儀分第15、16、17章色譜法

儀器分析

InstrumentAnalysis

儀器分析教研室Companyname傳統(tǒng)分離方法，如：分離分析篇蒸餾萃取結(jié)晶沉淀過濾電解Companyname現(xiàn)代常用的分離技術(shù)：分離分析篇色譜法(chromatography)固相萃取微濾、超濾反滲透離子交換復(fù)雜混合物？分析？Companyname茨維特實(shí)驗(yàn)：用石油醚洗脫植物葉子提取物實(shí)驗(yàn)存在兩相：固定相:

碳酸鈣流動(dòng)相:

石油醚15.1色譜法引論Companyname固定相:氧化鋁流動(dòng)相:95%乙醇混合物甲基橙、亞甲藍(lán)的分離裝置圖15.1色譜法引論Companyname薄層色譜法和紙色譜法15.1色譜法引論Companyname色譜法：

固定相（stationaryphase）：流動(dòng)相（mobilephase）：色譜柱（chromatographiccolumn）：

15.1色譜法引論保留組分；洗脫組分并攜帶組分運(yùn)動(dòng)的流體；一種內(nèi)有固定相，用以分離混合物的柱管適合于復(fù)雜混合物的一種分離分析技術(shù)；Companyname色譜法分類：根據(jù)流動(dòng)相的狀態(tài)氣相色譜法（GC）氣－固色譜氣－液色譜液相色譜法

(LC)液－固色譜液－液色譜超臨界流體色譜法SFC15.1色譜法引論Companyname平面色譜法色譜法分類：根據(jù)固定相狀態(tài)紙色譜法薄層色譜法柱色譜法填充色譜柱法（LC用）毛細(xì)管柱色譜法（GC用）15.1色譜法引論Companyname載體+固定液+組分溶解作用填充柱色譜法15.1色譜法引論色譜柱截面圖Companyname毛細(xì)管柱色譜法固定液溶解作用毛細(xì)管色譜柱色譜柱截面圖+組分15.1色譜法引論Companyname色譜法分類：根據(jù)分離機(jī)理吸附色譜分配色譜尺寸排阻色譜離子交換色譜親合色譜

15.1色譜法引論Companyname色譜法的特點(diǎn)：分離效率高靈敏度高：可以檢測出pg.g-1(10-12)級甚至更低的量。分析速度快應(yīng)用范圍廣

15.1色譜法引論Companyname色譜法的應(yīng)用藥物開發(fā)、藥物質(zhì)量控制臨床檢驗(yàn)食品安全環(huán)境保護(hù)軍事領(lǐng)域公安、法醫(yī)、國家安全部門石油、化工體育、娛樂15.1色譜法引論Companyname中國制藥實(shí)驗(yàn)室是目前分離技術(shù)最大的消費(fèi)群，占據(jù)了24%的分離技術(shù)市場需求份額，在2012年達(dá)到2億美元的消費(fèi)額。色譜法的應(yīng)用：15.1色譜法引論Companyname色譜儀基本構(gòu)造DetectorCarriergasFloworpressurecontrollerInjectionportColumnDatastation(Recorder)氣相色譜流程圖15.1色譜法引論CompanynamePUMPDetectorDatastation(Recorder)ColumnMobilephase液相色譜流程圖色譜儀基本構(gòu)造15.1色譜法引論Companyname15.2色譜流出曲線（chromatogram）：Companyname基線基線t信號色譜峰15.2色譜流出曲線Companyname保留值死時(shí)間t0

保留時(shí)間tr

調(diào)整保留時(shí)間tr’trtr’=tr-t0基線tr’t0進(jìn)樣空氣峰t信號-定性分析15.2色譜流出曲線Companyname峰高h(yuǎn)與峰面積A區(qū)域?qū)挾葮?biāo)準(zhǔn)偏差σ峰底寬度W半峰寬W1/2信號基線進(jìn)樣hW1/2Wh/2t-柱效-定量分析15.2色譜流出曲線Companyname根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可判斷樣品所含的最少組分?jǐn)?shù)。根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析。根據(jù)色譜峰的面積或峰高,可以進(jìn)行定量分析色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾仁窃u價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)色譜峰兩峰間的距離，是評價(jià)固定相(或流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。15.2色譜流出曲線Companyname1.色譜法具有同時(shí)能進(jìn)行

