第六章化學物的一般毒性

16:03:011第六章

化學毒物的一般毒性作用公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室房蕾16:03:012一般毒性（generaltoxicity）是指外源化合物在一定的接觸劑量、一定的接觸時間和一定的接觸方式下對實驗動物產(chǎn)生綜合毒效應(yīng)的能力。分類急性毒性:acutetoxicity亞急性毒性:subacutetoxicity

亞慢性毒性:subchronictoxicity

慢性毒性:chronictoxicity一般毒性評價和研究的主要目的：1、確定受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)；2、確定受試物毒作用的劑量–反應(yīng)關(guān)系；3、確定毒作用的靶器官；4、確定損害的可逆性。16:03:01316:03:014第一節(jié)

急性毒性作用一、急性毒性的概念二、急性毒性試驗目的三、急性毒性試驗方法的要點四、急性毒性分級和評價五、LD50應(yīng)用中的問題16:03:015一、急性毒性的概念急性毒性（acutetoxicity）是指機體一次或在24小時內(nèi)多次接觸一定劑量外源化學物后在短期內(nèi)(一般最長14天)所產(chǎn)生的毒作用及死亡。≤3次14天16:03:016二、急性毒性試驗的目的1.求出受試化合物的致死劑量（LD50）及其它毒性參數(shù)(急性毒作用帶Zac:acuteeffectzone)，以初步估計該化合物對人類毒害的危險性；2.闡明受試化合物急性毒性的劑量－反應(yīng)關(guān)系與中毒特征；3.為重復劑量、亞慢性和慢性毒性試驗及其他毒理學試驗的劑量設(shè)計和觀察指標選擇提供參考依據(jù)；4.提供毒理學機制研究的初步線索。16:03:017常用參數(shù)：1.LD50：毒理學實驗中最重要的參數(shù)。LD50反映毒性的大小，LD50，其毒性。但只是個劑量界點，不能反映化學毒物致死作用的中毒特征；2.

Zac=LD50/Limac

：反映急性閾劑量距離LD50的寬窄。

Zac大，則化學毒物引起急性死亡的危險性小，反之則危險毒大；3.

LD84/LD16代替LD50/Limac使一種靈敏性更好，重復性強且容易求出的參數(shù)，可以較好的反映急性毒性特征。最小毒作用劑量死亡劑量LimacLD50016:03:018三、急性毒性試驗方法的要點（一）實驗動物的選擇和要求怎么來做實驗?（二）受試物及處理（三）染毒方法（四）劑量選擇（五）毒性作用觀察（六）觀察時間和周期替代實驗方法經(jīng)典實驗方法（一）實驗動物的選擇和要求主要原則16:03:019衛(wèi)生毒理學實驗動物的物種和品系實驗動物的年齡和體重實驗動物的性別實驗動物的分組與數(shù)量實驗前動物的準備工作向為人類科學做出貢獻的動物致敬1.主要原則①.對受試物的反應(yīng)與人近似②.實驗操作方便,易于飼養(yǎng)管理③.自然壽命不太長的物種④.經(jīng)濟且易于獲得16:03:0110衛(wèi)生毒理學16:03:0111衛(wèi)生毒理學2.實驗動物的物種和品系A(chǔ):首選哺乳動物，其中以大小鼠為最常用；B:使用兩種種屬動物:嚙齒類和非嚙齒類(rodentspeciesandnon-rodentspecies)；

C:不同的接觸途徑選擇實驗動物的種類有所不同。大小鼠犬、猴經(jīng)口、吸入：大小鼠；經(jīng)皮：大鼠、豚鼠或家兔D:級別：Ⅱ級（清潔級）或以上動物。物種不同導致毒性差異可為劑量差異和效應(yīng)差異。16:03:0112衛(wèi)生毒理學3.動物的年齡和體重

除特殊情況外一般要求選用剛成年未曾交配和受孕的健康動物

大

鼠

180-240g

小

鼠

18-25g

家

兔

2-2.5kg

豚

鼠

200-250gBeagle犬

4-6kg

雜種犬8-15kg體重變異≤20%體重16:03:0113衛(wèi)生毒理學4.實驗動物的性別通常要求雌雄各半。如已知動物對受試物的敏感性有性別差異，則選擇敏感的性別；如有資料或預試驗發(fā)現(xiàn)受試物對雌雄動物毒效應(yīng)有明顯的性別差異，則要求分別求出各自的LD50。5.實驗動物的分組與數(shù)量分組由LD50計算方法決定，一般4-6組；大小鼠10只/組，犬等大動物6只/組；分組時嚴格遵循隨機化原則。

16:03:0114衛(wèi)生毒理學Foxpro軟件在實驗動物隨機分組中的應(yīng)用6.實驗動物的預檢大小鼠、豚鼠、兔的檢疫期1周，犬和猴2-3周；16:03:0115衛(wèi)生毒理學目的:

