高三理化生培養(yǎng)基

試驗(yàn)三常用培育基的制備、滅菌與消毒試驗(yàn)?zāi)康模毫私馀嘤呐渲圃聿⑶荫{馭配制培育基的一般方法和步驟

培育基是人工配制的，適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的養(yǎng)分基質(zhì)原則:目的明確;養(yǎng)分協(xié)調(diào);限制pH、滲透壓等條件;經(jīng)濟(jì)節(jié)約方法：查閱文獻(xiàn);細(xì)心設(shè)計(jì);試驗(yàn)比較

步驟：稱量、熔化、調(diào)PH、過濾、分裝、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查

培育基種類:一、按成份的不同劃分自然培育基、合成培育基、半合成培育基二、按培育基的物理狀態(tài)劃分固體培育基、液體培育基、半固體培育基三、按培育基用途劃分基礎(chǔ)培育基、加富培育基、鑒別培育基、選擇培育基

牛肉膏蛋白胨培育基牛肉膏蛋白胨培育基是一種應(yīng)用最廣泛和最一般的細(xì)菌基礎(chǔ)培育基。其配方如下：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.0～7.2(后調(diào))高氏1號(hào)培育基高氏1號(hào)培育基是用于分別和培育放線菌的合成培育基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。查氏合成培育基查氏合成培育基是用來分類和培育霉菌的培育基,其配方如下：NaNO33g,K2HPO41g,KCl0.5g,MgSO4.7H2O0.5g,FeSO40.01g,蔗糖30g,水1000mL,pH自然麥芽汁培育基用來培育酵母菌,干麥芽粉加4倍水,在50-60℃保溫糖化3-4小時(shí)，運(yùn)用碘液試驗(yàn)檢查,至糖化完全為止,調(diào)整糖液濃度,煮沸后，過濾，調(diào)pH為6.0。消毒與滅菌消毒：殲滅病原菌和有害微生物的養(yǎng)分體滅菌：殺滅一切微生物的養(yǎng)分體，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加熱、過濾、輻射化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。加熱法：干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160－170℃）加熱滅菌1－2h，適用于玻璃器皿和培育皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。3、留意事項(xiàng)：1）培育基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；2）溫度限制在<180℃；3）物品不能太擠；4）溫度降至70℃時(shí)才開箱門。濕熱法：原理：因?yàn)闈駸嶂芯w吸水，蛋白質(zhì)簡(jiǎn)潔凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。高壓蒸汽滅菌法：1、設(shè)備：高壓滅菌鍋2、時(shí)間長(zhǎng)短依據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變更。3、適用于培育基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。4、留意事項(xiàng)：1）冷空氣徹底解除；2）加水；3）壓力降為“0”時(shí)方可打開。在運(yùn)用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的解除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同重量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見表2常壓蒸汽滅菌：

對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培育基如明膠培育基、牛乳培育基，含糖培育基等可接受此法。徹底滅菌則接受間歇滅菌方法。煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時(shí)間10－15min，超高溫殺菌135-150°C和2-8s對(duì)牛乳和其它液態(tài)食品滅菌。優(yōu)點(diǎn)：保持食品價(jià)值和養(yǎng)分成分。

過濾除菌：

原理：介質(zhì)在有壓力時(shí)阻隔微生物。適用范圍：很多材料如血清、抗生素及糖溶液接受此法。設(shè)備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。優(yōu)缺點(diǎn)：不破壞培育基成分，只適用少量濾液。留意事項(xiàng)：1、壓力適當(dāng)；2、無菌條件下進(jìn)行；3、防止?jié)B透現(xiàn)象。輻射滅菌：

原理：紫外線波長(zhǎng)在200－300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強(qiáng)。此段波長(zhǎng)易被細(xì)胞中核酸吸取；可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。缺點(diǎn)：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。應(yīng)用：無菌室，醫(yī)院。留意事項(xiàng)：對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用。

化學(xué)藥品滅菌：

原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。殺菌劑如重金屬離子；抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。留意：與藥品的濃度凹凸，時(shí)間長(zhǎng)短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等