和

的特點(diǎn)而區(qū)別于其它方法，特別對

和

的分離，色譜法的優(yōu)勢更為明顯。2.按固定相外形不同色譜法是如何分類的？3.什么是氣相色譜法和液相色譜法？4.保留時(shí)間、死時(shí)間及調(diào)整保留時(shí)間的關(guān)系是怎樣的？5.從色譜流出曲線可以得到哪些信息？練習(xí)Companyname15.3色譜分離優(yōu)化Companyname15.3色譜分離優(yōu)化Companyname15.3色譜分離優(yōu)化Companyname供試品主成分峰達(dá)到最小理論塔板數(shù)要求定量峰與其他峰分離度應(yīng)大于1.5重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%拖尾因子（T）：用于評價(jià)色譜峰的對稱性T應(yīng)在0.95～1.05間藥典規(guī)定色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn):Companyname分離度（Resolution,R）15.3色譜分離優(yōu)化Companyname意義：分離度可作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)R=1.0基本分離不同R值色譜峰分離程度R<1部分重疊R=1.5完全分離15.3色譜分離優(yōu)化第一個(gè)和第二個(gè)峰之間的分離度計(jì)算答案_________Companyname色譜基本分離方程式n

柱效選擇因子k容量因子15.3色譜分離優(yōu)化Companyname選擇因子意義:表示兩組分在給定柱子上的選擇性，值越大說明柱子的選擇性越好。=1.1=1.4=1.815.3色譜分離優(yōu)化Companyname選擇因子影響峰的間距組分性質(zhì)越接近越難分離增大柱選擇性是改善分離度的最有力手段主要受固定相、流動(dòng)相性質(zhì)以及柱溫影響,改變固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)和組成，可有效增大。選擇因子與分離度R15.3色譜分離優(yōu)化Companyname改變固定相對分離選擇性的影響15.3色譜分離優(yōu)化CompanynamemAU保留時(shí)間(min.)80%乙腈20%水246810改變流動(dòng)相對分離選擇性的影響15.3色譜分離優(yōu)化Companyname容量因子可由色譜圖測得容量因子是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)k=tr’