Ａ：適應(yīng)環(huán)境

Ｂ：篩檢不健康動物7.實驗動物的給藥前禁食處理

經(jīng)口染毒要求作禁食處理大鼠、小鼠——隔夜進食；染毒后禁食4h大動物——每日上午喂食前染毒染毒后繼續(xù)禁食2~4h，但在禁食時要保障飲水。16:03:0116衛(wèi)生毒理學試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境恒定的溫度：22±3℃濕度：30～70%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格16:03:0117衛(wèi)生毒理學16:03:0118（二）受試物及其處理

受試物常用劑型為:

水溶液:用蒸餾水或生理鹽水配制

油溶液

混懸液

天然植物油、10%阿拉伯乳膠染毒最大量：經(jīng)口20ml/Kg經(jīng)皮2ml/Kg靜脈1ml/Kg（5min以上）肌內(nèi)0.5ml/Kg每眼0.01ml直腸0.5ml/Kg陰道大鼠0.2ml兔1ml吸入2mg/L鼻猴或犬每鼻孔0.1ml16:03:0119衛(wèi)生毒理學（三）染毒方法的選擇急性毒性染毒途徑的選擇應(yīng)考慮以下幾個因素：①人類接觸該物質(zhì)的實際途徑和方式

②受試物的性質(zhì)和用途

③有利于不同化學物之間急性毒性大小的比較④各種受試物毒性評價程序的要求16:03:0120染毒途徑＞＞＞＞＞≥吸入染毒經(jīng)皮染毒皮內(nèi)注射經(jīng)口染毒皮下注射腹腔注射肌肉注射≥靜脈染毒16:03:01211.經(jīng)口染毒經(jīng)口染毒可分為灌胃、喂飼、吞咽膠囊等方式。一般來說新物質(zhì)均先進行經(jīng)口染毒途徑的急性毒性試驗。經(jīng)口灌胃染毒是急性毒性實驗常用的方法。等容量灌胃法大小鼠10ml/kg16:03:01222.經(jīng)呼吸道染毒氣管內(nèi)注入：在動物麻醉情況下，將已消毒

滅菌的受試物（粉塵混懸液或液體）

注入氣管，使之分布于左右肺內(nèi)

動式吸入吸入

靜式吸入16:03:0123靜式吸入染毒將一定數(shù)量的實驗動物置于一個固定體積的容器內(nèi)(染毒柜)，加入一定量的易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)受試物，在一定時間內(nèi)，使動物連續(xù)吸入并觀察毒性反應(yīng)。優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、消耗受試物少

缺點：實驗動物得不到氧氣補充；受試物的濃度16:03:0124動物種屬呼吸通氣量(L/小時)最低需氣量(L/小時)不同容積染毒柜放置動物數(shù)(只)25L50L100L300L小鼠大鼠1.4510.182.4530.53~56~1012~151~236~405~6表1實驗動物最低需氣量及不同體積染毒柜應(yīng)放置動物數(shù)關(guān)系16:03:0125動式吸入染毒

是將實驗動物置于空氣流通的染毒柜中。染毒柜裝備有新鮮空氣輸入和隨時補充受試物的配氣系統(tǒng)以及將含有受試物的空氣排除的動力系統(tǒng)。優(yōu)點：實驗過程中氧和C02分壓、溫濕度及受試物的濃度相對恒定缺點：裝置復雜、價格昂貴、消耗受試物較多

16:03:01263.經(jīng)皮膚染毒

實驗動物應(yīng)在皮膚解剖、生理等方面與人類近似，以豚鼠、家兔最為合適，一般采用動物脊柱兩側(cè)皮膚，常用斑貼法和浸尾法。

硫化鋇+滑石粉1：4硫化鈉+滑石粉1：4化學法脫毛

機械法脫毛脫毛

16:03:01274.經(jīng)注射途徑染毒

注射染毒途徑有經(jīng)腹腔、靜脈、肌內(nèi)、皮下等。操作時需注意控制注射液的容積和注射的速度。

16:03:0128幾種動物不同注射染毒途徑注射量范圍(ml)

注射途徑

小鼠

大鼠

豚鼠

兔

狗

靜脈

0.2-0.5

1.0-2.01.0-5.03.0-10.0

5.0-15.0

肌內(nèi)

0.1-0.2

0.2-0.5

0.2-0.50.5-1.02.0-5.0

皮下

0.1-0.50.5-1.0

0.5-1.0

1.0-3.0

3.0-10.0

腹腔

0.2-1.01.0-3.02.0-5.0

5.0-10.0

16:03:012916:03:0130（四）劑量選擇

急性毒性試驗的重要目的是測定LD50，必須設(shè)計好分組數(shù)與染毒劑量，通過來確定。

預實驗:先查閱相關(guān)文獻,弄清與該化學物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相似化學物的LD50。原則：用少量動物，以較大劑量間隔染毒，找出10%-90%或0%-100%的致死劑量范圍。預實驗？16:03:0131

