臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量保證

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的

質(zhì)量保證

衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明.質(zhì)量保證

(QualityAssurance,QA)為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。

.室內(nèi)質(zhì)量控制（InternalQualityControl,IQC)的概念由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。可概括為:(1)執(zhí)行者：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室測定的重復(fù)性；(3)功能：決定了當(dāng)批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實(shí)驗(yàn)室測定的即時性評價。

.室間質(zhì)量評價（ExternalQualityAssessment,EQA）為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。這是對實(shí)驗(yàn)室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評價，而不是用來決定在實(shí)時的測定結(jié)果的可接受性。當(dāng)EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評價實(shí)驗(yàn)室操作時，常描述為實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（Proficiencytesting,PT）。在以前的文獻(xiàn)中，EQA常描述室間質(zhì)量控制。.批

(Run)在相同條件下所獲得的一組測定。

.定義正態(tài)分布(Gaussiandistribution)當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時間重復(fù)多次測定，當(dāng)測定數(shù)據(jù)足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應(yīng)測定值的個數(shù)，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。.正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學(xué)含義可用均數(shù)（X）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來說明。.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室

常規(guī)測定步驟標(biāo)本收集：選擇測定項目、標(biāo)本收集和保存。實(shí)驗(yàn)室測定：標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測、測定的有效性和臨床診療價值。報告和解釋：結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。.質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評之間的關(guān)系.臨床標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存

及其質(zhì)量控制標(biāo)本收集標(biāo)本保存標(biāo)本運(yùn)送.標(biāo)本收集標(biāo)本采集時間對擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本的類型和采集量采樣質(zhì)量的評價采樣及運(yùn)輸容器標(biāo)本采集中的防污染

.標(biāo)本采集時間對擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。

.標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備血液標(biāo)本采集分泌物標(biāo)本:采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其它雜物,但應(yīng)適度,過度清潔消毒有可能會去掉或破壞靶微生物,故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行。.標(biāo)本的類型和采集量標(biāo)本的類型:血清(漿)、分泌物、痰、糞便、尿和腦脊液等。標(biāo)本的采集量:應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。一般來說，如果標(biāo)本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測。對于定量測定來說，對標(biāo)本的收集要求更為精確。.采樣質(zhì)量的評價血清(漿)標(biāo)本:溶血、脂血等；分泌物、痰：評價內(nèi)容包括細(xì)胞組成，所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。評價方法：包括肉眼觀察,顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。.采樣及運(yùn)輸容器

標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使用；采樣及運(yùn)輸容器應(yīng)為密閉的一次性無菌裝置；采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴(kuò)增及檢測過程造成干擾。.標(biāo)本采集中的防污染

采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase失活。.標(biāo)本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對于核酸擴(kuò)增測定的有效性極為重要。使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，標(biāo)本可在室溫下穩(wěn)定約7天。.標(biāo)本保存臨床體液標(biāo)本長期保存應(yīng)在-70℃下。如為提取核酸后用于DNA擴(kuò)增分析的樣本，可于10mmol/LTris,1mmol/LEDTA(pH7.5～8.0)緩沖液中4℃下保存。用于RNA擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述緩沖液中-80℃或液氮下保存。核酸的乙醇沉淀物則可于-20℃下保存。.標(biāo)本運(yùn)送

樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實(shí)驗(yàn)室。樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制測定前的質(zhì)量控制核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制質(zhì)量控制的評價.測定前質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理理想的試劑和操作方法人員培訓(xùn).實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備；實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)用品要達(dá)到相應(yīng)的要求。加樣器的校準(zhǔn)？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機(jī)？熱循環(huán)儀？水浴箱和/或恒溫干浴儀？酶標(biāo)儀和洗板機(jī)？.理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū).產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計B.核酸擴(kuò)增檢測實(shí)驗(yàn)室設(shè)計的一般原則各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字口訣”.門試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)外走廊門門門門試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)外走廊門門門門AB.試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)門門門門空氣流向空氣流向空氣流向.走廊走廊試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室.門試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)門門門空氣流向空氣流向+空氣流向++走廊走廊試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向+空氣流向++其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室空氣流向.產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗.“無基因”或“無核酸”概念的重要性.基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控.帶濾芯吸頭的使用及質(zhì)檢首先制備一個含1～2%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸頭的最大體積為100μl，則將加樣器吸取體積調(diào)至110～120μl，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應(yīng)出現(xiàn)在濾芯之上，否則說明濾芯不嚴(yán)。