t0

容量因子-分離度15.3色譜分離優(yōu)化容量因子對分離度的影響Rk0246810理想的k

范圍改變k對分離度幾乎沒有影響改變k對分離度影響最大12141615.3色譜分離優(yōu)化容量因子對分離度的影響:當(dāng)k在0到5的范圍內(nèi)時(shí)，利用保留作用來提高分離度是最有效的.15.3色譜分離優(yōu)化影響峰位，主要受固定相與流動(dòng)相的性質(zhì)及固定相用量、流動(dòng)相的組成（LC)、柱溫(GC)和流動(dòng)相流速的影響Companyname柱效與分離度15.3色譜分離優(yōu)化Companyname色譜分離過程示意圖反復(fù)分配15.3色譜分離優(yōu)化Companyname理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計(jì)算H=n=16trW2=5.54trW1/22Ln理論塔板數(shù)和理論塔板高度是衡量柱效的指標(biāo)。在說明柱效時(shí)，需說明是對什么物質(zhì)而言。tRWWi/2保留時(shí)間B進(jìn)樣15.3色譜分離優(yōu)化計(jì)算柱效CompanynameVanDeemter（范第姆特）方程簡式μ：流動(dòng)相的線速A：渦流擴(kuò)散系數(shù)B：分子擴(kuò)散系數(shù)C：傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)速率理論15.3色譜分離優(yōu)化Companyname初始譜帶最終譜帶寬度寬度渦流擴(kuò)散使用細(xì)而均勻的顆粒并填充均勻是減少渦流擴(kuò)散和提高柱效的有效途徑。空心毛細(xì)管柱沒有渦流擴(kuò)散。15.3色譜分離優(yōu)化Companyname減少分子擴(kuò)散：分子擴(kuò)散濃度梯度造成縱向擴(kuò)散。flash1.可采用相對分子質(zhì)量較大的流動(dòng)相3.短柱、低溫2.較高的流動(dòng)相流速4.在LC中作用小15.3色譜分離優(yōu)化Companyname傳質(zhì)阻力15.3色譜分離優(yōu)化Companyname傳質(zhì)阻力15.3色譜分離優(yōu)化產(chǎn)生原因：樣品在兩相分配，樣品未及進(jìn)入固定相就被帶走，或在固定相中延遲重入流動(dòng)相從而造成峰擴(kuò)張。降低傳質(zhì)阻力：減小固定液的液膜厚度，用分子量小的流動(dòng)相，較低的流速。CompanynameH–u關(guān)系曲線u最佳uHB/uC·uH最小擴(kuò)散-各項(xiàng)的貢獻(xiàn)：A15.3色譜分離優(yōu)化續(xù)前柱效和分離度小結(jié)：15.3色譜分離優(yōu)化柱效影響色譜峰的寬窄根據(jù)速率理論，降低板高主要取決于色譜柱性能、固定液液膜厚度、流動(dòng)相的性質(zhì)和流速，柱溫等。提高柱效、改善分離的途徑：增加柱長；降低板高。Companyname拖尾因子：評價(jià)峰形的參數(shù)，目的是為了保證色譜分離效果和測量精度。15.3色譜分離優(yōu)化Companyname拖尾因子：5%峰高處峰寬與峰頂點(diǎn)至前沿的距離比，常用T來表示。T=W0.05h/2f15.3色譜分離優(yōu)化《中國藥典》規(guī)定定量時(shí)T應(yīng)該在0.95-1.05之間，低于0.95為前延峰，高于1.05為拖尾峰。AnalyticalEducationCenterBLC2-10TimeinMinutes增大k'增加選擇性提高柱效分離優(yōu)化小結(jié)：對于常規(guī)分析工作，一般選用：選擇因子α來評價(jià)固定液有效塔板數(shù)N有效來評價(jià)色譜柱與分離條件以分離度R作為柱的總分離效能指標(biāo)t0初始改變?增加?增加?t練習(xí)請指出每種情況改變了分離度公式中的哪個(gè)參數(shù):n,k,or.練習(xí)1.列出提高樣品組分保留作用的三種方法.2.列出減小色譜峰寬的四種方法.3.下面參數(shù)中哪些影響柱效?

洗脫強(qiáng)度

流動(dòng)相黏度

固定相的顆粒度

柱長

色譜柱溫度練習(xí)例：已知物質(zhì)A和B在一根30.0cm長的柱上的保留時(shí)間分別為

16.40和17.63min，不被保留組分通過該柱的時(shí)間為1.30min，峰底寬為1.11和1.21min，試計(jì)算（1）柱的分離度（2）柱的平均塔板數(shù)（3）塔板高度（4）達(dá)1.5分離所需柱長解：練習(xí)解：例：已知物質(zhì)A和B在一根30.0cm長的柱上的保留時(shí)間分別為

16.40和17.63min，不被保留組分通過該柱的時(shí)間為1.30min，峰底寬為1.11和1.21min，試計(jì)算（1）柱的分離度（2）柱的平均塔板數(shù)（3）塔板高度（4）達(dá)1.5分離所需柱長續(xù)前例：已知物質(zhì)A和B在一根30.0cm長的柱上的保留時(shí)間分別為

16.40和17.63min，不被保留組分通過該柱的時(shí)間為1.30min，峰底寬為1.11和1.21min，試計(jì)算（1）柱的分離度（2）柱的平均塔板數(shù)（3）塔板高度（4）達(dá)1.5分離所需柱長Companyname1.什么是選擇因子？它表征的意義是什么？2.什么是分配比（即容量因子）？它表征的意義是什么？3.

是衡量柱效的指標(biāo)，色譜柱的柱效隨

的增加而增加，隨

的增大而減小。4.板高、柱效及柱長三者的關(guān)系（公式）？5.利用色譜圖如何計(jì)算理論塔板數(shù)（公式）？思考題Companyname6.同一色譜柱對不同物質(zhì)的柱效能是否一樣7.塔板理論對色譜理論的主要貢獻(xiàn)是怎樣的？8.速率理論的簡式,影響板高的是哪些因素?9.

