禽流感核酸檢考核結(jié)果匯報

2007年禽流感核酸檢測考核結(jié)果匯報12核酸檢測是禽流感檢測的一種重要手段

快速、靈敏、特異性高多種因素影響檢測的結(jié)果標本的采集核酸的提取反應(yīng)體系的優(yōu)化，包括引物探針的設(shè)計，試劑的選擇熟練的操作

良好的實驗室管理3

2005年以來中國大陸h5n1人禽流感確診病例實驗室診斷

病例數(shù)病毒分離核酸檢測血清學(xué)檢測22++

3++2+1+1

+

42006年核酸考核：參考品制備和網(wǎng)絡(luò)實驗室評價檢測。制備標準品包括：病毒裂解液、體外轉(zhuǎn)錄rna、樣品包括不同檢測的靈敏度設(shè)灰色檢測區(qū)、統(tǒng)一配發(fā)核酸提取試劑和引物。2007年核酸考核：了解各省禽流感核酸檢測能力

考核標本：病毒裂解液、不同時發(fā)放核酸提取試劑和引物

流感網(wǎng)絡(luò)實驗室核酸考核進程07年考核目的

深入了解各省份禽流感核酸檢測能力的基本情況。了解各省禽流感核酸檢測工作中可能存在的實際問題。了解核酸檢測工作的不足并確定下一步的工作重點。5組織形式

本次考核由中國cdc發(fā)文，國家流感中心執(zhí)行。本次考核定位為基礎(chǔ)水平考核，并附有情況調(diào)查表。本次考核標本發(fā)放全國31個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的流感網(wǎng)絡(luò)實驗室，考核時間為1個月。本次考核內(nèi)容為鑒定10份盲樣的型別及亞型。6考核標本的設(shè)計考核標本共10份盲樣，均為病毒裂解液。分別為禽流感h5n1標本4份，h9n2標本1份，h3n2和b型混合標本1份，h1n1標本1份，b型標本1份，陰性標本2份，病毒濃度均控制在易檢范圍之內(nèi)。h5n1標本為病毒原液10-1-10-4的梯度稀釋，以此結(jié)果來判定核酸檢測的靈敏度是否合格；h3n2標本混有b型，此項內(nèi)容考核結(jié)果判定；陰性標本考核是否有交叉污染出現(xiàn)。7所用毒株名稱：h1n1:a/jiangsuxinghua/33/2007h3n2:a/jiangsuguangling/316/2007b:by/fujianggulou/1774/2007h5n1：a/xinjiang/1/2006(h5n1)h9n2:a/chicken/foshan/48/98(h9n2)8標本亞型amct值h5ct值n1

ct值h510-117.3216.2719.24h510-222.0020.9722.46h510-324.9023.8527.46h510-427.9027.6930.59h510-530.7430.5533.15h118.17h316.68h920.869考核標本的定量結(jié)果10

考核標本的制備1.穩(wěn)定性檢測：

冰盒內(nèi)室溫4天。

冰盒內(nèi)室溫4天，后-20度2周。2.可重復(fù)性驗證：

不同儀器

不同操作人

不同標本抽樣

運輸和結(jié)果提交情況

本次考核標本發(fā)放全國31個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），到截止日期為止除西藏外所有被考核實驗室均提交了結(jié)果。

本次考核標本在運輸過程中均未出現(xiàn)問題，接受標本時均有干冰存在并無液體漏出。國家流感中心11考核結(jié)果22個省份結(jié)果正確，河北、遼寧、黑龍江、云南、貴州五省h3n2+b標本由于實驗思路不同未檢出b型，黑龍江未檢測出h3,用an2引物檢測出n2亞型。陜西沒有檢出h9只檢出了n2。寧夏、貴州兩省h5n1的10-4稀釋度標本未檢出。廣西首次h5n1與h9n2均未檢出，第二次提交全部正確。陰性標本均無問題，沒有污染情況發(fā)生。國家流感中心12考核結(jié)果分析完整的標注應(yīng)當(dāng)有樣品名，引物名，片斷大小，marker梯度等等。13考核結(jié)果分析：實驗結(jié)果標注不清