.核酸提取用離心管質(zhì)檢離心管PCR抑制物質(zhì)檢其他.擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測方法一是使用一種熱電偶探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動圖示記錄儀組成擴(kuò)增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測記錄系統(tǒng)，當(dāng)孔間溫度變異超出1℃時，其可測出來。具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴(kuò)增反應(yīng)管放置于擴(kuò)增儀各孔中，熱電偶探針透過擴(kuò)增反應(yīng)管蓋插至緩沖液中，然后按程序進(jìn)行一個常規(guī)的PCR擴(kuò)增，加熱模塊如為96孔，則至少要測定12孔不同位置孔內(nèi)的溫度，在整個擴(kuò)增過程中，可移動熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測至少要有一個擴(kuò)增周期。.擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測方法第二種方法并非直接測定孔內(nèi)溫度，而是通過擴(kuò)增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽性質(zhì)控樣本的擴(kuò)增反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀各孔中按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個或幾個孔結(jié)果有問題，則應(yīng)確定這一個或幾個孔是否會重復(fù)性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應(yīng)孔的熱傳導(dǎo)有損壞。.理想的試劑和操作方法

試劑盒的質(zhì)檢定量測定的精密度是測定組成步驟的變異和的平方根(SD)=

上式中SDa、SDb、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測等）的標(biāo)準(zhǔn)差.理想的試劑和操作方法改善測定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應(yīng)對試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸提取、測定方法和儀器操作寫出“標(biāo)準(zhǔn)操作程序”(SOP).實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立質(zhì)量手冊質(zhì)量體系程序文件標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)(相關(guān)記錄表格、報告).存在問題SOP：形式，缺乏可操作性記錄：檢查型。多而雜。質(zhì)控：形式或沒有分析：缺乏。.實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的內(nèi)涵寫你所應(yīng)做的做你所寫的記錄你已做的分析你已做的.看得見的看不見的...好習(xí)慣是生產(chǎn)力習(xí)慣即命運(yùn)思維習(xí)慣與行為習(xí)慣羅馬不是一天建成的(Romewasnotbuiltinaday).質(zhì)量體系文件的三大特性法規(guī)性、唯一性和適用性。法規(guī)性:是指文件一旦制定完成并批準(zhǔn)實(shí)施，就必須認(rèn)真執(zhí)行，按照相應(yīng)的文件去完成日常檢驗(yàn)工作，也就是前面所說的做你所寫的。并且文件的修改不能隨意，只能按規(guī)定的程序進(jìn)行。唯一性:則是指（1）一個實(shí)驗(yàn)室只能有一個質(zhì)量體系文件系統(tǒng)；（2）一項檢驗(yàn)活動只能有唯一的操作程序；（3）一項規(guī)定只能有唯一的理解，不產(chǎn)生歧義；（4）只能使用文件的有效版本，無效版本在實(shí)驗(yàn)室的任何地方都不能使用。適用性:是指質(zhì)量體系文件無統(tǒng)一格式；無標(biāo)準(zhǔn)文本；怎么做怎么寫，切合實(shí)際，具有可操作性，不拘一格。所有文件的規(guī)定均應(yīng)保證在臨床實(shí)際檢測工作中能完全做到。當(dāng)發(fā)現(xiàn)文件有不適合情況時，則應(yīng)立即按規(guī)定程序?qū)ξ募M(jìn)行修改。.SOP等于試劑盒說明書嗎？.怎樣編寫SOP？XXX單位XXX實(shí)驗(yàn)室XXX標(biāo)準(zhǔn)操作程序編號：啟用日期：版本：第頁共頁一目的：適用范圍：職責(zé)或責(zé)任人：（方法原理）（檢測設(shè)備和試劑）（所需的環(huán)境條件）操作步驟：