可作為色譜柱的總分離效能指標(biāo).10.如何根據(jù)分離度分析色譜分離的情況?思考題Companyname定義：采用氣體作為流動(dòng)相的一種色譜法。§16.1氣相色譜法概述分為氣固吸附色譜和氣液分配色譜氣體做流動(dòng)相對分離所起作用較小，主要基于溶質(zhì)和固定相的作用。氣體的黏度小，在色譜柱內(nèi)流動(dòng)的阻力小，同時(shí)氣體擴(kuò)散系數(shù)大，組分在兩相間傳質(zhì)速率快，有利于快速高效分離。Companyname§16.1氣相色譜法概述局限：定性困難；不能分析分子量大、極性強(qiáng)或熱不穩(wěn)定的化合物。適用于沸點(diǎn)較低,較易揮發(fā)并且熱穩(wěn)定性好的化合物特點(diǎn)：高選擇性、高柱效、高靈敏度、快速。Companyname16.2氣相色譜儀包括：載氣系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、溫控和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Companyname固定液要求一般為高沸點(diǎn)有機(jī)化合物。對試樣各組分有適當(dāng)?shù)娜芙饽芰?選擇性好;揮發(fā)性小，熱穩(wěn)定性好;化學(xué)穩(wěn)定性好。16.3分離系統(tǒng)Companyname烴類硅氧烷類

醇類和醚類酯類和聚酯腈和腈醚等固定液的分類弱極性弱極性到強(qiáng)極性強(qiáng)極性中強(qiáng)極性強(qiáng)極性16.3分離系統(tǒng)Companyname聚硅氧烷類16.3分離系統(tǒng)Companyname聚硅氧烷類是目前應(yīng)用最廣泛的通用型固定液。聚硅氧烷類硅氧烷類經(jīng)不同的基團(tuán)修飾可得到不同極性的固定相。具有很高的熱穩(wěn)定性和液態(tài)溫度范圍(50～350℃)，16.3分離系統(tǒng)固定相組成J&WSGE極性100%甲基聚硅氧烷DB-1BP-1非極性5%苯基甲基聚硅氧烷DB-5BP-5弱極性

聚乙二醇DB-WaxBP-20強(qiáng)極性50%苯基甲基聚硅氧烷DB-17BP-17中極性

常用固定相Companyname固定液的選擇：固定液選擇的一般規(guī)律—相似相溶原則非極性和極性混合物試樣：選擇極性固定液。復(fù)雜混合物：使用兩種或以上固定液。完全分離的前提下，優(yōu)先選擇非極性柱。16.3分離系統(tǒng)Companyname柱溫應(yīng)低于固定液的最高使用溫度柱溫是影響色譜分離效能和分析時(shí)間的重要參數(shù)柱溫選擇的原則是，在保證難分離物質(zhì)有良好分離的前提下（分離度滿足要求），盡可能采取較高柱溫，以縮短分析時(shí)間，保證峰型對稱。組分復(fù)雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。柱溫的選擇：16.3分離系統(tǒng)Companyname恒溫：45oC程序升溫：30-180oC恒溫：145oC溫度低，分離效果較好，但分析時(shí)間長程序升溫，分離效果好，且分析時(shí)間短溫度高，分析時(shí)間短，但分離效果差程序升溫Companyname16.4氣相色譜檢測器Companyname原理：含碳物質(zhì)在氫火焰（以氫氣-空氣燃燒為能源）中離子化，外電場作用形成電流，電流與待測物質(zhì)量成正比氫火焰離子化檢測器（hydrogenflameionizationdetector）FIDCompanyname小結(jié)：氣相色譜分離條件的選擇固定液的選擇柱長和內(nèi)徑及液膜厚度的選擇載氣及流速的選擇柱溫的選擇檢測器及溫度的選擇進(jìn)樣口溫度的選擇進(jìn)樣量的選擇Companyname人體排泄物中膽汁酸分析圖

色譜峰：1甾醇2膽固醇3糞甾醇4谷甾醇5降膽酸（內(nèi)標(biāo)）6石膽酸7異去氧膽酸8去氧膽酸9熊去氧膽酸色譜柱:

CP-Sil19

CB（14%腈丙基-苯基，86%二甲基聚硅氧烷固定相，中等極性）25m

x

0.32mm，0.25μm

，

柱溫:

140

℃（1min）→270

℃（10

℃

/min）

載氣:氫氣（H2），70

KPa

進(jìn)樣器:140

℃

檢測器：FID進(jìn)樣量：1μL

毛細(xì)管柱用于膽汁酸的分離測定

練習(xí)例：兩組分在1m長柱子上的分離度為0.75，問使用多長柱子可以使它們完全分離？解：練習(xí)Companyname1.利用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照定性一、定性分析15-4色譜法定性和定量分析保留時(shí)間峰高增加法雙柱比較法(Qualitativeanalysis)條件：嚴(yán)格控制色譜條件Companyname4.與其它儀器聯(lián)用，將結(jié)構(gòu)分析儀器作為色譜檢測器2.利用相對保留值定性(p303）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀15-4色譜法定性和定量分析3.利用保留指數(shù)定性（自學(xué)）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Companyname二、定量分析原理:當(dāng)操作條件一致時(shí)，被測組分的質(zhì)量（或濃度）與檢測器給出的響應(yīng)信號(峰面積A或峰高h(yuǎn))成正比。（QuantitativeAnalysis

）15-4色譜法定性和定量分析iAiiAfm=ihiihfm=色譜定性和定量分析方法QualitativeandQuantitativeAnalysisofChromatography定量校正因子絕對校正因子miiAiAf=miiAiAf=iihihmf=15-4色譜法定性和定量分析與儀器的靈敏度有關(guān)，不容易測量準(zhǔn)確，無通用性。色譜定性和定量分析方法QualitativeandQuantitativeAnalysisofChromatography相對校正因子isf基準(zhǔn)物：TCD→苯；FID→正庚烷與待測物、基準(zhǔn)物和檢測器類型有關(guān)，與操作條件（進(jìn)樣量）無關(guān)同類型檢測器，相對校正因子可以通用15-4色譜法定性和定量分析Companyname常用的定量方法外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)校正法）內(nèi)標(biāo)法峰面積歸一化法15-4色譜法定性和定量分析外標(biāo)法123456SamplemAAimi15-4色譜法定性和定量分析Companyname外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)校正法）特點(diǎn)：分離、檢測條件的穩(wěn)定性對定量結(jié)果影響很大。為獲得高定量準(zhǔn)確性，定量校正曲線必須經(jīng)常重復(fù)校正。應(yīng)用最廣、操作簡單，適用大批量樣品測定。15-4色譜法定性和定量分析Companyname不存在試樣中內(nèi)標(biāo)物是高純化合物內(nèi)標(biāo)物與樣品能互溶但無化學(xué)反應(yīng)；分子結(jié)構(gòu)、保留值與檢測響應(yīng)最好與待測組分接近內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分完全分離；內(nèi)標(biāo)物要求：15-4色譜法定性和定量分析內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法siSample(i)Standard(內(nèi)標(biāo)物）ms15-4色譜法定性和定量分析=ssisiimAfAm標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)混合進(jìn)樣樣品和內(nèi)標(biāo)混合進(jìn)樣Companyname§16-3氣相色譜法定性和定量分析配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有等量內(nèi)標(biāo)物Companyname15-4色譜法定性和定量分析

mi

（或Ci

）∝Ai/AS內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線采集不同濃度標(biāo)樣的色譜圖Companyname按標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線15-4色譜法定性和定量分析

mi

（或Ci

）∝Ai/AS不必測校正因子，消除了某些操作條件的影響，定量結(jié)果較準(zhǔn)確,特別適合于樣品前處理復(fù)雜、微量組分的樣品分析。15-4色譜法定性和定量分析歸一化法[前提：樣品中所有組分都有響應(yīng)（出峰）]100%1==niAisiAisiifAfAm%3124簡便，不需要標(biāo)準(zhǔn)品；操作條件的變動(dòng)對測定結(jié)果影響不大；適用于多組分同時(shí)定量測定。要求全部組分出峰并已知校正因子，限制了其應(yīng)用。Companyname思考題1.氣相色譜法適合分析什么類型的樣品?2.氣相色譜儀的五大系統(tǒng)分別是什么？3.哪類固定液在氣相色譜法中最為常用?4.氣相色譜法固定相的選擇原則是什么？5.一般實(shí)驗(yàn)室通常備用哪三種色譜柱，基本上能應(yīng)付日常分析需要？6.程序升溫適合分離什么樣品?為什么？7.氫火焰檢測器適于分析什么樣品?8.氣相色譜分離操作條件選擇中哪兩個(gè)因素是對分離影響最大的？9.色譜法常用的定量分析方法有哪些？各方法的特點(diǎn)高效液相色譜法(HPLC)

