醫(yī)學免疫學熒光免疫技術資料

熒光(yíngguāng)免疫技術第一頁，共18頁?；靖拍羁乖贵w反應具有高度特異性熒光物質的檢測具有靈敏性和直觀性熒光免疫技術是將兩者有機的結合起來將熒光物質與抗原（抗體）連接(liánjiē)，形成熒光標記物再與相應的抗體（抗原）發(fā)生反應，檢測反應體系中的熒光強弱及存在部位用于物質的定性、定量、定位檢測按技術原理及用途分為熒光抗體染色技術用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的抗原或抗體進行鑒定和定位檢測熒光免疫測定對體液標本中的抗原或抗體進行定量檢測，有均相和非均相兩種第二頁，共18頁。熒光抗體染色(rǎnsè)技術基本原理在基質片上，通過抗原抗體的反應，連接上熒光素標記的的抗體，借助(jièzhù)熒光顯微鏡觀察有無熒光及部位，最終作出定性、定位的判定技術要求基質片熒光抗體熒光顯微鏡第三頁，共18頁?；|(jīzhì)片將標本固定在玻片上而形成，含有已知或待測抗原根據標本來源不同可分為組織印片、組織切片(qiēpiàn)、細胞涂片、細菌涂片制備好的基質片應盡快染色或置－20℃保存第四頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體用化學的方法將熒光物質共價連接在抗體上而形成熒光的基本知識自然界某些物質能從外界吸收(xīshōu)能量（光能、化學能），外層電子發(fā)生躍遷，進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回復至基態(tài)時，多余的能量以光能的形式釋放，產生熒光，可分為光致熒光、化學熒光、X線熒光熒光物質不會將全部吸收(xīshōu)的能量都轉變?yōu)闊晒猓诖诉^程中，吸收(xīshōu)能量轉變?yōu)闊晒獾陌俜致史Q為熒光效率。熒光物質發(fā)射熒光的能力減弱甚至不能發(fā)射熒光稱為熒光的淬滅使熒光發(fā)生淬滅的因素有：長時間激發(fā)光照射、某些化學物質（苯胺、酚、硝基苯、鹵化物等）環(huán)境因素對熒光物質產生熒光強度有影響（pH、溫度、熒光素的濃度、基質片上的固定劑等）第五頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體作為標記的熒光物質應具備的條件與蛋白質分子能穩(wěn)定結合，標記容易，結合后不影響(yǐngxiǎng)蛋白質活性熒光效率高熒光色澤與背景色澤對比鮮明物質易得，來源廣泛第六頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體熒光抗體(kàngtǐ)染色技術中常用的標記熒光物質最大吸收(xīshōu)波長最大發(fā)射波長異硫氰酸熒光素（FITC）四乙基羅丹明（RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）藻紅蛋白495nm570nm550nm490～560nm525nm，黃綠色595nm，紅色595nm，紅色620nm，橙紅色在其他熒光免疫技術中的熒光物質：鑭系金屬、酶作用產生熒光的物質（MUG）第七頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體制備FITC中含活性基團（－N＝C＝S）在堿性條件下能與蛋白質中賴氨酸的NH2發(fā)生反應，使兩者共價結合在堿性條件下（CB），將待標記蛋白質與FITC按一定比例(bǐlì)混合，反應一段時間生成物經分離純化、鑒定合格后小瓶分裝，低溫下保存需去除的有游離的FITC、過度標記的蛋白質、標記的非特異性抗體按公式計算F/P的值，一般固定標本1.5、活細胞染色2.4為宜第八頁，共18頁。熒光(yíngguāng)顯微鏡用于觀察熒光的特殊裝置除與普通的顯微鏡一樣能觀察細胞、亞細胞結構外，還應有光源作為激發(fā)光，引起熒光的發(fā)出濾光片隔熱濾光片、激發(fā)濾光片、吸收濾光片聚光器觀察到的熒光包括特異性熒光由抗原抗體反應后，熒光抗體結合在基質(jīzhì)片上，所發(fā)出的熒光非特異性熒光背景熒光洗滌不徹底，熒光抗體非特異性吸附交叉反應第九頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體染色法技術類型直接法間接(jiànjiē)法補體結合法雙標記法第十頁，共18頁。直接(zhíjiē)法原理(yuánlǐ)待測標本熒光抗體熒光方法簡單、快速、特異，靈敏度低，每檢測一種抗原，需制備相應的熒光抗體。常用于細胞、病毒(bìngdú)的快速檢測、腎活檢和皮膚活檢第十一頁，共18頁。間接(jiànjiē)法原理(yuánlǐ)已知抗原待測抗體熒光素標記的抗抗體熒光方法(fāngfǎ)靈敏、檢測過程中只需制備一種熒光素標記的抗體。常用于自身抗體的檢測標記的抗體為針對所檢測物種所分泌的免疫球蛋白第十二頁，共18頁。補體結合法原理(yuánlǐ)已知抗原待測抗體抗補體熒光方法靈敏(línɡm(xù)ǐn)、熒光抗體也只需一種，但操作繁瑣、影響因素多，不常用熒光(yíngguāng)素標記的抗體為抗補體的抗體第十三頁，共18頁。雙標記(biāojì)法原理用兩種不同的熒光素分別標記兩種特異性抗體，再與基質片作用后，用熒光顯微鏡觀察，以熒光的顏色來判斷(pànduàn)相應抗原存在的情況第十四頁，共18頁。時間(shíjiān)分辨熒光免疫測定基本概念熒光免疫技術對物質進行(jìnxíng)檢測時，待測物質的含量與生成物熒光的強度存在著量的關系在激發(fā)光照射后一段時間，除特異性熒光外，反應體系中還可能存在著其他非特異性熒光，以這段時間內的熒光強度代表反應體系的熒光強度，會導致結果的偏差激發(fā)光照射后經過一段時間，待非特異性熒光消失，而特異性熒光仍然存在，這時再測量反應體系的熒光強度標記物應用熒光壽命比非特異性熒光壽命長的熒光素第十五頁，共18頁。時間分辨(fēnbiàn)熒光免疫測定標記物三價鑭系(Eu、Sm、Tb、Nd、Dy)金屬離子(lízǐ)螯合物熒光特點熒光壽命長（比非特異性熒光壽命長5～6個數量級）激發(fā)光（340nm）與發(fā)射光（613nm）相差大，易分開激發(fā)光譜寬（增加激發(fā)能）、發(fā)射光譜窄（降低本底熒光）熒光標記相對比活性高第十六頁，共18頁。時間分辨(fēnbiàn)熒光免疫測定技術類型固相雙位點夾心(jiāxīn)法固相抗原競爭法固相抗體競爭法第十七頁，共18頁。熒光(yíngguāng)偏振免疫測定原理熒光素標記的物質分子(fēnzǐ)量越小，運動越快，被偏振光激發(fā)后，發(fā)射的偏振熒光越弱，反之在反應體系中，待測抗原、熒光素標記抗原競爭結合相應抗體，待測抗原濃度高，