1．

2．

3．

五、本操作程序變動程序：六、相關(guān)的文件七、相關(guān)的記錄表格和報告編寫人審核人批準(zhǔn)人.SOP（5W和1H）誰來做(Who)：

責(zé)任人做什么(What)：適用范圍何時（When）：適用范圍何地（Where）：適用范圍為什么做（Why）：目的如何做（How）：操作步驟.....................

實(shí)驗(yàn)記錄表格的設(shè)計.存在問題表格種類繁多重復(fù)記錄表格無實(shí)用性，用于檢查的痕跡很重....記錄表格設(shè)計的基本原則信息充分簡單明了臨床標(biāo)本的檢測信息能有機(jī)聯(lián)系起來融入LIS系統(tǒng)？.

臨床PCR檢驗(yàn)流程記錄表

檢驗(yàn)日期

檢驗(yàn)項目：

擴(kuò)增儀中保存文件名：

使用說明：1．本記錄表須嚴(yán)格遵循試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)（產(chǎn)物分析區(qū)）單一流向移動，嚴(yán)禁逆向移動。2．各項工作執(zhí)行后，在相應(yīng)敘述前的“”內(nèi)打“”。3．本記錄表最后與相應(yīng)的標(biāo)本接收記錄等歸檔保存于擴(kuò)增區(qū)的專用文件柜內(nèi)，以備查找。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備試劑在有效期內(nèi)擴(kuò)增儀、加樣器和溫度計在校準(zhǔn)的有效期內(nèi)生物安全柜的濾膜在使用有效期內(nèi)消毒溶液在有效期內(nèi)洗眼器內(nèi)無菌生理鹽水在有效期內(nèi)離心管、帶濾芯吸頭已經(jīng)過質(zhì)檢合格

操作者：

.

試劑準(zhǔn)備區(qū)（1區(qū)）實(shí)驗(yàn)前：打開通風(fēng)設(shè)備實(shí)驗(yàn)臺面清潔（水或70%酒精擦拭）冰箱溫度：冷藏室（2~8℃）

℃；冷凍室（18℃2℃）

℃實(shí)驗(yàn)室溫度：

℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度：

（允許范圍：30%~80%）PCR試劑來源：（可直接列出有關(guān)廠家名稱）批號：XXXXXXX

檢驗(yàn)項目：

本次實(shí)驗(yàn)用量：

人份，剩余量：

人份。其他有關(guān)試劑配制：按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制1%含氯消毒液

毫升；按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制4％NaOH溶液

毫升；按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯

毫升；按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制

毫升；其他：儀器設(shè)備使用：離心機(jī)：正常不正常振蕩器：正常不正常超凈臺：正常不正常實(shí)驗(yàn)后：按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP清潔實(shí)驗(yàn)室臺面、地面、加樣器和離心機(jī)，并進(jìn)行紫外照射30分鐘以上。按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。

操作者：

.

標(biāo)本制備區(qū)（2區(qū)）實(shí)驗(yàn)前：打開通風(fēng)設(shè)備實(shí)驗(yàn)臺面清潔（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）溫度：冷藏室（2~8℃）

℃；冷凍室（18℃2℃）

℃實(shí)驗(yàn)室溫度：

℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度：

（允許范圍：30%~70%）陽性室內(nèi)質(zhì)控物來源：

濃度及批號：

擴(kuò)增位置：

陰性室內(nèi)質(zhì)控物來源：

批號：

擴(kuò)增位置：

所取理的標(biāo)本（對應(yīng)標(biāo)本接收的唯一編號）及擬擴(kuò)增位置：1 9 17 25

33 41

49

……2 10 18 26

34 42 503 11 19 27

35 43 514 12 20 28

36 44 525 13 21 29

37 45 536 14 22 30

38 46

547 15 23 31 39 47

558 16 24 32 40 48

56核酸提取及加樣過程：按XXX（列出編號）SOP進(jìn)行。儀器設(shè)備使用：生物安全柜：正常不正常恒溫儀溫度校準(zhǔn)：

℃離心機(jī)：正常不正常振蕩器：正常不正常實(shí)驗(yàn)后：按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP清潔實(shí)驗(yàn)室臺面、地面及儀器設(shè)備。按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。

操作者：

.

擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)（3區(qū)）實(shí)驗(yàn)前打開通風(fēng)設(shè)備實(shí)驗(yàn)臺面清潔（水或70%酒精擦拭）實(shí)驗(yàn)室溫度：

℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度：

（允許范圍：30%~70%）擴(kuò)增儀操作：開機(jī)自檢及運(yùn)行正常按XXX（列出編號）SOP進(jìn)行編程、參數(shù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線計算值：Slope值：（）Intercept值：（）r值：（）室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果：結(jié)果：

□填寫室內(nèi)質(zhì)控記錄、描質(zhì)控圖是否失控：□否□是實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見所附擴(kuò)增儀打印結(jié)果實(shí)驗(yàn)后：按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP清潔實(shí)驗(yàn)室臺面、地面及儀器設(shè)備。按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。

操作者：

失控原因及分析：（失控判斷標(biāo)準(zhǔn)及原因分析按XXXSOP進(jìn)行）.另外兩個存在較多問題的檔案記錄人員的技術(shù)檔案：一人一個檔案（包括個人基本情況；學(xué)歷、學(xué)位、任職資格、培訓(xùn)證、上崗證、榮譽(yù)證書等的復(fù)印件；論文、著作、成果等的目錄和必要的證明文件復(fù)印件；培訓(xùn)考核的記錄等。）儀器設(shè)備的技術(shù)檔案：一臺儀器一個檔案（包括儀器基本情況，如儀器設(shè)備名稱、型號、序列號、生產(chǎn)廠家、購置日期、啟用日期、目前放置地點(diǎn)、責(zé)任人等；儀器校準(zhǔn)的記錄（本次校準(zhǔn)日期和下次應(yīng)校準(zhǔn)的日期、校準(zhǔn)證書或數(shù)據(jù)）；維修維護(hù)的歷史記錄；儀器使用說明書、注冊證等的復(fù)印件；合格證書；配備的小配件如保險絲、燈泡等）.人員培訓(xùn)

方法原理核酸擴(kuò)增檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)儀器設(shè)備使用、維護(hù)和校準(zhǔn)結(jié)果的分析、報告及進(jìn)一步處理質(zhì)控的分析知其然又知其所以然。.實(shí)驗(yàn)室人員內(nèi)部培訓(xùn)的重要性外部培訓(xùn)提供的是“理念”，是被動的，更多的是“學(xué)習(xí)”內(nèi)部培訓(xùn)是主動的，源于實(shí)踐，高于實(shí)踐，更多的是“思考”.人員培訓(xùn).如何培訓(xùn)的舉例：新購儀器設(shè)備的操作培訓(xùn)在儀器購買合同中，加入培訓(xùn)的內(nèi)容：廠家提供培訓(xùn)計劃培訓(xùn)計劃應(yīng)包括：培訓(xùn)教材（含具體培訓(xùn)內(nèi)容，如儀器操作及維護(hù)校準(zhǔn)的SOP、安全性）、培訓(xùn)者資質(zhì)證明、培訓(xùn)所需時間與次數(shù)、需要接受培訓(xùn)方準(zhǔn)備的條件（人員、用具和場地等）、培訓(xùn)合格的考核方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)等。培訓(xùn)后保存所有有關(guān)記錄。.核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測

及其質(zhì)量控制一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質(zhì)量臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì)核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測的質(zhì)控產(chǎn)物檢測的質(zhì)控.核酸的分離純化

核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進(jìn)行評價。.臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì)

