的劃分開來。提示:大家可能會奇異這里的“RollingDiskSize”指得是什么意思？我們可以將QuantityOne供給的去除背景功能想象成是一個滾動的小球。假設(shè)這個小球的半徑越小，那么它沿著光密度曲線滾動時滾過的路徑就更加精細，具體反映在醬色曲線的軌跡更加靠近黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來說“RollingDiskSize”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可以試著選擇一個較大的值比方80，再來看看此時醬色曲線的軌跡。固然也不能取太小的值。由于假設(shè)取值太小，大家可以想象這個格外微小的球就會滾入光密度曲線內(nèi)部，造成有效陽性信號的損失。個人感覺5~20是一個比較好的取值范圍。我們再在“LaneBackgroudSubstruction”對話框的最下方鉤選“ShowLaneTracewithBackgroudSubstructed”，再來看看是不是泳道上全部的背景都被消退了？各個電泳條帶是不是完全結(jié)合到縱軸上在同一水平進展比較了？QuntityOne之所以強大是由于它具有的泳道/?，F(xiàn)在我們就來學(xué)習(xí)一下如何在電泳圖片上創(chuàng)立泳道〔Lane〕以及如何進展針對不同泳道的背景排解。我們對于其他泳道也可以依葫蘆畫瓢進展類似的背景排解工作。假設(shè)大家覺得可以使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即相同的“RollingDiskSize”進展排解，那么我們可以在“LaneBackgroudSubstruction”對話框中選擇上方的“AllLanesOn(samelevel)”選項。然后在“RollingDiskSize”中填上一個適宜的值，點擊“Done”按鈕確認他泳道〔81道〕，你會覺察全部泳道的背景均已去除QuantityOne供給的泳道比照功能對同一張凝膠照片上的不同泳道進展比照，看看每條泳道上電泳條帶的分布狀況。首先將翻開的電泳照片進展前面談到的泳道識別和去除背景步驟。然后選擇“Lane-Compare左鍵點擊，QuantityOne就會馬上探出一張黑色背景的“CompareLanes”對話框。在這個對話框中紅色的曲線代表您選擇的泳道的光密度分布曲線。曲線的波峰局部表示位于泳道上的不同電泳條帶；波峰的凹凸象征電泳條帶光密度值的大??；波峰的寬窄象征電泳條帶的寬度；波峰由左至右表示各個電泳條帶順著泳道由后向前的分布。提示:大家請留意這個紅色曲線。它不僅僅供給應(yīng)我們關(guān)于泳道上光密度的分布狀況，更重要的是在下一步我們對電泳條帶進展定量的時候，我們將以每個波峰的曲線下面積作為定量的標(biāo)準(zhǔn)。我們還可以用鼠標(biāo)點擊其他我們感興趣的泳道〔6、9、14泳道〕，這時再轉(zhuǎn)到“CompareLanes”QuantityOne4條泳道的比照PP？前面我們已經(jīng)識別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們開頭爭論電泳條帶的問題。首先在這里明確兩指電泳泳道；“Band”指電泳條帶。在下文中一律使用這兩個英文名詞來表示這兩個意思。和前面爭論Lane一樣，首先我們要對LaneBand進展識別。識別方式同樣分為自動識別和人工識別。自動識別的時候選擇“Band-DetectBands...”QuantityOne會自動彈出一個“DetectBands的對話框〔如以以下圖〕。提示:第一次用QuantityOne的朋友可能會覺察您的Bands識別以后僅僅是畫出了一條紅色的粗線，而在上面的演示圖片中卻是上下括號的形式。其實大家可以在“Band-BandAttributes”選項中設(shè)置Bands的顯示形式。在下方的“Style”選項卡中選擇“Brackets”就會將原來的粗線改為括號形式了。在上面的對話框中，我們可以指定識別的參數(shù)。LanesBands就鉤選Lands后面的“All”LaneBands就鉤選“One”，然后在后面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼；假設(shè)僅僅想識別泳道上局部光密度值最強的Bands，可以在“Bands”后面的選項中選擇“Limit”，然后填上相應(yīng)的數(shù)目〔10〕。QuantityOne10Bands；BandsBand的紅色括號內(nèi)范圍小于黑色的光密度影。此時可以使用“LaneWidth”Bands“LaneWidth”后面的向上箭頭就會覺察紅色括Band影跡；BandBand，您還可以使用上面的工具欄進展調(diào)解。將您的鼠標(biāo)指向每個圖標(biāo)，QuantityOne就會知道彈出一個黃色的提示信息告知您這個按鈕的功能。在此不再連續(xù)闡述了。Bands進展一些處理，然后就可以進展最終的結(jié)果分析了。高斯建模：大家學(xué)過統(tǒng)計學(xué)學(xué)問后都知道高斯〔Gauss〕分布是個什么意思，在此我就不多作解釋了。QuantityOneBand內(nèi)部的光密度分布應(yīng)當(dāng)也聽從高斯曲線的特征，正如前面對大家呈現(xiàn)3DViewerBands〔即分子量很接近的幾個蛋白或者核酸〕在泳道的某個區(qū)域成串消滅。此時我們很難通過會自等高線的方法準(zhǔn)確的描繪出BandBands進展高斯建模處理。QuantityOneBands描繪成22、23Bands經(jīng)過高斯建模Bands。提示:高斯建模必需建立在有效的泳道背景去除之后。背景去除的方法可以參見我們前面的方法，即通過“Lane-LaneBackgrouds”的方式進展去除背景。去除背景的時候最好選擇RollingDiskSize小一些的方案。這樣背景去除后的光密度分布曲線和高斯建模后的光密度分布曲線才能比較好的吻合。另外高斯建模并不是一個必需的步驟。它僅僅在消滅多條Bands嚴密排列在一起，以至于無法區(qū)分它們之間的間隔的時候才最有效。