正式試驗：組數(shù)的確定：由計算LD50的方法決定。如Bliss法、寇氏法，一般設(shè)置5-8個劑量組，霍恩法固定設(shè)4個劑量組。組距的確定：

i=[lgLD100(或LD90)-lgLD0(或LD10)]／(

n-1)i為組距（相鄰的兩個劑量組對數(shù)劑量之差）16:03:0132衛(wèi)生毒理學（五）毒性作用觀察

急性毒性試驗的觀察和記錄內(nèi)容主要包括:①中毒體征及發(fā)生過程②死亡情況和時間分布③體重④病理形態(tài)學改變16:03:013316:03:0134衛(wèi)生毒理學（六）觀察時間和周期急性毒性的觀察周期一般為１４天，LD50計算時以觀察周期內(nèi)各組動物的總死亡數(shù)為依據(jù)。對于速殺型化學毒物可僅計算24h的死亡率求LD50。24h經(jīng)典急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學、血液學及其它化驗檢查所提供的深入細致的毒性信息。16:03:0135衛(wèi)生毒理學急性毒性替代試驗（一）固定劑量法（二）急性毒性分級法（三）上-下移動法16:03:0136衛(wèi)生毒理學“3R”-減少、優(yōu)化、替代（一）固定劑量法不以死亡為觀察終點；利用預先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學物的毒性反應(yīng)來對化學物的毒性進行分級；16:03:0137衛(wèi)生毒理學固定劑量范圍：25、200、2000mg/kg

/（5、50、300或2000mg/kg）。明顯毒性（一）固定劑量法歐共體（EEC）的急性經(jīng)口毒性分級標準為：

高毒（LD50<25mg/kg）；有毒（LD50為25~200mg/kg）；有害（LD50為200~2000mg/kg）；不分級（LD50>2000mg/kg）。16:03:0138衛(wèi)生毒理學毒性分級：一致性80.2%；毒性反應(yīng)：無明顯差異；實驗所用動物數(shù)：經(jīng)典平均24.2只固定劑量法平均14.8只（二）急性毒性分級法以死亡為終點，每階段3只動物，根據(jù)死亡動物數(shù)，平均經(jīng)2～4階段即可判斷急性毒性。從25、200、2000mg/kg三個/（5、50、300或2000mg/kg四個）固定劑量中選一個開始試驗，根據(jù)結(jié)果判斷下一步的實驗方案。優(yōu)點：所用動物少，仍可得到可接受的結(jié)論。16:03:0139衛(wèi)生毒理學（三）上－下移動法以死亡為終點；根據(jù)初步資料，在真正的平均致死劑量左右，確定第一個動物接受化學物的劑量，由第一只動物染毒后的反應(yīng)決定第二只動物接受的劑量；16:03:0140衛(wèi)生毒理學6-10只推薦劑量：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000或5000mg/kg。16:03:0141衛(wèi)生毒理學四、急性毒性分級和評價

急性毒性試驗求出LD50值，通過LD50值進行毒性分級，評價毒物的急性毒性強弱，比較毒物的急性毒性大小。16:03:0142

外來化合物急性毒性分級(WHO)毒性分級大鼠一經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入４h，死亡２-４只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)對人可能致死的劑量g/kg總量（g/60kg）劇

毒<1

<10

<5

<0.05

0.1

高

毒

1-10-5-

0.05-

3

中等毒

50-100-44-0.5-

30

低

毒

500-1000-350-

5-250

微

毒5000-10000-2180-

>15

>1000

16:03:0143表

工業(yè)毒物急性毒性分級標準

毒性分級小鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)

小鼠吸入2小時LC50(ppm)

兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)

劇

毒<10<50<50高

毒

11~100051~50051~500中等毒

101~1000501~5000501~5000低

毒

1001~100005001~500005001~50000微

毒>10000

>50000>5000016:03:0144WHO于2003年公布《全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度》（GSH）對于急性毒性分組以LD50/LC50值（近似）為依據(jù)劃分。

接觸途徑第1類第2類第3類第4類第5類經(jīng)口（mg/kg)5503002000經(jīng)皮（mg/kg)50200100020005000氣體（ppm,V）10050025005000蒸汽（mg/L）0.52.01020粉塵與煙霧（mg/L）0.050.51.05五、LD50應(yīng)用中的問題1.評價藥物或化學物時，LD50給予的有效信息較少，實用性有限（不能反映毒作用特征）；2.LD50的波動性很大，影響因素很多（年齡、性別、身體情況及環(huán)境條件等）；3.物種差異對LD50影響很大；4.經(jīng)典急性毒性試驗消耗的動物量大。16:03:0145衛(wèi)生毒理學16:03:0146第一節(jié)