HighPerformanceLiquidChromatography學(xué)習(xí)內(nèi)容（一）高效液相色譜法的特點(diǎn)（三）高效液相色譜儀（四）化學(xué)鍵合相色譜法（五）高效液相色譜法的應(yīng)用（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相HPLC

以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。LC(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)1.分離效能高：每米塔板數(shù)可達(dá)106。液相色譜分離機(jī)理類型多，作為分析時(shí)選擇余地大；(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)類型主要分離機(jī)理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜溶解度各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)96

溶于水——排阻色譜，水為流動(dòng)相相對分子質(zhì)量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動(dòng)相堿——陽離子交換色譜溶于水，可離解酸——陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子—反相離子對色譜

各種鍵合相色譜、離子色譜、疏水色譜、親和色譜、手性色譜、脂質(zhì)體色譜、生物膜色譜、整體柱色譜、微徑柱和毛細(xì)管柱色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、微芯片液相色譜等。分離模式和分離方法不斷增加：(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)1.分離效能高：

(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)固定相用小粒徑的填料填充而成；(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)縱向擴(kuò)散對色譜峰擴(kuò)展影響很小，故：液相色譜速率方程H=A+Cu,提高柱效主要途徑:(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)1.分離效能高：固定相填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻。選用低粘度的流動(dòng)相（乙腈<甲醇<水），降低傳質(zhì)阻力。低流速。適當(dāng)升高柱溫。流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，

對組分可產(chǎn)生一定的親和力，并參與固定相的組分的競爭。流動(dòng)相增加了控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，對分離起很大作用。

(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)1.分離效能高：適合高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析，不受試樣揮發(fā)性和分子量的限制。(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)近百分之八十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析。2.應(yīng)用范圍廣：Slide#103HPLC應(yīng)用化學(xué)工業(yè)環(huán)境保護(hù)制藥行業(yè)消費(fèi)產(chǎn)品臨床診斷聚苯乙烯染料鄰苯二甲酸酯四環(huán)素皮質(zhì)甾類抗抑郁劑巴比妥鹽氨基酸維生素高半胱氨酸生命科學(xué)蛋白質(zhì)多肽核酸類脂類抗氧化劑糖多環(huán)芳烴無機(jī)離子除草劑(一)高效液相色譜法的特點(diǎn)不足1.尚缺少靈敏度高的通用型檢測器2.使用有機(jī)溶劑做流動(dòng)相污染環(huán)境3.儀器運(yùn)行成本高4.降低柱外效應(yīng)比氣相色譜更為重要（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相流動(dòng)相溶劑類型和組成選擇常是分離條件優(yōu)化的首要操作液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑?？晒┻x用的流動(dòng)相種類較多，從非極性、極性有機(jī)溶劑到水溶液，可使用單一純?nèi)軇?，也可用二元或多元混合溶劑。流?dòng)相選擇的一般要求：

化學(xué)惰性好。不與固定相和組分發(fā)生反應(yīng)，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。高純度，毒性小、價(jià)廉，溶劑清洗和更換方便。注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的最低波長,低于該波長后,溶劑會有很強(qiáng)的紫外吸收，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對所分析物質(zhì)的檢測。低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相溶劑的極性以極性參數(shù)P′表示，p357表17.2列出常用溶劑的P’,其中水的極性最大。調(diào)節(jié)溶劑極性可使樣品組分的容量因子在適宜范圍流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度與極性（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相

正相色譜：以極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相的色譜反相色譜：以非極性物質(zhì)為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相的色譜（normal-phasechromatography,NPC）（reversed-phasechromatography,RPC）根據(jù)固定相和流動(dòng)相相對極性分類：（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相在正相色譜中，P′越大，洗脫能力越強(qiáng)，溶質(zhì)的保留值降低。在反相色譜中，P′越大，洗脫能力越弱，溶質(zhì)的保留值增大。（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相與固定相極性相近的組分tR長反相HPLC