假設(shè)Bands在泳道上松散的分布則可以不使用高斯建模。那么如何進展高斯建模呢？很簡潔！只要執(zhí)行“Band-GaussModelBands...”QuantityOne回彈出一個對話框問您要對那條泳道進展高斯建模。請鉤選“One”，然后再輸入需要建模的泳道代碼就可以了〔2泳道〕；假設(shè)選擇了“All”則對全部泳道進展高斯建模，固然建模這么多泳道會費一點時間了。執(zhí)行完高斯建模以后使用“Band-BandInformation”命令來觀看結(jié)果。方法是將變成藍色贊美號的鼠標(biāo)移到剛剛已經(jīng)識別的Band“BandInformation”〔見以以下圖。在這幅圖中我們必需留意的是“Trace”和/或“GaussModelTrace”，由于我們剛剛辛苦了半天就是為了得到這個數(shù)據(jù)。這個數(shù)據(jù)表示的就是Band光密度分布曲線下面積，也就是QuantityOneBand內(nèi)分“MolWt”〔分子量〕；“Quantity/Units”等現(xiàn)在還是空白，咱們下以后的分析步驟中將漸漸填滿它們。提示:QuantityOne有一點讓人感到很不明白。它的“Trace”和“GaussModelTrace”都是表示曲線下面積的，可是使用的OD*mmOD*mm2。26band的光密度曲線黃色局部并不呈高斯對稱〔少了一局部不是？〕Band相互融合在一起了。26Band的黃色光密度曲線是不是呈完整的高斯對稱了？而且后面的“GaussModelTrace”也不再是“N.A”，而變成了“0.717OD”，比照上面的“Trace”=0.693OD，大家想想為什么要大一些呢？們還是以蛋白質(zhì)為例來學(xué)習(xí)。分子量推想：是建立在泳道和條帶都已經(jīng)創(chuàng)立好的根底上。我們只是人為的為一些泳道上的條帶加上一個的標(biāo)準(zhǔn)，然后通過不同泳道和條帶之間的比照繪制回歸曲線，通過回歸曲線的走始終推想特定條帶上的分子的分子量。固然假設(shè)我們能夠在一次電泳中多跑幾條不同分子量成分的marker，必定能夠提高我們推想的準(zhǔn)確性。選項卡中選markerMarker，那么請選擇“NewStandard”創(chuàng)立您自己的marker，然后在彈出的“Standard”Marker的分子量。如以以下圖在“Standard”中輸入一個名稱，然后在Marker的分子量和名稱?！癟ype”下面的小箭頭〔上圖鼠標(biāo)指向的位置〕，然后把變成綠色加號的鼠標(biāo)Markerband200KD15200KD的位置，以此Marker都標(biāo)記上相應(yīng)的數(shù)字。標(biāo)記完成后，MakerBands就會變成藍色。Marker泳道，您可以再多表記幾條以提高軟件推想的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)在我們執(zhí)行“Match-StandardCurve”，然后用鼠標(biāo)任憑點擊我們想要了解的泳道，QuantityOne馬上就會為我們顯示出一條曲線，傍邊還有一個小的對話框“Std.CurveOptionsforProteins”，在這個對話框中“RegressionModel”選擇“PointtoPointSemi-log”或者“Elder-Southern”“ShowNumericaldataofPoints”Bands的分子量了。BandInformation中除了“trace”和“gaussmodeltrace”以外我們還有幾個工程沒有填入數(shù)據(jù)。這些當(dāng)時未填入的數(shù)據(jù)其實是“Mol.wt”和“Quantity/Unit”2項。剛剛我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了如何推想分子量，大家現(xiàn)在再用“Band-BandInformation”Band，是不是“Mol.wt”已經(jīng)被填上數(shù)Band之間的物質(zhì)的量的比，而沒有落實到具體的實際數(shù)字〕?！岸繕?biāo)準(zhǔn)”MarkerBandMarker5ulDL2023Band含50ngDNA。具體操作-QuantityStandards，在彈出的“CalibrationCurve”對話框中選擇“CreatNew”，在Standards對話框中填寫一系列相關(guān)信息。重要的信息包括：“Units”：指作為marker的物質(zhì)的量的單位，例如ng，ug，mg等等?！癕easureMakerBand“Measure”按鈕后可以選擇“TraceDensity”“ContourDensity”、“PeakDensity”和“AverageDensity”。假設(shè)您前面的分析承受的是軌跡法定量的話可以選擇“TraceDensity”；假設(shè)您承受的是等高線法定量可以承受“ContourDensity”。3.“Select”：在“Select”后面有三個選項，Band、Match、Lane。選中其中一個選項比方“band”，然后將變成向上小箭Marker條帶，點擊左鍵，就會覺察此時該Band已經(jīng)變成黃色。您可以多點選幾MarkerBands〔3個，多多益善〕，然后回到“QuantityStandards框。這時框下部的表格變成可填寫狀態(tài)，在“Quantityug”中填入相應(yīng)的數(shù)字，每個數(shù)字對應(yīng)您剛剛標(biāo)記的作marker的Bands。后面的“Dilutionfactor”項可臨時不管；其他兩項“Lane”和“Match”主要用來一次性填入一條泳道Bands的標(biāo)記，填寫方法類似“Band”?，F(xiàn)在我們再次使用“Band-BandInformation”來查看我們感興趣的任何泳道上的條帶，是不是全部的信息都band的定量也直接給出了實際數(shù)字。到此我們的軌跡法定量最終告于一個段落了。QuantityOne供給的“Automationmanager”就可以把前面的繁瑣程序一步搞定了。不過我也不打算在這里教大家用這個工具了，由