臨床標(biāo)本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑。.對臨床標(biāo)本中可能存在的

抑制/干擾物的質(zhì)控措施質(zhì)控措施：采用內(nèi)質(zhì)控（internalcontrol,IC）（通常稱為內(nèi)標(biāo)）的方法內(nèi)標(biāo)有兩種,即競爭性的和非競爭性的內(nèi)標(biāo)。.核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控已知弱陽性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標(biāo)本相同）：至少帶1份，其最后的檢測結(jié)果，應(yīng)是核酸提取和擴(kuò)增檢測的有效性的綜合反映。已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標(biāo)本相同）：至少帶1份，擴(kuò)增測定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染。.室內(nèi)質(zhì)控方法非統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計質(zhì)控方法.非統(tǒng)計學(xué)方法在檢測血液標(biāo)本的同時，檢測一定數(shù)量（與臨床樣本的數(shù)量相適應(yīng)）的已知弱陽性（與試劑宣稱的測定下限相適應(yīng)）和陰性的質(zhì)控樣本檢測有效的質(zhì)控判斷方法：陽性檢測為陽性（反應(yīng)性），陰性檢測為陰性（非反應(yīng)性）。.統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制

理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件測定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn)統(tǒng)計質(zhì)控方法.理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件基質(zhì)與待測樣本一致；所含待測物濃度接近試驗(yàn)的決定性水平；穩(wěn)定；靶值或預(yù)期結(jié)果已定；無已知的生物傳染危險性；單批可大量獲得；價廉.測定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序標(biāo)本量不大，如少于30份，定性測定有1份接近c(diǎn)ut-off的弱陽性和1份陰性質(zhì)控樣本應(yīng)可以滿足要求。樣本量大，則可按比例增加。定量測定則要根據(jù)試驗(yàn)的測定范圍，采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。核酸提取時，質(zhì)控樣本要隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中間。至于在測定中的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的獨(dú)特性即監(jiān)測污染發(fā)生的陰性質(zhì)控的設(shè)置。

可包括1份陰性原血清樣本、1份在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個空管和僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管。.陰性原血清質(zhì)控樣本的功能

監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染；擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。.在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個空管的功能監(jiān)測實(shí)驗(yàn)操作過程中的實(shí)驗(yàn)室污染和標(biāo)本間交叉污染.不能取代原血清陰性樣本。.僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管的功能監(jiān)測擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性。.實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染的鑒別可將一個或多個空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)30～60分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管為陰性，則說明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。.統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn)

檢驗(yàn)誤差有兩類，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質(zhì)控物測定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設(shè)備、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物出現(xiàn)問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。隨機(jī)誤差則表現(xiàn)為測定SD的增大，主要是由實(shí)驗(yàn)操作人員的操作等隨機(jī)因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制。.統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的功能統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產(chǎn)生及分析誤差產(chǎn)生的原因，采取措施予以避免。開展統(tǒng)計質(zhì)量控制前，應(yīng)將可以控制的誤差產(chǎn)生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內(nèi)質(zhì)控的前提，也是保證常規(guī)檢驗(yàn)工作質(zhì)量的先決條件。.統(tǒng)計質(zhì)控方法

基線測定質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義Levey-Jennings質(zhì)控圖方法Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法累積和(CUSUM)質(zhì)控方法“即刻法”質(zhì)控方法.基線測定最佳條件下的變異（Optimalconditionsvariance,OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routineconditionsvariance,RCV）；當(dāng)RCV與OCV接近，或小于2OCV時，則RCV是可以接受的。以上為批間變異。批內(nèi)變異的測定；室內(nèi)質(zhì)控物的測定準(zhǔn)確度的評價。.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)IQC統(tǒng)計

計算問題可使用質(zhì)控樣本擴(kuò)增后的IU/ml來進(jìn)行統(tǒng)計計算，也可用其對數(shù)值進(jìn)行。由于基因擴(kuò)增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，故使用其對數(shù)值來進(jìn)行質(zhì)控統(tǒng)計分析可能要更為方便一些。.質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義