急性毒性作用（一）實驗動物的選擇和要求（二）受試物及處理（三）染毒方法（四）劑量選擇（五）毒性作用觀察（六）觀察時間和周期一、急性毒性的概念二、急性毒性試驗目的三、急性毒性試驗方法的要點四、急性毒性分級和評價五、LD50應(yīng)用中的問題16:03:0147第二節(jié)

短期、亞慢性和慢性毒性作用

蓄積毒性作用亞慢性毒性作用慢性毒性作用一、蓄積毒性作用

（一）.蓄積作用的基本概念（二）.蓄積毒性研究方法

1.蓄積系數(shù)法

2.生物半減期法16:03:0148衛(wèi)生毒理學16:03:0149衛(wèi)生毒理學（一）.蓄積作用的基本概念1.蓄積作用(accumulation)是指化學毒物連續(xù)或反復多次地與機體接觸，當其吸收速度超過生物轉(zhuǎn)化和排泄的速度時，在體內(nèi)的總量就會逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化學毒物的蓄積作用。化學物容易蓄積的組織和器官稱為儲存庫。蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的基礎(chǔ)。血漿蛋白脂肪組織肝臟腎臟骨骼16:03:0150衛(wèi)生毒理學

物質(zhì)蓄積蓄積功能蓄積2.物質(zhì)蓄積(materialaccumulation):當人或動物連續(xù)或反復多次地接觸化學毒物一定時間之后，用化學分析的方法能夠測出機體內(nèi)存在該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物時，稱為物質(zhì)蓄積。

（一）.蓄積作用的基本概念物質(zhì)蓄積：蓄積部位與其靶器官一致,有機汞蓄積于腦組織致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。3.功能蓄積(functionalaccumulatio):當人或動物連續(xù)、反復多次地接觸化學毒物一定時間之后，雖不能測出該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物，但機體有慢性中毒的癥狀出現(xiàn)，這種情況稱為功能蓄積。功能蓄積是化學毒物引起的損害效應(yīng)不斷積累的結(jié)果，也可能是由于滯留于機體內(nèi)的化學毒物或其代謝產(chǎn)物數(shù)量極微，用現(xiàn)有的分析方法不能檢出。16:03:0151衛(wèi)生毒理學（一）.蓄積作用的基本概念功能蓄積：如有機磷農(nóng)藥，多次膽堿酯酶酶活性下降疊加作用。16:03:0152衛(wèi)生毒理學（二）.蓄積毒性研究方法

1.蓄積系數(shù)法2.生物半減期法蓄積毒性實驗的目的是通過求出蓄積系數(shù)k，了解化學毒物蓄積毒性的強弱，并為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。16:03:0153衛(wèi)生毒理學（二）.蓄積毒性研究方法

1.蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)法是一種以生物效應(yīng)為指標,用經(jīng)驗系數(shù)(k)評價蓄積作用的方法,即將多次染毒和一次染毒所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)(或死亡)進行比較.16:03:0154衛(wèi)生毒理學蓄積系數(shù)是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)(或死亡)的累積劑量[ED50(n)]與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)(或死亡)的劑量[ED50(1)]的比值,即:K=ED50(n)／ED50(1)16:03:0155蓄積系數(shù)K

蓄積毒性分級

＜1

高度蓄積

1～明顯蓄積

3～

中度蓄積

5～輕度蓄積

衛(wèi)生毒理學蓄積毒性分級標準

K值越小，表示化學毒物的蓄積性越大;K值增大，通常認為K≥5者，蓄積作用極弱。1.蓄積系數(shù)法16:03:0156衛(wèi)生毒理學

蓄積系數(shù)法常用的實驗方案1.蓄積系數(shù)法①固定劑量法(1/20—1/5LD50)②

劑量遞增法(0.1LD50,4天，1.12倍，28天)③劑量固定的20天蓄積法陰性對照組

1/20LD501/10LD501/5LD501/2LD50

四個劑量組2.生物半衰期法生物半衰期法是用毒物動力學原理描述化學毒物在機體內(nèi)的蓄積作用；16:03:0157衛(wèi)生毒理學t1/2短者，達到蓄積極限的時間也短；反之則長。蓄積極限值(A∞)等于每日機體吸收化學毒物的量(a)與t1/2的乘積，再乘以常數(shù)1.44。A∞=1.44at1/2二、亞慢性、慢性毒性作用16:03:0158衛(wèi)生毒理學(一).基本概念(二).試驗目的(三).試驗方法要點(四).評價(一).基本概念短期毒性是指實驗動物或人連續(xù)接觸外源化學物4周（28天）內(nèi)所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。16:03:0159衛(wèi)生毒理學亞慢性毒性(subchronictoxicity)是指機體連續(xù)接觸較長時間、較大劑量的化學毒物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。

