真菌常用的體外藥敏試驗(yàn)方法比較

真菌常用的體外藥敏試驗(yàn)方法比較真菌藥敏試驗(yàn)臨床難以開(kāi)展的原因NCCLS推薦的稀釋法,操作繁瑣NCCLS認(rèn)可4.E試驗(yàn)價(jià)錢(qián)太貴體外敏感試驗(yàn)與臨床治療相關(guān)性真菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果與口咽部真菌感染結(jié)果相關(guān)性好對(duì)于深部的真菌感染，抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)同臨床治療的相關(guān)性還有待進(jìn)一步證實(shí)體外敏感試驗(yàn)沒(méi)有考慮到真菌對(duì)抗真菌藥物在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)和復(fù)雜的生物學(xué)作用真菌體外藥物敏感試驗(yàn)方法

NCCLSM27-A：常量肉湯稀釋法，微量肉湯稀釋法E-test法NCCLSM44-P紙片擴(kuò)散法(僅限氟康唑)

丹麥Rosco紙片擴(kuò)散法(NCCLS未認(rèn)可)

真菌體外藥敏用培養(yǎng)基

常量肉湯和微量肉湯法RPMI1640液制備：

MOPS（三氮嗎啡啉丙磺酸） 34.53g 蒸餾水900ml溶解后，用1MNaOH調(diào)節(jié)PH至（25℃），用蒸餾水溶至1000ml，高壓滅菌后，冷卻至50℃加入RPMI1640用濾膜抽濾除菌，4℃保存。

真菌體外藥敏用培養(yǎng)基

E-test法：

在RPMI液體培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖，使其終濃度為2%。NCCLS紙片擴(kuò)散法：

Mueller-Hinton瓊脂補(bǔ)充2%葡萄糖和美藍(lán)丹麥ROSCO紙片擴(kuò)散法：

改良的SHADOMY（）培養(yǎng)基主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸緩沖液等。菌液制備將受試菌在沙保羅培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種，以保證其純度和活性。用0.85%的鹽水制成酵母菌懸液，調(diào)整其濁度達(dá)到麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（約為1~5×106CFU/ml）。常量稀釋法：用RPMI1640液體稀釋2000倍 接種濃度約為0.5~2.5×103CFU/ml

微量稀釋法：用RPMI1640液體稀釋1000倍接種濃度約為1～5×103CFU/mlE-test法和NCCLS紙片擴(kuò)散法：用菌液濁度為麥?zhǔn)蠁挝?。Rosco紙片擴(kuò)散法：1.念珠菌： 麥?zhǔn)蠞岫?，生理鹽水1：10稀(1~5×105CFU/ml)2.隱球菌屬： 麥?zhǔn)蠞岫?.其它酵母菌：麥?zhǔn)蠞岫龋睇}水1：1稀釋常量肉湯法(M27-A)先將氟康唑粉末溶于蒸餾水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀釋?zhuān)蛊淦鹗紳舛葹?40μg/ml,終末濃度為1.25μg/ml，分裝無(wú)菌潔凈的12mm×75mm試管：

6432168421.25.125＋－mlml菌液念珠菌屬35

℃孵育48小時(shí)新型隱球菌72小時(shí)讀取MIC結(jié)果2ml菌液ml1640常量稀釋法

藥敏結(jié)果判定

氟康唑，伊曲康唑，兩性霉素為100%抑制其他唑類(lèi)藥物為80%抑制（取的生長(zhǎng)對(duì)照菌液加入液體培養(yǎng)基的菌液濃度）質(zhì)控株克柔念珠菌ATCC6258

近平滑念珠菌ATCC22019

白念珠菌ATCC90028

白念珠菌ATCC24433

微量肉湯法

氟康唑的稀釋方法同常量法，但起始濃度為2×常量法的濃度（即128μg/ml），終濃度為。

。37℃。37℃6432168421.5.25.125＋－氟康唑：1-10孔分別為100ul菌懸液：1-10孔分別為100ul200ulRPMI湯200ul菌懸液

35℃ 新型隱球菌72小時(shí)，其余菌株48小時(shí)讀取MIC結(jié)果酵母菌的NCCLSM27-A各藥物折點(diǎn)

粘膜及系統(tǒng)性感染：氟康唑（除克柔念珠菌）敏感： ≤8μg/ml

中介： －耐藥： ≥64μg/ml粘膜感染：伊曲康唑敏感：

中介： －耐藥： ≥1μg/ml粘膜及系統(tǒng)性感染：5-氟嘧啶敏感： ≤4μg/ml

中介： 8~16μg/ml

耐藥： ≥32μg/ml酵母菌E-test法

瑞典ABBiodisk

優(yōu)點(diǎn)：有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性

MICE-test法

麥?zhǔn)媳葷嵋海s為1~5×106CFU/ml）。菌懸液均勻涂布于藥敏板上

35℃培養(yǎng)24小時(shí)讀取結(jié)果

光滑念珠菌新型隱球菌等生長(zhǎng)較慢的菌種需適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。E-test法評(píng)價(jià)

準(zhǔn)確性高,且操作簡(jiǎn)便E-test法得到的MIC值在某些菌種中要低于NCCLS推薦的常量肉湯稀釋法測(cè)得的MIC20%濃度CO2的環(huán)境中，可使此方法的結(jié)果更真實(shí)反映藥物對(duì)致病菌的敏感性缺點(diǎn)：1.價(jià)格太高每片40-50元2.吡咯類(lèi)MIC終點(diǎn)不好確定酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)

