乳兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性的觀察

乳兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性的觀察劉雷;韋慶軍;陳管雄;謝偉;陳歡目的:建立乳兔軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)的方法,觀察軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的MTTPCR)法觀24h2.MTTRTPCR【期刊名稱(chēng)】《廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》【年(卷),期】2014(031)003【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P364-368)【關(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);組織工程【作者】劉雷;韋慶軍;陳管雄;謝偉;陳歡【作者單位】廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021【正文語(yǔ)種】中文R-33目前研究中獲得軟骨細(xì)胞的來(lái)源主要是通過(guò)成年兔，但是過(guò)程較為復(fù)雜且獲得的提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法2劑與儀器：α-MEME（Hy-Clone）、胎牛血清（Gibco）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、胰蛋白酶（索萊寶）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma）、定量PCR試劑盒（Roche公司）、倒置相差顯微鏡（OlympusIX-70）、免疫組化試劑盒（中國(guó)北京中山公司）、DAB顯色試劑（中國(guó)武漢博士德公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。實(shí)驗(yàn)方法1PBS0.2530min20%胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)基終止1mm33～437℃3～4h150銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾，15mL離心管收集濾液在1000r/min下離心5min，棄上清液、加入20%胎牛血清及雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，吹打均勻接種于75cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。1×108CO248h2～3d80%PBS2～30.25%胰酶2mL20%胎牛血1000r/min5min，加含血清培養(yǎng)基1∶22、40.25%胰酶消化，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，每孔接種1×104/mL細(xì)胞，按200μL/孔接種于96孔板內(nèi)，分別于1，3，5，7，9d20μL/MTT4h，吸150μL/DMSO10min，使結(jié)晶物充分溶解，ThermoMK3492nm2，41，3，50.25%胰酶消化后，采用爬24（0.5mL/孔、2×104/孔），待軟骨細(xì)胞貼壁9515min，PBS215s氨水內(nèi)5min使細(xì)胞核藍(lán)化。自來(lái)水浸洗，置入伊紅染液內(nèi)10min染色。經(jīng)70%，80%，90%酒精各一次，95%酒精2次100%酒精3次逐級(jí)脫水。中性樹(shù)膠固定后，即可拍照。1，3，5420min15min，130min，洗去浮色，無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水，中性樹(shù)膠封片。即可拍照。Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色：對(duì)各代細(xì)胞采用爬片技術(shù)，420min。3%H2O2（無(wú)色液體）10min，PBS32～3h。PBS15min，PBS15min，PBSDAB性樹(shù)膠封片。RT-PCR6P1、P3P5TrizolP1、P3、P5RNA。然RT-PCRSPSS16.0（ANOVA）qP＜0.05結(jié)果從關(guān)節(jié)取下的軟骨呈乳白色，周?chē)M織覆蓋較少，用胰酶消化30min充分后，0.2%Ⅱ3～4h倒置顯微鏡觀察軟骨：通過(guò)酶消化法分離的原代軟骨細(xì)胞多呈球形懸浮在培養(yǎng)24h1a）。3～4d1b）。6～7d1c）。9～10d的軟骨細(xì)胞爬滿瓶壁，細(xì)胞之間相互連接似“鋪路石”樣（1d）131代細(xì)胞長(zhǎng)，呈中梭形改變。到第5，6代時(shí)，軟骨細(xì)胞形態(tài)明顯改變，呈長(zhǎng)梭形，與成纖維形態(tài)類(lèi)似。細(xì)胞蘇木精—伊紅和甲苯胺藍(lán)染色152）。甲苯胺藍(lán)染色：原代軟骨細(xì)胞被甲苯胺藍(lán)染色后，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)紫色的異染顆粒，尤其在生長(zhǎng)聚集的細(xì)胞區(qū)更為明顯，但經(jīng)多次傳代后，異染反應(yīng)逐漸減弱，表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色隨傳代次數(shù)的增加，其顏色逐漸變淺（見(jiàn)圖3）。Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色：原代軟骨細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原的表達(dá)較高，但同時(shí)也有較弱的Ⅰ型膠原表達(dá)。細(xì)胞染色后可見(jiàn)胞核周?chē)凹?xì)胞外基質(zhì)有黃褐色淡染區(qū)。經(jīng)多次傳代，Ⅰ型膠原表達(dá)逐漸升高，Ⅱ型膠原的表達(dá)逐漸減少（見(jiàn)圖4、圖5）。圖1倒置顯微鏡下觀察到的兔軟骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)（×100）a：軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)2d；b：軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)3～4d；c：軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)6～7d；d：軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)9～10d圖2軟骨細(xì)胞蘇木精—伊紅染色（×100）a：第1代軟骨細(xì)胞；b：第3代軟骨細(xì)胞；c：第5代軟骨細(xì)胞圖3軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色（×100）a：第1代軟骨細(xì)胞；b：第3代軟骨細(xì)胞；c：第5代軟骨細(xì)胞4軟骨細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組化染色（×100）a13c55軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化染色（×100）a13c5軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：體外培養(yǎng)的第2代，4代軟骨細(xì)胞，潛伏期為第1～3天，第3天后開(kāi)始增殖，第5天時(shí)增殖明顯，呈指數(shù)增長(zhǎng)。第7～10天后，由于細(xì)胞426）。