比色與吸光光度法

比色與吸光光度法教學指導：吸光光度法簡介吸光光度法基本原理可見分光光度法及其儀器吸光光度法應用1/13/20232比色與吸光光度法吸光光度法（AbsorptionPhotometry）：基于物質(zhì)對光的選擇性而建立的分析方法。包括比色法、紫外可見分光光度法、紅外分光光度法。廣泛用于無機物和有機物的定性和定量分析。目視比色法→光電比色第一節(jié)吸光光度法簡介1/13/20233比色與吸光光度法分光光度法特點：靈敏度高：試樣中1%-0.001%微量成分準確度較高：相對誤差2%-5%（1%-2%）。；幾乎所有的無機離子有許多有機化合物；操作簡便、快速、儀器價格適中、用途廣。1/13/20234比色與吸光光度法第一節(jié)吸光光度法簡介一、光的基本性質(zhì)1、光的波粒二象性波動性：光以波的形式傳播，可用波長、頻率來表示。波長：兩個相鄰波峰或波谷間的距離（nm）頻率：單位時間里通過一固定點處波的數(shù)目（s-1）=c/

光速c=3×1010cm/s1/13/20235比色與吸光光度法第一節(jié)吸光光度法簡介粒子性：光由光子組成，具有能量?！鱁=h=hc/

h為普朗克常數(shù)6.63×10-341/13/20236比色與吸光光度法2、光譜分區(qū)能量小200nm400nm780nm大波長光譜區(qū)域紫外光區(qū)可見光區(qū)紅外分析方法紫外分光光度法可見分光光度法50um紅外分光光度法紫、藍、青、綠、黃、橙、紅1/13/20237比色與吸光光度法二、物質(zhì)對光的吸收1、物質(zhì)對光選擇性吸收的實質(zhì)一束光通過某物質(zhì)時該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生碰撞，光子的能量轉(zhuǎn)移至分子、原子或離子上，使這些粒子發(fā)生能級變化，由基態(tài)躍遷至較高能態(tài)，這個過程即為吸收。光是否被物質(zhì)吸收，取決于光子的能量物質(zhì)的結(jié)構(gòu)只有當能級差△E與光子能量h相當時物質(zhì)吸收光。1/13/20238比色與吸光光度法2、物質(zhì)的顏色與光吸收的關系復合光與單色光單色光：具有單一波長的光。復合光：由不同波長的單色光按一定比例組成的光如白光。1/13/20239比色與吸光光度法溶液顏色與光吸收的關系溶液對光的吸收：若溶液透明、均勻，人眼看到的溶液顏色是由透射光的波長決定的。當入色光為白光（復合光），溶液吸收的光與透射的光互補?；パa色：組成白光的兩種光。光的互補：藍黃1/13/202310比色與吸光光度法互補色示意圖

藍450-480

紫400-450

紅650-750青藍480-490

青490-500

綠500-580

黃580-600

橙600-650白光1/13/202311比色與吸光光度法溶液對光的作用示意圖1/13/202312比色與吸光光度法溶液顏色與吸收光顏色和波段的關系溶液的顏色

吸收光顏色波段（nm）黃綠黃橙紅紫紅紫藍青藍青紫藍青藍青綠黃綠黃橙紅400~450450~480480~490490~500500~560560~580580~600600~650650~7601/13/202313比色與吸光光度法721型分光光度計1/13/202314比色與吸光光度法3、吸收曲線（吸收光譜）吸收曲線：吸光度隨波長變化的曲線。吸收曲線的特點：不同的物質(zhì)因其分析結(jié)構(gòu)不同而具有不同的吸收曲線；同一物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線的形狀和λmax的位置不變，但在同一波長下吸光度隨濃度的增大而增大。吸收曲線是吸光度法選擇測量波長的依據(jù)。1/13/202315比色與吸光光度法吸光度A吸收曲線圖4005006001/13/202316比色與吸光光度法1/13/202317比色與吸光光度法1.朗伯—比耳定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關系。A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律。第二節(jié)吸光光度法基本原理1/13/202318比色與吸光光度法朗伯—比耳定律吸光度A：表征物質(zhì)對光吸收程度的量。