10%動物壽命的范圍，對于嚙齒類動物通常為1~6個月沒有明確的劑量范圍下限，但上限應(yīng)低于LD50(一).基本概念慢性毒性（chronictoxicity）:是指實驗動物或人長期（甚至終生）反復接觸低劑量的化學毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。16:03:0160衛(wèi)生毒理學(一).基本概念16:03:0161衛(wèi)生毒理學較常用的為28天短期毒性試驗—藥品、消毒劑等評價規(guī)范；亞慢性毒性試驗較常用的為90天亞慢性毒性試驗—可用來判斷慢性毒性效應(yīng)；慢性毒性試驗常用的為24個月慢性毒性試驗。(一).基本概念新藥臨床前毒性評價中的長期毒性評價試驗期限取決于臨床擬用藥的期限，一般為臨床用藥的2~3倍。16:03:0162衛(wèi)生毒理學如臨床用藥3天，則試驗期限為14天；臨床用藥10天，則試驗期限為1個月；未限制的臨床用藥，則進行6個月的亞慢性毒性試驗。16:03:0163衛(wèi)生毒理學(二).試驗目的

1.確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜，對在急性及亞急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗中未發(fā)現(xiàn)的毒作用；

2.研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官；

3.研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量—反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL），提出此受試物的安全限量參考值;4.研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性;5.亞慢性毒性試驗為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計及觀察指標選擇提供依據(jù);6.確定不同動物物種對受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。1.實驗動物選擇2.染毒途徑3.染毒劑量與分組4.觀察指標16:03:0164衛(wèi)生毒理學(三).試驗方法要點(三).試驗方法要點16:03:0165衛(wèi)生毒理學1.實驗動物選擇：

亞慢性毒性試驗（未成年）

年齡：大鼠80~100g

狗8~12月小鼠10~15g數(shù)量：小動物≥20

大動物≥6性別：雌雄各半

慢性毒性試驗（初斷乳）年齡：大鼠50~70g

狗<8月小鼠初斷乳數(shù)量：小動物≥40

大動物≥8性別：雌雄各半(三).試驗方法要點16:03:0166衛(wèi)生毒理學染毒途徑的選擇應(yīng)盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該受試物的途徑或方式，并與預期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。

2.染毒途徑主要有:①經(jīng)口：可用灌胃法或喂飼法。一般常用喂飼法，即將受試物與食物或飲水混勻，使動物自然攝入。②經(jīng)呼吸道：2~6h/d（4h）;③經(jīng)皮膚：2~6h/d。均勻、穩(wěn)定；30天試驗≤10g/100g飼料；90天試驗≤8g/100g飼料；慢性試驗≤5g/100g飼料。實驗動物染毒期限：工業(yè)毒理學——3－6個月食品毒理學——6個月－1年環(huán)境毒理學——6個月－1年致癌試驗——

接近或等于動物的預期壽命16:03:0168衛(wèi)生毒理學(三).試驗方法要點亞慢性毒性的劑量選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組急性毒性的閾劑量

1/20~1/5LD50組距：3~10倍，最低不小于2倍16:03:0169衛(wèi)生毒理學3.染毒劑量與分組慢性毒性的劑量選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組亞慢性閾劑量或其1/5~1/21/10

LD50組距：2~5倍，最低不小于2倍明顯毒性，少量動物死亡<10%無毒性反應(yīng)(三).試驗方法要點16:03:0170衛(wèi)生毒理學

對于人群主動攝入的食品和藥品，可采用人體可能擬用的最高劑量為劑量設(shè)計依據(jù)。3.染毒劑量與分組A.大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30和100倍，非嚙齒類可用5、15、50倍；

B.當預期受試物沒有明顯毒性時，至少等于人擬用劑量的最大倍數(shù)，保健食品為100倍，化學藥品為30倍，中藥為50倍。(三).試驗方法要點16:03:0171衛(wèi)生毒理學4.觀察指標

(1)一般性指標

1)外觀體征和行為活動

每日觀察實驗動物出現(xiàn)的外觀體征和行為改變，記錄各體征出現(xiàn)的時間先后順序，尤其注意被毛的光潔度與色澤、眼分泌物、呼吸、神態(tài)、行為等。一般性指標實驗室檢查系統(tǒng)尸解和組織病理學檢查外觀體征和行為活動動物體重食物利用率(三).試驗方法要點16:03:0172衛(wèi)生毒理學

2)動物體重

實驗動物在生長發(fā)育期的體重增長情況是綜合反映動物健康狀況最基本的靈敏指標之一。如各實驗組動物體重增長異常并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，可以肯定是一種綜合毒性效應(yīng)。(1)一般性指標

(三).試驗方法要點16:03:0173衛(wèi)生毒理學3)食物利用率a.毒物影響食欲，則進食，體重也，但食物利用率不一定變化；b.毒物干擾食物吸收或代謝，食物利用率會。即動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)（g體重/100g飼料）。(1)一般性指標