圖6軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線RT-PCR：通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨代數(shù)次數(shù)增加Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)逐漸增加，第3，5代細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)均高于第1代細(xì)胞（P＜0.05），3，51（P＜0.05）3向發(fā)展（7）。圖7Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原在軟骨細(xì)胞中的基因表達(dá)＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001討論關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和致密的細(xì)胞外基質(zhì)組成，而細(xì)胞所占比例相對(duì)較少，如何快速有效的分離出高活性的軟骨細(xì)胞是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。1976年Manning等［1］首次成功報(bào)道了利用胰蛋白酶和細(xì)菌膠原酶聯(lián)合消化法，將軟骨細(xì)胞從堅(jiān)韌消化法和機(jī)械—酶消化法，國(guó)外常用的方法有Green［2］、Klagabrun［3］Shimomura［4］。但是通過(guò)酶消化法分離乳兔關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞的報(bào)道卻尚未見(jiàn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法，對(duì)乳兔關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行消化、分離出軟骨細(xì)胞，并觀察軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)生物學(xué)特性的變化。首先，我們利用胰蛋白酶具有較強(qiáng)的消化能力，將軟骨基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖分解和清除周?chē)街幕そM織。然后用Ⅱ型膠原酶對(duì)基質(zhì)內(nèi)的膠原網(wǎng)架進(jìn)行消化，在隨后的機(jī)械吹打中，便可將大量的軟骨細(xì)胞從松散的網(wǎng)架內(nèi)分離出來(lái)。軟骨細(xì)胞屬于低氧、低代謝細(xì)胞。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期單層培養(yǎng)及傳代次數(shù)增加后，軟骨細(xì)胞在體外的表型將難以維持，將會(huì)在細(xì)胞形態(tài)、表型及基因表達(dá)等方面發(fā)生變化，這種過(guò)程被稱(chēng)為軟骨的去分化現(xiàn)象［5］。單層培養(yǎng)過(guò)程中，隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加，細(xì)胞的形態(tài)也逐漸發(fā)生變化，原代軟骨細(xì)胞貼壁后多呈短梭形、圓形及星形，并且胞質(zhì)色深，胞核較圓。傳至第2～4代時(shí)出現(xiàn)形態(tài)變?yōu)橹兴笮?，形態(tài)多樣，待到第5代后細(xì)胞大部分呈長(zhǎng)梭形，而軟骨的梭形樣改變也是判斷軟骨細(xì)胞表型是否改變的標(biāo)志［6］。高密度培養(yǎng)時(shí)由于局部細(xì)胞因子濃度較高，使細(xì)胞與基質(zhì)間的反饋調(diào)節(jié)更為緊密，有利于細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和基質(zhì)沉積。若為低密度培養(yǎng)則不利于保持細(xì)胞表型及保持基質(zhì)新陳代謝的平衡。所以在體外培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意接種的密度。軟骨細(xì)胞傳代前后細(xì)胞的功能變化，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)少量出現(xiàn)，原代細(xì)胞較明顯。經(jīng)多次傳代后染色多呈陰性。從而證明隨傳代次數(shù)的增加，軟骨細(xì)胞分泌氨基多糖的能力下降。Ⅱ型膠原是軟骨中的主要膠原成分，由軟骨細(xì)胞分泌，通過(guò)Ⅱ型膠原免疫組化染色可見(jiàn)軟骨細(xì)胞的胞核周?chē)庶S褐色，并且胞外有黃褐色顆粒。經(jīng)傳代染色逐漸減弱，而且細(xì)胞形態(tài)多呈長(zhǎng)梭形，向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步失去了表達(dá)Ⅱ型膠原和分泌氨基多糖的能力［7，8］。其生長(zhǎng)速度也明顯快于正常軟骨細(xì)胞。因此，正常軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)，無(wú)法長(zhǎng)期保持其生物學(xué)特性，隨傳代次數(shù)增加其分泌和增殖能力下降，并且向去分化轉(zhuǎn)變。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇3代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞不僅生長(zhǎng)良好，而且保持自身的生物學(xué)特性，適用于后期實(shí)驗(yàn)及軟骨組組工程的需要。綜上所述，通過(guò)采用兩步酶消化法，成功從乳兔關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)提取出軟骨細(xì)胞。并較以往采用的成年兔取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法，能更加方便、快捷的獲得大量生物活性好，純度高的軟骨細(xì)胞。通過(guò)觀察了解軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性，為進(jìn)一步實(shí)施體外大量培養(yǎng)軟骨細(xì)胞和維持細(xì)胞生物學(xué)特性的研究做了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為組織工程軟骨的研究提供了種子細(xì)胞的來(lái)源。參考文獻(xiàn)：［1］ManningWK，BonnerWMJr.Isolationandcultureofchondrocytesfromhumanarticularcartilage［J］.ArthritisRheum，1967，10（1）：235-239.［2］GreenWTJr.Behaviorofarticularchondrocytesincellculture［J］.ClinOrthopRelatRes，1971，75：248-260.［3］KlagsbrunM.Large-scalepreparationofchondrocytes［J］.MethodsEnzymol，1979，58（8）：560-564［4］ShimomuraY，YonedaT，SuzukiF.Osteogenesisbychondrocytesfromgrowthcartilageofratrib［J］.CalcifTissueRes，1975，19（3）：179-187.［5］ChanCK，AnastassiadesTP.Anionicglycoconjugatesfromdifferentiatedanddedifferentiatedculturesofbovinearticularchondrocytes：modulationbyTGF-beta［J］.InVitroCellDevBiolAnim，1998，34（6）：492-498.［6］HoshibaT，YamadaT，LuH，etal.Nucleardeformationandexpressionchangeofcartilaginousgenesduringinvitroexpansionofchondrocytes［J］.BiochemBiophysResCommun，2008，374（4）：688-692.［7］KleinGR，VaccaroAR，AlbertTJ，etal.Efficacyofmagneticresonanceimagingintheevaluationofposteriorcervicalspinefractu