很多省份標注不夠規(guī)范。國家流感中心14考核結(jié)果分析國家流感中心15考核結(jié)果分析realtime結(jié)果應(yīng)該有兩個圖，一個應(yīng)包含陽性曲線和域值線的情況并標明所用引物和樣品名稱，另一個應(yīng)包含機器顯示的ct值。16我們發(fā)放的禽流感引物和人季節(jié)性流感引物在同種亞型之間是可能存在交叉的，7號其實是h3n2標本。考核結(jié)果分析：引物交叉情況說明h9n2的n2引物與h3n2的交叉情況17考核結(jié)果分析：引物交叉情況說明甲型鑒定引物的交叉情況18考核結(jié)果分析：鑒定的思路國家流感中心19考核結(jié)果分析：鑒定的思路國家流感中心20考核結(jié)果分析：鑒定的思路21考核結(jié)果分析：rt-pcr國家流感中心22考核結(jié)果分析：rt-pcr23考核結(jié)果分析：realtime結(jié)果

所提交的結(jié)果當(dāng)中25個省份做了realtime，其中18個省份結(jié)果較好主要存在的問題：實驗體系沒有對照。對儀器操作不夠熟悉。24考核結(jié)果分析：realtime結(jié)果25考核結(jié)果分析：realtime結(jié)果26下一步工作方向

進一步完善和優(yōu)化鑒定引物。進一步優(yōu)化反應(yīng)體系。優(yōu)化實驗和結(jié)果判定方案。27實驗室管理pcr儀器配置情況常用試劑及耗材供應(yīng)商情況

個人防護設(shè)備檢測標本的內(nèi)容及檢測方法的應(yīng)用調(diào)查結(jié)果問卷調(diào)查情況1.各省級cdcpcr儀器配置情況儀器設(shè)備非常好上海市、浙江省、廣東?。╬cr儀三臺，real-timepcr儀兩臺）儀器設(shè)備較好黑龍江、安徽、江西、甘肅、寧夏回族自治區(qū)（兩種類型的pcr儀各有兩臺)儀器設(shè)備充足具備pcr儀、real-timepcr各一臺儀器名稱n0臺1臺2臺3臺n％n％n％n％常規(guī)pcr儀realtimepcr儀3030103.30101733.356.7161353.343.330100表1各省級cdcpcr儀配置情況2.各省級cdc常用試劑及耗材供應(yīng)商情況流感中心推薦使用的試劑和耗材常用試劑（takara）promega、qiagen（常用）roche、sigma的試劑（發(fā)達省份）供應(yīng)商名稱nn%rocheqiagensigmainvitrogenpromega其它30303030303063064148201006013.346.726.7表2各省級cdc常用試劑及耗材供應(yīng)商情況供應(yīng)商名稱nn％axygengrienercostar其它303030302869493.3203013.3表3各省級cdc常用耗材供應(yīng)商情況3.個人防護設(shè)備各省級cdc個人防護設(shè)備基本齊全個別省級cdc缺少個別防護設(shè)備如有的cdc缺少n95口罩，有些省缺少面罩。個人防護設(shè)備nn％連體防護服護目鏡面罩防護鞋套n95口罩3030303030302925302910096.783.310096.7表4各省級cdc個人防護設(shè)備4.檢測標本的內(nèi)容及檢測方法的應(yīng)用遼寧、上海、山東、湖南4個省級cdc除了對人類標本樣品進行流感病毒檢測之外，還對動物來源的樣品進行檢測。通過對各省級cdc禽流感檢測方法應(yīng)用的調(diào)查可以反映出各省級cdc日常檢測工作的內(nèi)容。廣西壯族自治區(qū)cdc日常工作的內(nèi)容僅為快速流感檢測，而河北、上海、浙江、河南、廣東5個省級cdc除了調(diào)查表中提到的4個檢測方法的應(yīng)用外，還分別進行不同類別的檢測，如爆發(fā)疫情的檢測、人流感病毒亞型的鑒別、呼吸道病毒鑒別診斷、不明原因肺炎病例檢測、環(huán)境標本檢測。檢測內(nèi)容/檢測方法的應(yīng)用nn％檢測內(nèi)容-檢測人類標本-檢測動物標本檢測方法應(yīng)用-禽流感疑似病例標本檢測-有病禽接觸史病人的監(jiān)測-快速流感檢測-流感病毒亞型檢測-其它類別的檢測3030303030303030429192826510013.396.763.393.386.716.7表5各省cdc檢測標本內(nèi)容和檢測方法應(yīng)用5.實驗室的管理通過對生物安全工作、實驗分區(qū)、標準操作規(guī)程以及實驗相關(guān)信息記錄等4個方面考察各省cdc實驗室管理的情況。調(diào)查方面nn％生物安全工作