質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式質(zhì)控規(guī)則的功能常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

.質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值±1～3SD來表示。當(dāng)質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值±3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值±3s范圍，即可將該批測定判為失控。.質(zhì)控規(guī)則的功能

簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。.常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義

符號

定義12S

一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S

一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S

兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限。41S

四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或－1s控制限。7T

七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變化。10X

十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（X）的同一側(cè)。.Levey-Jennings質(zhì)控圖方法也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量控制。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。.Levey-Jennings質(zhì)控圖..Levey-Jennings質(zhì)控圖

基本的統(tǒng)計學(xué)含義穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。..“假陽性”的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法基于日常檢驗(yàn)的陽性率比值(呈正態(tài)分布)直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）.“即刻”質(zhì)控方法

“即刻法”的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計學(xué)方法,即Grubs異常值取舍法只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。.室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的評價

IQC為一集體活動，除實(shí)際測定者外，還應(yīng)有另外一人對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。不能將IQC作為一個監(jiān)察方法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一次測定未達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)以建設(shè)性的而非批評的方式去探查失控的原因。除了將IQC數(shù)據(jù)作為日常質(zhì)控外，還應(yīng)定期評價累積數(shù)據(jù)以監(jiān)測在測定操作中的長期變化趨勢。評價應(yīng)定期進(jìn)行。.分析你已做的每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析

表象與真象多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析

趨勢的內(nèi)在含義儀器設(shè)備的使用情況分析

維護(hù)與校準(zhǔn)周期的有效性.弱陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因

核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。.陽性質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏低或?yàn)殛幮越Y(jié)果偏低陰性臨床標(biāo)本中無強(qiáng)陽性臨床標(biāo)本中有較強(qiáng)陽性臨床標(biāo)本中有陽性臨床標(biāo)本全為陰性觀察臨床標(biāo)本情況所用離心管含抑制物Taq酶活性降低核酸提取試劑效率低更換進(jìn)口離心管更換Taq酶再檢測更換核酸提取試劑所有標(biāo)本重新檢測核酸提取中靶核酸丟失核酸提取中抑抑物殘留核酸提取試劑混入擴(kuò)增儀孔間溫度差異隨機(jī)誤差檢測質(zhì)控樣本及3~5份已知陽性樣本質(zhì)控樣本測定正常且陽性樣本有些值增加質(zhì)控及已知陽性樣本測定仍異常按系統(tǒng)誤差途徑分析重新提取或已知濃度DNA在同一孔內(nèi)擴(kuò)增結(jié)果正常結(jié)果仍低進(jìn)行擴(kuò)增儀孔溫度校準(zhǔn)后再檢測Taq酶或逆轉(zhuǎn)錄酶失活.陰性質(zhì)控樣本的失控原因主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”和/或臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉“污染”

.陰性質(zhì)控樣本測定為陽性臨床標(biāo)本亦全為陽性臨床標(biāo)本中有陽性也有陰性擴(kuò)增產(chǎn)物“污染”試劑“污染”同時檢測的標(biāo)本情況擴(kuò)增產(chǎn)物輕度“污染”標(biāo)本間交叉“污染”3~5空管室內(nèi)靜置5~8份水樣本檢測試劑直接擴(kuò)增檢測驗(yàn)證驗(yàn)證5~8份水樣本檢測暫停日常檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室清潔、通風(fēng)更換試劑措施有陽性，則確認(rèn)有實(shí)驗(yàn)室“污染”無陽性，說明為標(biāo)本交叉“污染”改善操作措施.一個臨床PCR實(shí)驗(yàn)室對全年室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的分析舉例......IQC的局限性IQC可能測不出的誤差

測定前

測定中

測定后

樣本鑒定不對樣本吸取不對結(jié)果記錄錯誤

樣本貯存中變質(zhì)試劑加入不對此類誤差的發(fā)生率在不同的實(shí)驗(yàn)室有所不同，一般要求小于

0.1%，且應(yīng)均衡地分布于測定前