第3章蛋白質(zhì)通性純化和表征

第3章蛋白質(zhì)的通性、純化和表征生物化學(xué).第一篇生物分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)生物化學(xué).第一篇生物分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)本章主要內(nèi)容一.蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三.蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四.蛋白質(zhì)的分離純化方法五.蛋白質(zhì)相對分子量質(zhì)量的測定六.蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)生物化學(xué).第一篇生物分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)第三章蛋白質(zhì)的通性，純化和表征1.1蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)從而使蛋白質(zhì)帶電。蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)，因而也具有特定的等電點(diǎn)。

蛋白質(zhì)兩性解離pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶的正電荷和負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)：沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH稱為等離子點(diǎn)。等離子點(diǎn)是每種蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和等離子點(diǎn)生物化學(xué).第一篇生物分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)第三章蛋白質(zhì)的通性，純化和表征當(dāng)溶液pH=pI時，蛋白質(zhì)粒子凈電荷為零，在電場中不移動；當(dāng)溶液pH＞pI時，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；當(dāng)溶液pH＜pI時，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。1.2在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同生物化學(xué).第一篇生物分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)第三章蛋白質(zhì)的通性，純化和表征2.1.分散體系

一種物質(zhì)以極小的顆粒（分散相）分散在另一種物質(zhì)（分散介質(zhì)）中所組成的體系。分散相質(zhì)點(diǎn)半徑<1nm:真溶液分散相質(zhì)點(diǎn)半徑介于1-100nm:膠體溶液分散相質(zhì)點(diǎn)半徑>100nm:懸濁液分散系二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀2.2膠體溶液保持穩(wěn)定的條件：①分散相質(zhì)點(diǎn)大小分子直徑在1-100nm范圍內(nèi)，這種大小的質(zhì)點(diǎn)在動力學(xué)上是穩(wěn)定的。②分散相質(zhì)點(diǎn)帶同種凈電荷，相互排斥，不易聚集成大顆粒而產(chǎn)生沉淀。③分散相質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層，相互間不易靠攏而聚集。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。Ⅰ可逆沉淀（非變性沉淀）：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或蛋白質(zhì)所帶電荷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解例如：等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等2.4.蛋白質(zhì)的沉淀

II.不可逆沉淀（變性沉淀）強(qiáng)烈沉淀條件破壞蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性也破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等2.5.1鹽析定義：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等]，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析。作用機(jī)制:中和電荷的同時破壞水化膜。優(yōu)點(diǎn):鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。2.5.蛋白質(zhì)沉淀方法如:甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀可引起蛋白質(zhì)變性

2.5.2有機(jī)溶劑沉淀法2.5.3重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液的PH＞PI時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，它容易與重金屬鹽（氯化高汞、硝酸銀、醋酸鉛等）中的重金屬離子（Hg2+、Cu2+、Ag2+）結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。2.5.4生物堿試劑和某些酸類沉淀法pH小于等電時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：單寧酸、苦味酸、鎢酸酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸和硝酸。原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。2.5.5等電點(diǎn)沉淀法反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反應(yīng)的Pr或aa雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫紅色二個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)及HNO3、HNO2混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)乙醛酸試劑沿管壁慢加濃H2SO4兩液層間出現(xiàn)紫色環(huán)

Trp坂口反應(yīng)Sakaguch反應(yīng))α-萘酚、N