薄板層析法鑒定四環(huán)素純

會計學1薄板層析法鑒定四環(huán)素純生物分離工程實驗I基礎實驗：第11/12周薄板層析法鑒定四環(huán)素成品純度第14周PEG400/(NH4)2SO4兩水相系統(tǒng)相圖的制作第15周兩水相系統(tǒng)中蛋白質分配系數(shù)的測定第16周離子交換樹脂總交換容量的測定第1頁/共23頁實驗內容及時間薄板層析法鑒定四環(huán)素純度

實驗一班：第11周周一，周四實驗二班：第12周周一，周四兩水相萃取相圖制作

實驗一班：第14周周一

實驗二班：第14周周四兩水相萃取蛋白質分配系數(shù)測定

實驗一班：第15周周一

實驗二班：第15周周四離子交換樹脂總交換容量的測定

實驗一班：第16周周一

實驗二班：第16周周四第2頁/共23頁實驗時間安排表周次日期星期時間發(fā)酵實驗5-212分離實驗5-112115月6日星期一13:30

實驗一班5月9日星期四13:30

實驗一班125月13日星期一13:30

實驗二班5月16日星期四13:30

實驗二班135月20日星期一13:30實驗二班

5月23日星期四13:30實驗一班

145月27日星期一13:30實驗二班實驗一班5月30日星期四13:30實驗一班實驗二班156月3日星期一13:30實驗二班實驗一班6月6日星期四13:30實驗一班實驗二班166月8日星期六13:30實驗二班實驗一班6月13日星期四13:30實驗一班實驗二班176月17日星期一13:30實驗二班

6月20日星期四13:30實驗一班

第3頁/共23頁考核方式考勤提問和操作實驗報告：預習報告

實驗結果、討論、思考題第4頁/共23頁薄板層析法鑒定四環(huán)素純度第5頁/共23頁加深對薄板層析法基本原理的理解。熟悉薄板層析法的操作過程。采用薄板層析法來考察四環(huán)素制品純度。一、目的和要求第6頁/共23頁（一）層析：色譜chromatography一種分離技術。任何層析都具有兩個相，固定相固定不動，流動相對固定相作相對運動。不同物質在兩相間分配差異，隨流動相以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。固定相：固體或液體(固定在載體上)流動相：流過固定相的液體、氣體或超臨界流體。二、實驗原理第7頁/共23頁（二）層析方法：根據(jù)機理可以分為：分配層析吸附層析凝膠層析離子交換層析親和層析二、實驗原理根據(jù)層析的方式：紙層析薄層層析柱層析第8頁/共23頁（三）薄板層析（TLC）利用不同溶質組分在固定相和流動相的兩種液體中分配系數(shù)不同，展層時形成以不同速度移動的區(qū)帶，達到分離。溶質易分配在固定相中溶質易分配在流動相中二、實驗原理移動速度慢。移動速度快。第9頁/共23頁利用阻滯因子Rf值來表征各組分的差別移動：0<Rf<1,適宜范圍0.2~0.8二、實驗原理溶質移動距離

同一時間流動相移動距離Rf=第10頁/共23頁二、實驗原理固定相：一般為水及各種水溶液、甲酰胺、低級醇等。流動相（展層劑）：與水不溶（或微溶）的有機溶劑。

薄板層析法：支持物:中性、多孔粉末、無吸附活性、流動相自由通過——硅藻土/纖維素/硅膠/氧化鋁等，親水物質能儲留水。本實驗為硅藻土。本實驗為吸附在硅藻土上的EDTA緩沖液。本實驗為丙酮:乙酸乙酯:氯仿=3:1:1第11頁/共23頁（四）四環(huán)素廣譜抗生素四環(huán)素發(fā)酵或保管不當時，生成抗菌作用弱，毒性強的差向四環(huán)素。四環(huán)素易溶于流動相液體，差向四環(huán)素易溶于固定相液體。氫化駢四苯環(huán)（含共軛雙鍵，可紫外吸收，熒光）

二、實驗原理第12頁/共23頁本實驗所需儀器玻璃板研缽天平移液管硅藻土EDTA緩沖液飽和氯化銨缸+架子展層劑展層缸點樣毛細管小刀和直尺紫外燈氨水三、主要實驗器材與試劑第13頁/共23頁（一）溶液配制（已配置）硅藻土處理：取薄板層析用硅藻土50g，加25ml濃鹽酸和250ml水，攪拌煮沸10min，冷卻，過濾，用蒸餾水洗，直至洗液對剛果紅指示劑不顯顏色，然后用流動相液體洗滌，過濾，105℃烘箱干燥。EDTA緩沖液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，搖勻即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保濕），再加入950mlpH70.1MEDTA（鰲合）溶液，混勻即得EDTA緩沖液。展層劑（流動相）：取pH7EDTA溶液5ml，緩慢加在200ml（丙酮:氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展層缸中。樣品配制：稱取100mg成品四環(huán)素，溶于5ml甲醇中得2%（W/V）溶液。四、實驗方法第14頁/共23頁硅藻土

1g研缽EDTA緩沖液2ml蒸餾水0.75ml研勻（顆粒適中、無氣泡）置飽和NH4Cl缸室溫放置無明顯水漬厚度涂均勻，特別下邊緣涂滿平整（二）層析操作四、實驗方法第15頁/共23頁第16頁/共23頁0.5cm15cm1.5cm均勻無氣泡無裂紋毛細管點樣點樣點甲醇揮發(fā)干后，將板放入展層缸內，密封晾干，氨氣熏，紫外燈下觀察分別求兩種組分的Rf值量距離展層劑0.5cm樣點高于液面

溶質移動距離

同一時間流動相移動距離Rf=第17頁/共23頁第18頁/共23頁操作注意點

制板：在研缽中研磨時應緩慢，注意不能產(chǎn)生氣泡。薄板移入飽和氯化銨的缸中時，不宜太干或太濕，以無明顯水漬為宜。太干展層太快，引起拖尾；太濕展層太慢。點樣：點樣時，盡量使點樣斑點直徑小。點樣后，待溶劑揮發(fā)后再移入展層缸內，不要用電吹風。展層：注意展層劑浸沒薄層的一端約0.5cm，不能浸沒樣品斑點。層析缸蓋子應蓋密，減少溶劑揮發(fā)。第19頁/共23頁實驗結果和討論（一）預習四環(huán)素的硅藻土薄板層析屬于哪一種層析機制。固定相和流動相分別是什么？為了使層析效果好（不拖尾，分離好），操作中注意事項。（二）實驗結果和討論在紙上描繪出薄板上斑點的圖形，量出各斑點組分的距離，計算Rf值。分析實驗結果。總結本實驗成功或失敗的經(jīng)驗教訓。五、思考題第2