分別與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。為什么要進(jìn)行純培育：平板上的單一菌落并不確定保證是一種菌。常用的分別、純化方法：?jiǎn)渭?xì)胞挑取法、稀釋涂布平板法稀釋混合平板法、平板劃線法試驗(yàn)四微生物的分別、純化及培育技術(shù)稀釋涂布平板法：步驟：1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培育基，高氏I號(hào)培育基，查氏培育基冷卻至55-60℃時(shí)，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培育基倒4皿，高氏I號(hào)培育基和查氏培育基各倒3皿。2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。3、涂布：將上述每種培育基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無菌吸管從最終三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對(duì)號(hào)放入平板上，用玻棒涂布。4、培育：高氏I號(hào)和查氏倒置培育于28℃培育箱中培育3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培育基在37℃培育1-2days。5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一樣，保存。

平板劃線法：1、倒平板，標(biāo)記培育基名稱，編號(hào)和試驗(yàn)日期。2、劃線方法稀釋混合平板法：1、先加菌2、倒平板時(shí)留意培育基溫度3、混合勻整微生物培育技術(shù)1、斜面接種2、液體培育基接種3、穿刺接種將已接種的斜面、半固體和液體培育基放置培育箱中培育將生長(zhǎng)好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。視察菌落形態(tài)并記錄序號(hào)來源大小形態(tài)邊緣顏色表面代謝物種類試驗(yàn)五：放線菌及霉菌形態(tài)視察目的要求1.了解放線菌、霉菌的形態(tài)視察的原理。2.學(xué)習(xí)并駕馭視察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法。3.初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征。放線菌是一群絲狀，G+的細(xì)菌，在氣生菌絲末端形成孢子。細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，最適pH與細(xì)菌相像。主要以孢子方式進(jìn)行無性繁殖。其DNA堿基組成中GC含量特殊高。超過任何已知的細(xì)菌。很多臨床應(yīng)用的抗生素都由鏈霉菌種產(chǎn)生。

放線菌(Actinomycetes)分生孢子絲瓊脂表面基內(nèi)菌絲氣生菌絲Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基內(nèi)菌絲）andaerialmycelium（氣生菌絲）withchainsofconidiospores（分生孢子）分生孢子絲瓊脂表面基內(nèi)菌絲氣生菌絲Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基內(nèi)菌絲）andaerialmycelium（氣生菌絲）withchainsofconidiospores（分生孢子）放線菌生長(zhǎng)到確定階段，大部分氣生菌絲分化成孢子絲，通過橫割分列的方式產(chǎn)生成串的分生孢子。孢子絲形態(tài)多樣，有直、彎曲、鉤狀、螺旋狀、輪生等多種形態(tài)。孢子也有球形、橢圓形、桿狀和瓜子狀等等。它們的形態(tài)構(gòu)造都是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。放線菌的菌落早期絨狀同細(xì)菌菌落月牙狀相像，后期形成孢子菌落呈粉狀、干燥，有各種顏色呈同心圓放射狀。鏈霉菌的各種孢子絲結(jié)構(gòu)鏈霉菌的分別：pH中性偏堿喜干（含水少）接受含各種無機(jī)鹽的選擇性培育基已知放線菌能夠產(chǎn)生500多種抗生素。大多數(shù)抗生素對(duì)不同的細(xì)菌有獨(dú)特的療效有50多種被實(shí)際應(yīng)用Antibiotics放線菌Actinomycetes

霉菌(molds)是絲狀真菌的總稱,即“發(fā)霉的真菌”。通常指菌絲體比較發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型子實(shí)體的真菌。常在潮濕的氣候下大量生長(zhǎng)繁殖。形態(tài)特征（Morphologicalcharacteristics）屬異養(yǎng)型真核生物，具有絲狀或管狀結(jié)構(gòu)，單個(gè)分支稱為菌絲。菌絲形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)稱為菌絲體。養(yǎng)分菌絲（vegetativemycelium）：吸取養(yǎng)分氣生菌絲（aerialmycelium）繁殖菌絲:孢子絲，進(jìn)行繁殖。分類（classification）有隔菌絲：有隔菌絲中有橫隔膜將菌絲分隔成多個(gè)細(xì)胞，在菌絲生長(zhǎng)過程中細(xì)胞核的分裂伴隨著細(xì)胞的分裂，每個(gè)細(xì)胞含有一至多個(gè)細(xì)胞核。橫隔膜可以使相鄰細(xì)胞之間的物質(zhì)相互溝通。如曲霉和青霉。無隔菌絲：菌絲中無橫膈膜，整個(gè)細(xì)胞是一個(gè)單細(xì)胞，菌絲內(nèi)有很多核，在生長(zhǎng)過程中只有核的分裂和原生質(zhì)體質(zhì)量的增加，沒有細(xì)胞數(shù)目的增多。如毛霉和根霉。nonseptate(2)septate繁殖方式無性繁殖：芽生孢子節(jié)孢子孢囊孢子后垣孢子分生孢子有性繁殖：卵孢子接合孢子子囊孢子Sporangiospores