極性:固定相<流動(dòng)相固定相-極性弱流動(dòng)相(甲醇,乙腈等)-極性強(qiáng)極性小的物質(zhì)后出峰正相HPLC 極性:固定相>流動(dòng)相固定相-極性強(qiáng)流動(dòng)相(己烷,庚烷)-極性弱極性大的物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%第110頁/共49頁（二）高效液相色譜法的流動(dòng)相組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。溶質(zhì)極性：A>B>CCBA時(shí)間低極性流動(dòng)相CBA時(shí)間中等極性流動(dòng)相a.正相色譜ABC時(shí)間高極性流動(dòng)相ABC時(shí)間中等極性流動(dòng)相b.反相色譜美國Agilent美國Waters日本島津(Shimadzu)

(三)高效液相色譜儀流動(dòng)相脫氣裝置高壓泵進(jìn)樣器色譜柱檢測器(三)高效液相色譜儀包括輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高壓輸液泵

提供（50-500）×105Pa的柱前壓，將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。(三)高效液相色譜儀如：流動(dòng)相：甲醇-0.5%醋酸水梯度如下：0min

30%-70%

5min

30%-70%

10min35%-65%

15min40%-60%

18min50%-50%

流動(dòng)相控制方式分為等度洗脫和梯度洗脫梯度洗脫（Gradientelution）是采用兩種或三種極性不同的溶劑為流動(dòng)相，各溶劑的流量比例按線性或階梯形程序變化，逐步增加強(qiáng)溶劑體積比例以提高流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度。(三)高效液相色譜儀以反相色譜為例當(dāng)?shù)榷认疵摃r(shí)：分析時(shí)間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(三)高效液相色譜儀95%30%甲醇濃度當(dāng)采用梯度洗脫時(shí)：(三)高效液相色譜儀梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有組分都以最佳平均k值通過色譜柱。優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測量和提高分離精度梯度洗脫特別適合組分保留值差別很大的復(fù)雜混合物分離。(三)高效液相色譜儀進(jìn)樣器功能：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；種類：平頭注射器：1～10μL微量注射器帶定量管的Rheodyne手動(dòng)進(jìn)樣閥(三)高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣100樣品盤機(jī)械手樣品盤第120頁/共49頁(三)高效液相色譜儀六通閥進(jìn)樣裝置：優(yōu)點(diǎn)：耐高壓，進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好缺點(diǎn)：容易造成色譜峰擴(kuò)張(三)高效液相色譜儀(三)高效液相色譜儀檢測器

功能：將被分析組分在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號；

分類：

1.紫外吸收檢測器

2.二極管陣列紫外檢測器3.熒光檢測器

4.示差折光化學(xué)檢測器

5.蒸發(fā)光散射檢測器

6.電化學(xué)檢測器(三)高效液相色譜儀UVdetectorcell內(nèi)容積：1-10l光路長：2-10mm紫外檢測器UVD(ultraviolet-visibledetector)(三)高效液相色譜儀定量：朗伯比耳定律：A＝KCL用于測定有紫外吸收的組分只能使用無紫外吸收的溶劑為流動(dòng)相無法掃描組分的最大吸收波長紫外檢測器的特點(diǎn)：(三)高效液相色譜儀樣品池二極管陣列光柵每一組分可在每一波長處得到一吸光度值光電二極管陣列檢測器PDAD（photo-diodearraydetector)(三)高效液相色譜儀三維：光譜-色譜圖色譜圖minA光譜圖nmAA-λ曲線(定性)A-t曲線(定量)(三)高效液相色譜儀將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。分為非極性、極性和離子型三種主要類型化學(xué)鍵合固定相(四)化學(xué)鍵合相色譜法是目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相非極性鍵合相色譜：(reversedphaseHPLC,RP-HPLC),又叫反相鍵合相色譜（RPBC）：硅膠表面鍵合了非極性有機(jī)基團(tuán)(烴基硅烷)的固定相常見的烴基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基等；其中以十八烷基鍵合相（簡稱ODS或C18）應(yīng)用最廣泛。(四)化學(xué)鍵合相色譜法