(三).試驗方法要點16:03:0174衛(wèi)生毒理學（2）實驗室檢查1）血常規(guī)檢查

包括紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)與分類、血小板計數(shù)和凝血功能相關(guān)指標等

2）血液生化指標

尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、血糖（GLU）、總膽固醇（T-CHO）等

最大取血量為總血量的10%，總血量一般為50ml/kg(三).試驗方法要點16:03:0175衛(wèi)生毒理學（3）系統(tǒng)尸解和組織病理學檢查1）臟器重量和臟器系數(shù)：一般稱取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、卵巢或睪丸、腦等臟器濕重，并記算其臟器系數(shù)臟器系數(shù)：或稱臟／體比值，是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g體重計。該指標比較適用于實質(zhì)性臟器

臟器系數(shù)增大，反映臟器腫大，病變可能為增生、充血、水腫等；臟器系數(shù)減小，反映臟器發(fā)育不良或萎縮等。肺水腫16:03:0176衛(wèi)生毒理學正常肺(三).試驗方法要點16:03:0177衛(wèi)生毒理學2）病理學檢查

組織病理學檢查是亞慢性、慢性毒性試驗中最重要的檢測指標之一，目的是確定受試物對機體毒作用的靶器官、損傷的性質(zhì)和程度，獲得其毒性作用的形態(tài)學證據(jù)。

（3）系統(tǒng)尸解和組織病理學檢查肺結(jié)核干酪樣壞死16:03:0178衛(wèi)生毒理學乳腺癌風濕性心肌炎(三).試驗方法要點16:03:0179衛(wèi)生毒理學

最后一次給藥后24h，每組活殺部分動物，檢測各項指標，余下動物停止染毒，繼續(xù)觀察2-4周。如24h后的病理學檢查發(fā)現(xiàn)有異常變化，將余下動物活殺剖檢，重點觀察毒性反應(yīng)器官，了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲緩性毒性。（4）可逆性觀察(三).試驗方法要點16:03:0180衛(wèi)生毒理學特異性指標：指能反映毒物對機體毒作用本質(zhì)的特征性指標，常與其毒作用機制有關(guān)，可作為效應(yīng)生物學標志。（5）特異性指標及其他心血管系統(tǒng)：心電圖、血壓、眼底檢測；神經(jīng)系統(tǒng)：神經(jīng)行為、神經(jīng)反射等檢查；16:03:018116:03:0182衛(wèi)生毒理學慢性毒性試驗的注意事項1.重視試驗項目管理；（專業(yè)）

2.合理的試驗設(shè)計；（合理）

3.試驗動物環(huán)境的要求；（GLP）4.檢測條件的控制；（穩(wěn)定可靠）總之，慢性毒性試驗應(yīng)在優(yōu)良實驗室規(guī)范下進行。（四）.亞慢性、慢性毒性作用評價評價中易出現(xiàn)的問題：觀察指標的統(tǒng)計學差異是否有生物學意義和毒理學意義？16:03:0183衛(wèi)生毒理學劑量相關(guān)趨勢反應(yīng)重現(xiàn)性相關(guān)指標變化差異大小和性別差異歷史性對照的作用第三節(jié)局部刺激試驗眼刺激試驗皮膚原發(fā)性刺激試驗皮膚致敏試驗16:03:0184衛(wèi)生毒理學局部刺激試驗目的是了解外源化學物對皮膚、眼睛的局部刺激性和腐蝕性，包括眼刺激、皮膚刺激；皮膚致敏試驗可了解化學物對哺乳動物是否可以引起皮膚變態(tài)反應(yīng)及其程度；農(nóng)藥、化學品和消毒劑毒理學試驗程序16:03:0185衛(wèi)生毒理學一、眼刺激試驗觀察終點為眼刺激和眼腐蝕；眼刺激性：眼睛前表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛可逆性炎癥反應(yīng)；眼腐蝕性：眼睛前表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛不可逆性組織損傷；16:03:0186衛(wèi)生毒理學一、眼刺激試驗試驗方法：推薦Draize試驗；動物：家兔；試驗的基本原則：受試物以一次劑量滴入每只實驗動物的一側(cè)眼睛結(jié)膜囊內(nèi)，以未作處理的另一側(cè)眼睛作為自身對照。在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評分，以此評價受試物對眼睛的刺激作用。觀察期限應(yīng)能足以評價刺激效應(yīng)的可逆性或不可逆性。16:03:0187衛(wèi)生毒理學家兔4只，滴眼后觀察結(jié)膜（發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物）、角膜（渾濁程度及范圍）和虹膜（充血、腫脹和角膜周圍充血）的反應(yīng)，按規(guī)定的分級標準進行評分，觀察期為7天；16:03:0188衛(wèi)生毒理學16:03:0189衛(wèi)生毒理學眼損害積分角膜：混濁（以最致密部位為準）無潰瘍形成或混濁散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細節(jié)不清，瞳孔大小勉強可見角膜混濁，虹膜無法辨認01234虹膜：正常皺褶明顯加深，充血、腫脹、角膜周圍有中度充血，瞳孔對光仍有反應(yīng)出血、肉眼可見破壞，對光無反應(yīng)（或出現(xiàn)其中之一反應(yīng)）012結(jié)膜：充血（指瞼結(jié)膜、球結(jié)膜部位）血管正常血管充血呈鮮紅色血管充血呈深紅色，血管不易分辨彌漫性充血呈紫紅色水腫無輕微水腫（包括瞬膜）明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻水腫至眼瞼近半閉合水腫至眼瞼大半閉合