NCCLSM44-P.2003

培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂補(bǔ)充2％Glucose

優(yōu)點(diǎn)：有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性 操作簡(jiǎn)便，價(jià)廉缺點(diǎn)：目前只限氟康唑

NCCLS紙片擴(kuò)散法

麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（約為1~5×106CFU/ml）。菌懸液均勻涂布于藥敏板上步驟同細(xì)菌敏感試驗(yàn)操作一致，35～37℃孵育18～24小時(shí)，對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的菌株如新型隱球菌，菌液需調(diào)至1麥?zhǔn)蠁挝?，孵?8小時(shí)，光滑念珠菌也需孵育48小時(shí)讀取抑菌環(huán)直徑。酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)

NCCLS

M44-P.2003

氟康唑解釋標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的最小抑菌濃度

抑菌環(huán)直徑（mm)

MIC（ug/ml)敏感（S)>=19<=8劑量依賴性敏感（SDD)15-1816-32耐藥（R)<=14>=64S＝SusceptibleSDD=Susceptible－DoseDependentR=Resistant

酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)NCCLSM44-P.2003氟康唑?qū)?biāo)準(zhǔn)菌株24h抑菌環(huán)直徑（mm)的質(zhì)控允許范圍標(biāo)準(zhǔn)菌株 氟康唑25ug 沃爾康唑1ug白念珠菌ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌ATCC22019 22-33 28-37 熱帶念珠菌ATCC750 26-37 －克柔念珠菌 ATCC6258 － 16-25

ROSCO紙片擴(kuò)散法

ROSCO紙片擴(kuò)散法：1.克柔念珠菌： 麥?zhǔn)蠞岫?，生理鹽水1：10稀釋 菌液為5×105CFU/ml2.隱球菌屬： 1麥?zhǔn)蠞岫?.其它酵母菌：麥?zhǔn)蠞岫?，生理鹽水1：1稀釋×106CFU/ml將稀釋好的菌液涂布在改良的SHADOMY（）培養(yǎng)基上其它操作同細(xì)菌。

讀取抑菌環(huán)直徑近似到mm在大約80%抑制區(qū)為測(cè)量邊界在抑菌環(huán)內(nèi)個(gè)別細(xì)小或中等大小的菌落，<15可忽略不計(jì)Rosco紙片擴(kuò)散法藥敏結(jié)果判定兩種紙片擴(kuò)散法的比較Rosco紙片擴(kuò)散法檢測(cè)菌種念珠菌屬，隱球菌屬培養(yǎng)基改良SHADOMY瓊脂，試驗(yàn)藥品及劑量AMB10μg，IT8μg，F(xiàn)LA15μg，F(xiàn)C1，10μg，F(xiàn)C10μg，KET15μg等接種的菌量：5×105CFU/ml（克柔念珠菌先制成麥?zhǔn)蠞岫?，再用生理鹽水1：10。隱球菌屬配麥?zhǔn)喜幌♂專(zhuān)┢渌N配麥?zhǔn)蠞岫龋?：1稀釋培養(yǎng)條件念珠菌屬35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，新型隱球菌30℃培養(yǎng)42~48小時(shí)結(jié)果判讀FC及AMB100%被抑制唑類(lèi)藥物80%抑制質(zhì)控株光滑念珠菌2238NL

白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550NCCLS紙片擴(kuò)散法

檢測(cè)菌種念珠菌屬，隱球菌屬培養(yǎng)基Mueller-Hinton瓊脂中補(bǔ)充2%的葡萄糖和的美藍(lán)試驗(yàn)藥品及劑量FLA25μg接種的菌量1～5×106/mL培養(yǎng)條件35

℃孵育18～24小時(shí)新型隱球菌培養(yǎng)42~48小時(shí)結(jié)果判讀FC及AMB100%被抑制，唑類(lèi)藥物80%抑制質(zhì)控株白念珠菌ATCC90028近平滑念珠菌ATCC22019

Rosco紙片擴(kuò)散法各藥物折點(diǎn)粘膜酵母菌感染氟康唑，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug，特比奈吩，咪康唑等敏感：≥20mm 中介：12~19mm

耐藥：≤11mm兩性霉素B，制霉菌素伊曲康唑敏感：≥15mm

中介：10~14mm

耐藥：無(wú)抑菌環(huán)氟胞嘧啶10ug敏感：≥30mm用于黑曲霉

中介：23~29mm

耐藥：≤22mm灰黃霉素敏感：≥10mm

中介：－

耐藥：無(wú)抑菌環(huán)

系統(tǒng)性酵母菌感染氟康唑15ug 18-24h 敏感：≥30mm ≤4 中介：29~23mm 8-16耐藥：≤22mm ≥32 伊曲康唑8ug18-24h 敏感：≥20mm ≤0.06 中介：19~12mm 0.125 耐藥：≤11mm ≥0.25 這個(gè)MIC標(biāo)準(zhǔn)為紙片法的相應(yīng)值

Rosco紙片擴(kuò)散法各藥物折點(diǎn)

系統(tǒng)性酵母菌感染

酮康唑15ug 紙片和培養(yǎng)基廣州樂(lè)通公司可供應(yīng)

敏感：≥30mm ≤0.12 耐藥：≤22

兩性霉素10ug 敏感：≥15mm