-生物安全水平

bsl-2bsl-3-生物安全說明或sop-實驗人員定期培訓(xùn)

-員工上崗資格認證

-指定人員負責(zé)生物安全3030303030302553030303083.316.7100100100100表6各省cdc實驗室管理情況調(diào)查方面nn％實驗分區(qū)

-樣品處理和檢測有獨立實驗室

-樣品接收有獨立房間或指定區(qū)域

-體系配制有獨立房間或指定區(qū)域

-核酸提取有獨立房間或指定區(qū)域-pcr產(chǎn)物檢測有獨立房間或指定區(qū)域有如下操作規(guī)程

-病毒rna提取

-rt-pcr檢測-核酸電泳檢測

-核酸電泳

-污染控制303030303030303030301429303030303030302983.316.710010010010010010010096.7調(diào)查方面nn％實驗相關(guān)信息記錄

-檢測日期

-樣品編號

-試劑貨號

-試劑保質(zhì)日期

-實驗操作人員簽名

-共同檢測人員簽名不同標本保存溫度得當(dāng)

-原始樣品

-病毒核酸

-cdna-pcr產(chǎn)物303030303030303030303030302930303030302910010010096.7100100100100100100存在個別的問題1pcr儀器設(shè)備不全2檢測方法應(yīng)用內(nèi)容少3實驗室分區(qū)不明確從這次問卷調(diào)查的結(jié)果看，各個省級cdc網(wǎng)絡(luò)實驗室的總體水平良好，但是仍有一些問題存在。調(diào)查總結(jié)本次問卷的調(diào)查的目的在于對各省級cdc流感/禽流感檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室的儀器配置，試劑和耗材的使用、個人防護設(shè)備、檢測工作內(nèi)容及應(yīng)用，以及實驗室的管理等方面進行了解和促進。作為流感/禽流感檢測的網(wǎng)絡(luò)實驗不僅需要良好的是實驗儀器及防護設(shè)備的配置，來保證日常工作快速、安全的運轉(zhuǎn)，同時也需要在實驗室的管理上進行提高，從而使得檢測結(jié)果的高標準和可重復(fù)性。nic推薦one-steppcr引物更新目的基因原使用引物新推薦引物引物序列甲型amflua-m-f65flua-m-r400m336bpflua-m-f173flua-m-r382am209bpflua-m-f30flua-m-r2645’-ttctaaccgaggtcgaaacg-3’5’-acaaagcgtctacgctgcag-3’h5h5ha-f920h5ha-r1138h5ha-f248h5-r6475’-gtgacgaattcatcaatgtrccg-3’5’-ctctggtttagtgttgatgtyccaa-3’n1an1-f550an1-r1164an1-f580an1-r9185’-tgaagtacaatggcataataacwgacac-3’5’-ccactgcatatatatcctatttgatactcc-3’注：原推薦引物仍可使用內(nèi)參rnp（ribonucleasep：核糖核酸酶）序列44基因引物和探針序列rnprnp-forward

rnp-reverse5’-agatttggacctgcgagcg-3’5’-gagcggctgtctccacaagt-3’rnp-probe5’-ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’samplencpcrnp