012301234表1眼損害的評分標準表2眼刺激性反應(yīng)分級可逆眼損傷微刺激性動物的角膜、虹膜積分=0；結(jié)膜充血或結(jié)膜水腫積分≤2，且積分在＜7天內(nèi)降至0輕刺激性動物的角膜、虹膜、結(jié)膜積分在≤7天降至0刺激性動物的角膜、虹膜、結(jié)膜積分在8～21天內(nèi)降至0不可逆眼損傷腐蝕性①動物的角膜、虹膜和/或結(jié)膜積分在第21天時＞0；②2/3動物的眼刺激反應(yīng)積分：角膜渾濁≥3和/或虹膜=216:03:0190衛(wèi)生毒理學二、皮膚原發(fā)性刺激試驗皮膚原發(fā)性刺激試驗包括單次和多次皮膚刺激試驗，完整皮膚和破損皮膚刺激試驗等；觀察終點為皮膚刺激和皮膚腐蝕；皮膚刺激：皮膚接觸化學物后產(chǎn)生的局部可逆性的炎癥反應(yīng)；皮膚腐蝕：皮膚接觸化學物后產(chǎn)生的局部不可逆性的組織損傷；16:03:0191衛(wèi)生毒理學二、皮膚原發(fā)性刺激試驗試驗方法：推薦Draize試驗；動物：家兔及豚鼠；試驗的基本原則：將受試物一次(或多次)涂敷于受試動物的皮膚上，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察動物皮膚局部刺激作用的程度并進行評分。采用自身對照，以評價受試物對皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗觀察期限應(yīng)足以評價該作用的可逆性或不可逆性。16:03:0192衛(wèi)生毒理學急性皮膚刺激性試驗步驟:豚鼠12只，按體重隨機分成2組，每組各6只，分完整皮膚組和破損組，于給藥前將豚鼠背部脊柱兩側(cè)毛剪去，面積為2.5*2.5cm2，完整皮膚組去毛后24小時檢查無皮膚損傷者可用于實驗；破損皮膚組按要求將去毛處皮膚破損，備用。試驗時將受試物0.5mL（g）均勻地涂敷于豚鼠的左側(cè)去毛區(qū)，右側(cè)去毛區(qū)涂基質(zhì)，并用紗布或細帶固定，二組動物同樣操作，4小時后除去紗布，用生理鹽水洗凈，除藥后1小時、24小時、48小時、72小時檢查周部有無紅斑、水腫（并以不敷藥側(cè)為對照）。16:03:0193衛(wèi)生毒理學多次皮膚刺激性試驗步驟:試驗前將實驗動物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為2cm×3cm，涂抹面積2.5cm×2.5cm。取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，當受試物使用無刺激性溶劑配制時，另一側(cè)涂溶劑作為對照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14d。從第二天開始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時后觀察結(jié)果。

16:03:0194衛(wèi)生毒理學16:03:0195衛(wèi)生毒理學

表3皮膚刺激反應(yīng)評分皮膚反應(yīng)積分

紅斑和焦痂形成

無紅斑0

輕微紅斑（勉強可見）1

明顯紅斑2

中度~重度紅斑3

嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4

水腫形成

無水腫0

輕微水腫（勉強可見）1

輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2

中度水腫（皮膚隆起約1mm）3

重度水腫（皮膚隆起超過1mm，范圍擴大）4最高積分816:03:0196衛(wèi)生毒理學表4皮膚刺激強度分級積分均值

強度0~＜0.5無刺激性0.5~＜2.0輕刺激性2.0~＜6.0

中刺激性6.0~8.0

強刺激性以下3種情況不適宜做皮膚刺激試驗：根據(jù)結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系及理化特性推測可能有腐蝕性的物質(zhì)（如pH≤2或＞11.5）；急性經(jīng)皮毒性試驗顯示有很強系統(tǒng)毒性的物質(zhì)；急性經(jīng)皮毒性試驗中染毒劑量達2000mg/kg仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)。16:03:0197衛(wèi)生毒理學三、皮膚致敏試驗皮膚致敏反應(yīng)/過敏性接觸性皮炎（SkinSensitization/AllergicContactDermatitis)：是皮膚對一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)。對于人類這種反應(yīng)可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反應(yīng)不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。16:03:0198衛(wèi)生毒理學