孢囊孢子（Sporangiosporesareformedwithinasporangium）節(jié)孢子Arthrospores分生孢子Conidiospores卵孢子（Oospores）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOosporesformation接合孢子Zygospores接合孢子形成過程子囊孢子Ascospores幾種常見霉菌屬主要特征分布作用與用途根霉屬菌絲無隔,單細(xì)胞迅速蔓延,有假根,孢子囊呈黑色,產(chǎn)生孢子囊和接合孢子常長(zhǎng)在淀粉類食品上如饅頭、面包、甘薯等能將淀粉轉(zhuǎn)化為糖，用于生產(chǎn)糖化酶，釀造甜酒等曲霉屬菌絲分隔，分生孢子梗頂端膨大，頂囊上生輻射狀小梗菌落疏松、顏色多樣空氣、谷物、土壤和各種有機(jī)物上分解淀粉和蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，用于制曲、制醋、生產(chǎn)檸檬酸、酶制劑及糖化飼料等青霉屬菌絲分隔，孢子梗呈掃帚形，菌落由緊密到疏松，多呈藍(lán)綠色空氣、土壤及物品上，腐爛的柑橘上更多青霉素產(chǎn)生菌，也用于制備農(nóng)用抗生素和發(fā)酵飼料根霉根霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)曲霉曲霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)左側(cè)分生孢子梗具有一層小梗；右側(cè)分生孢子梗具有二層小梗青霉青霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)A單輪型B非對(duì)稱型C對(duì)稱二輪型試驗(yàn)內(nèi)容人們?cè)O(shè)計(jì)了各種培育和視察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌和霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)特征。本試驗(yàn)接受插片法。插片法:

倒平板→插片→接種→培育→鏡檢→記錄繪圖壓印法:

倒平板→劃線接種→挑取菌落→加蓋玻片→鏡檢→記錄繪圖埋片法:

倒瓊脂→切槽→接種→培育→鏡檢→記錄繪圖倒平板

將培育基熔化后，倒10-12毫升左右于滅菌培育皿內(nèi)，凝固后運(yùn)用.

插片

將滅菌的蓋玻片以45度角插入培育皿內(nèi)的培育基中，插入深約為1/2或1/3。接種與培育

用接種環(huán)將菌種接種在蓋玻片與瓊脂相接的沿線，放置28℃培育3～7天。視察

培育后菌絲體生長(zhǎng)在培育基及蓋玻片上，當(dāng)心用鑷子將蓋玻片抽出，輕輕擦去生長(zhǎng)較差的一面的菌絲體，將生長(zhǎng)良好的菌絲風(fēng)光 對(duì)的載玻片，壓放于載玻片上。干脆在顯微鏡下視察。

關(guān)鍵步驟及留意事項(xiàng)

倒平板要厚一些，接種時(shí)劃線要密。插片時(shí)要有確定角度并與劃線垂直。視察時(shí)，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當(dāng)視野，更換高倍鏡視察。假如用0.1%美藍(lán)對(duì)培育后的蓋玻片進(jìn)行染色后視察，效果會(huì)更好。試驗(yàn)六、菌種保藏幾種常用的保藏方法：1、傳代培育法保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培育基（用于厭氧細(xì)菌）培育好后，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培育、再存放。可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進(jìn)一步延長(zhǎng)保存期。2、載體法使生長(zhǎng)合適的微生物吸附在確定的載體上進(jìn)行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。3、懸液法將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在確定的溶液中保存。溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。4、冷凍法使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。留意限制降溫速率及疼惜劑的運(yùn)用。5、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和L－干燥法。冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。L-干燥法則不須要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在10－20C?范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。操作方法

1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培育基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，一般細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)潔、運(yùn)用便利，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。2、液體石蠟保藏法將無菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法好用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，一般細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培育菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。4、砂土管保藏法

（1）河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最終一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（２）土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。(3)砂土混合處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或依據(jù)須要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)勻整后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左