A=lgIi/I0=-lgT=bcA--吸光度--摩爾吸光系數(shù)C--被測物濃度Ii--入射光強T--透過率

b--液層厚度（光程長度）

I0--透射光強1/13/202319比色與吸光光度法例：用1,10-二氮菲光度法測定鐵，已知Fe2+濃度為，比色皿厚度2厘米，在=508nm測得配合物吸光度，求。（1.1×104-1-1）1/13/202320比色與吸光光度法朗伯—比耳定律適用條件：入射光為平行單色光，且垂直照射；吸光物質(zhì)為均勻非散射體系；吸光質(zhì)點之間無相互作用；輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收過程，無熒光和光化學現(xiàn)象；吸光度具有加和性（A總=A1+A2+…）。。1/13/202321比色與吸光光度法2、標準（工作）曲線標準（工作）曲線繪制方法：在、b固定的情況下，測定一系列不同濃度的標準溶液的吸光度，作A~c圖，在相同條件下測定樣品溶液的吸光度，從曲線上可查出被測樣品的濃度。1/13/202322比色與吸光光度法工作曲線圖濃度（c）吸光度1/13/202323比色與吸光光度法濃度c正偏離負偏離吸光度工作偏離圖1/13/202324比色與吸光光度法偏離原因：非單色光引起的偏離：L—B定律要求入射光為單色光，但目前儀器提供的入射光是由波長范圍較窄的光帶組成的復合光。非平行入射光引起的偏離介質(zhì)不均勻引起的偏離化學因素引起的偏離：高濃度時引起溶液中吸光粒子之間相互作用上升，使吸光能力發(fā)生變化；化學反應引起的偏離。

1/13/202325比色與吸光光度法第三節(jié)可見分光光度計光源吸收池檢測器

單色器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、可見光分光光度法一、儀器結(jié)構(gòu)框圖1/13/202326比色與吸光光度法1、光源基本要求：在儀器工作的波長范圍內(nèi)，提供連續(xù)、有足夠發(fā)射強度和良好穩(wěn)定性的復合光，而且發(fā)射光的強度隨波長的變化應盡可能小。常用光源：鎢絲燈和鹵鎢燈，可使用的波長范圍在360~2500nm。1/13/202327比色與吸光光度法2、單色器單色器作用：從光源發(fā)出的復合光中分出所需要的單色光。單色器組成：由入射狹縫、準光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等組成。單色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱鏡和光柵），起分光的作用。1/13/202328比色與吸光光度法

吸收池用于盛放分析試樣；可見光區(qū)只能用玻璃吸收池；吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向；吸收池要配對。因為吸收池材料本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結(jié)果都有影響。3、吸收池1/13/202329比色與吸光光度法

檢測器的功能：檢測信號、測量單色光透過溶液后光強度變化。常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。4、檢測器1/13/202330比色與吸光光度法型號

價格（萬元）波長，nm分光器件數(shù)據(jù)處理指示產(chǎn)地7210.18360~800棱鏡表頭上海三分7220.28330~800光柵微機數(shù)顯上海三分760CRT7.21190~900光柵PC打印掃描顯象管上海三分751G0.91200~1000棱鏡微機打印表頭上海分析GDZ12.3200~800全息凹面光柵微機數(shù)顯北京地質(zhì)WFZ-122-10.7340~600光柵微機數(shù)顯北京地質(zhì)WFJ-80-10.3360~800棱鏡PC打印掃描數(shù)顯北京二分國產(chǎn)常用紫外可見分光光度計1/13/202331比色與吸光光度法721型分光光度計1/13/202332比色與吸光光度法722型分光光度計1/13/202333比色與吸光光度法1/13/202334比色與吸光光度法分光光度計的使用

預熱20min。調(diào)節(jié)T=0。調(diào)節(jié)T=100%（A=0）。測定樣品的吸光度A。1/13/202335比色與吸光光度法分光光度計的保養(yǎng)與維護安置在干燥、無污染的地方；儀器內(nèi)的防潮硅膠應定期更換或再生；儀器停止工作時，必須切斷電源，應按開關機順序關閉主機和穩(wěn)流穩(wěn)壓電源開關；比色皿使用完畢后，立即用蒸餾水或有機溶劑沖洗干凈，并用柔軟情節(jié)的紗布把水漬擦凈；儀器經(jīng)過搬動，請及時檢查并糾正波長精度。1/13/202336比色與吸光光度法第四節(jié)吸光光度法應用吸光光度法主要應用于微量和痕量組分的測定，有時也用于某些高含量物質(zhì)的分析。近年來用于多組分物質(zhì)的分析、配合物的組成和穩(wěn)定常數(shù)的測定等。1/13/202337比色與吸光光度法1鄰二氮菲法測定微量鐵

(鄰二氮菲法主要用于測定鐵)試樣經(jīng)溶解、分離干擾物質(zhì)后，在試液中加入鹽酸羥胺將鐵全部還原為Fe2+，加入鄰二氮菲顯色劑，并加入HAc-NaAc緩沖溶液，pH約為，顯色3~5min后，以試劑空白為參比溶液，于510nm波長處測定A值，在工作曲線上查得其含量，即可求得測定結(jié)果。

1/13/202338比色與吸光光度法2鋼鐵中錳的分析錳是鋼鐵中有益元素，在煉鋼中是良好的脫氧劑和脫硫劑。它以金屬固熔體MnS狀態(tài)存在。試樣用HNO3溶解，用H3PO4與Fe3+配合成無色的Fe(HPO4)2-，在催化劑AgNO3作用下，以(NH4)2S2O8為氧化劑，加熱煮沸使Mn2+，氧化為紫紅色的M