皮膚第一次接觸外源化學物產(chǎn)生較輕的反應(yīng)或無明顯反應(yīng)，經(jīng)過一段時間再次接觸，會引起遲發(fā)性超敏反應(yīng)，且在最初染毒部位以外的皮膚均可發(fā)生。16:03:0199衛(wèi)生毒理學機制是抗原抗體反應(yīng)。二種類型試驗：福氏完全佐劑法和不加佐劑法16:03:01100衛(wèi)生毒理學佐劑提高敏感性，可檢出弱致敏物質(zhì)誘導接觸(InductionExposure)：指機體通過接觸受試樣品以達到誘導產(chǎn)生致敏狀態(tài)目的的試驗性暴露；誘導期(InductionPeriod)：指機體通過接觸受試樣品而誘導出過敏狀態(tài)所需的時間；激發(fā)接觸(ChallengeExposure)：機體接受誘導暴露后，再次接觸受試樣品的試驗性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反應(yīng)。16:03:01101衛(wèi)生毒理學試驗動物:首選健康、成年的白色豚鼠，體重250～300g?；驹瓌t：實驗動物通過多次皮膚涂抹誘導接觸受試樣品10～14d（誘導期）后，給予激發(fā)劑量的受試樣品，觀察實驗動物，并與對照動物比較對激發(fā)接觸受試樣品的皮膚反應(yīng)強度。16:03:01102衛(wèi)生毒理學實驗步驟：誘導接觸：試驗前24h實驗動物背部左側(cè)去毛，去毛范圍為4cm2～6cm2。于第0、7、14d分別將0.4ml新配制的受試樣品（最小刺激濃度）涂布在背部左側(cè)2cm×2cm的區(qū)域，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠帶封閉固定6h后，移去敷貼物，清除殘留受試樣品。16:03:01103衛(wèi)生毒理學激發(fā)接觸：末次誘導2W后，即第28d，將0.4ml受試樣品（最大無刺激濃度,建議為誘導濃度的1/2）敷貼于豚鼠右側(cè)背部2cm×2cm的脫毛區(qū)(試驗前24h去毛)，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，后者緊貼皮膚，再以無刺激膠帶封閉固定6h后，移去敷貼物，清洗方法同前。16:03:01104衛(wèi)生毒理學

取0.1毫升注射于左前臂掌側(cè)前1/3中央皮內(nèi)（注意：左手），約在48～72小時內(nèi)，局部出現(xiàn)紅腫硬節(jié)（0.5-1.5）的陽性反應(yīng)。若受試者未感染過結(jié)核桿菌，則注射局部無變態(tài)反應(yīng)發(fā)生。

16:03:01105衛(wèi)生毒理學過敏原檢測：皮膚點刺實驗結(jié)果觀察與評價：在24、48h后分別觀察局部皮膚反應(yīng)。用盲法觀察對照組和試驗組。按表5對局部皮膚反應(yīng)評分。當受試樣品組動物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2時，判為該動物出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)陽性，并計算致敏率，按表6判定受試樣品的致敏強度。16:03:01106衛(wèi)生毒理學16:03:01107衛(wèi)生毒理學表5皮膚致敏反應(yīng)試驗評分標準反應(yīng)評分紅斑和焦痂形成無反應(yīng)0輕微的紅斑(勉強可見)1明顯紅斑(散在或小塊紅斑)2中度-重度紅斑3嚴重紅斑(紫紅色)至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫(勉強可見)1中度水腫(皮膚隆起輪廓清楚)2嚴重水腫(皮膚隆起約1cm或以上)3最高積分7注：皮膚致敏程度分級同表216:03:01108衛(wèi)生毒理學表5皮膚致敏反應(yīng)試驗分級標準致敏率（%）等級致敏程度＜9Ⅰ弱9～Ⅱ輕度29～Ⅲ中度65～Ⅳ強≥81Ⅴ極強注：致敏率是反應(yīng)評分為1或以上的動物數(shù)占該組動物總數(shù)的百分比，Ⅰ級致敏度沒有意義，在實際使用下無致敏危險。TheEnd!16:03:01109衛(wèi)生毒理學

第四節(jié)化學毒物所致機體損傷

的組織病理學改變及其評價16:03:01110衛(wèi)生毒理學一.化學毒物對靶器官系統(tǒng)損傷的病理學改變（一）化學毒物所致靶器官系統(tǒng)損傷的基本病變1.細胞損傷：本質(zhì)是化學毒物作用下細胞生化代謝發(fā)生異?；蛲Ｖ梗毎麅?nèi)生命活動嚴重障礙和基本結(jié)構(gòu)的破壞崩解，變性壞死；2.血液循環(huán)障礙：充血、瘀血、出血、水腫、血栓形成等；3.炎癥4