將硅膠與十八烷基三氯硅烷反應(yīng)制備。硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相(四)化學(xué)鍵合相色譜法C-2orRP-2(Si-CH2CH3)C-8orRP-8(Si-(CH2)7CH3)C-18orRP-18(Si-(CH2)17CH3)(四)化學(xué)鍵合相色譜法分離機(jī)制：疏溶劑作用理論1）“分子毛”非極性烷基鍵合相是在硅膠表面覆蓋了一層以Si-C鍵化學(xué)鍵合的十八烷基（或其它烴基）的“分子毛”。強(qiáng)疏水性(四)化學(xué)鍵合相色譜法2）溶質(zhì)分子（分析物）溶質(zhì)分子=非極性部分+極性官能團(tuán)部分(四)化學(xué)鍵合相色譜法3）“疏溶劑效應(yīng)”solvophobicinteraction(四)化學(xué)鍵合相色譜法溶質(zhì)（S）受極性溶劑的排斥力，促使溶質(zhì)與鍵合非極性烴基配體(L)發(fā)生疏溶劑化締合，形成締合物。3）“疏溶劑效應(yīng)”solvophobicinteraction(四)化學(xué)鍵合相色譜法保留：洗脫：溶質(zhì)分子（S）的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使其離開固定相，減小保留作用。兩種作用力之差決定了被測組分在色譜中的保留行為。溶質(zhì)保留值的影響因素溶質(zhì)分子結(jié)構(gòu)烷基鍵合固定相特性流動(dòng)相性質(zhì)(四)化學(xué)鍵合相色譜法1.溶質(zhì)分子結(jié)構(gòu)對保留值的影響溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。溶質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保留值大。溶質(zhì)分子中非極性部分相同，而增加極性基團(tuán)，則因?yàn)樵黾恿巳苜|(zhì)分子與洗脫液的極性分子間的作用力而使ｋ減小。(四)化學(xué)鍵合相色譜法OHOHC18(ODS)強(qiáng)弱疏水性Si(四)化學(xué)鍵合相色譜法(四)化學(xué)鍵合相色譜法判斷下列四個(gè)化合物在反相鍵合相的保留順序增加極性基團(tuán)，使ｋ減小。隨著烷基碳鏈的增長：增加了鍵合相的非極性作用的表面積，增大溶質(zhì)的保留值，增大色譜柱的選擇性。烷基鍵合固定相特性對保留值的影響：(四)化學(xué)鍵合相色譜法例：地西泮分別在C18柱和C8柱上的色譜保留流動(dòng)相：甲醇-水（80︰20）；(四)化學(xué)鍵合相色譜法1.C18柱上的色譜圖2.C8柱上的色譜圖流動(dòng)相極性對分離的影響：常用流動(dòng)相：一般以洗脫能力最弱的水作為底劑，再加入一定量的可與水互溶的有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑構(gòu)成；常用的首選極性調(diào)節(jié)劑為甲醇與乙腈。有機(jī)相比例減小，水相比例升高：溶劑的極性增加，洗脫能力降低，溶質(zhì)的保留時(shí)間增加；不同溶質(zhì)組分之間的分離度增加。(四)化學(xué)鍵合相色譜法1:對羥基苯甲酸甲酯2:對羥基苯甲酸乙酯3:對羥基苯甲酸丙酯4:對羥基苯甲酸丁酯有機(jī)相:MeOH20%H2O30%H2O40%H2O減小(四)化學(xué)鍵合相色譜法流動(dòng)相PH值對分離的影響：分子態(tài)溶質(zhì)具較高疏水性，k值較高；電離成離子態(tài)，疏水性降低導(dǎo)致k值下降，電離基團(tuán)越多，疏水性越弱，k值越小。流動(dòng)相PH可改變解離溶質(zhì)的離解程度。(四)化學(xué)鍵合相色譜法分離有機(jī)弱酸或弱堿，可在流動(dòng)相中加入0.1～1%的甲酸、乙酸、二乙胺、三乙胺或氨水作為調(diào)節(jié)劑，抑制弱酸解離或弱堿質(zhì)子化，以獲得較高k和α。正相鍵合相色譜法：固定相：一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機(jī)基團(tuán)如氰基、氨基和二醇基鍵合相。流動(dòng)相：非極性(常用環(huán)己烷）＋適量極性調(diào)節(jié)劑（氯仿、醇、乙腈等），以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離極性化合物。(四)化學(xué)鍵合相色譜法極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。分離機(jī)制：分配色譜，依靠溶質(zhì)分子與固定相之間的靜電力、誘導(dǎo)力或氫鍵作用力。組分的極性增加,k增大。流動(dòng)相中極性調(diào)節(jié)劑的極性增大（或濃度增大）,k降低。(四)化學(xué)鍵合相色譜法相互作用力是什么?非常弱氫鍵OHHOS