第七章酶分子工程-化學(xué)修飾課件

第七章酶的分子工程之二：酶蛋白的化學(xué)修飾第七章酶的分子工程之二：1酶修飾的方向

1．核酸水平2．蛋白質(zhì)水平本章主要介紹第二個(gè)部分酶修飾的方向

1．核酸水平本章主要介紹第二個(gè)部分2一、酶蛋白的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾主要是利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)一定的活化步驟后與酶分子上的某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶分子的結(jié)構(gòu)與功能。一、酶蛋白的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾主要是利用修飾3二、酶的分子修飾的目的：1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能2.增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性3.維持酶結(jié)構(gòu)功能的完整性與抗蛋白水解酶4.消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境二、酶的分子修飾的目的：1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能4SOD：對(duì)普通非活性部位賴氨酸中∈—氨基的修飾在保留原有的生物活性，穩(wěn)定性增強(qiáng)、在體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，由6min-15min,延長(zhǎng)到15hr以上。SOD的化學(xué)修飾可以增強(qiáng)SOD構(gòu)象的穩(wěn)定性、抗蛋白水解酶的能力及消除對(duì)人體的免疫原性。真正能夠產(chǎn)生抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗炎、祛班美容等功效。SOD：對(duì)普通非活性部位賴氨酸中∈—氨基的修飾5具體說(shuō)來(lái)，如：提高酶活力改進(jìn)酶的穩(wěn)定性允許酶在一個(gè)變化的環(huán)境中起作用改變最適pH值或最適溫度改變酶的特異性；使它能催化不同的底物，使之轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物改變催化反應(yīng)的類型提高催化過(guò)程的反應(yīng)效率等等具體說(shuō)來(lái)，如：6三、影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素（一）影響蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的因素微區(qū)的極性氫鍵效應(yīng)靜電效應(yīng)位阻效應(yīng)蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性三、影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素（一）影響蛋白質(zhì)功能基7微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。介質(zhì)極性降低，pK升高：乙酸：水80%乙醇100%乙醇pK：4.766.8710.32微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。8從整體來(lái)看，局部極性的改變對(duì)色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的影響最?。粚?duì)氨基和組氨酸反應(yīng)性的影響較大；對(duì)酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應(yīng)性影響最大。極性對(duì)整個(gè)反應(yīng)速度的影響還與反應(yīng)的類型有密切關(guān)系從整體來(lái)看，局部極性的改變對(duì)色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的9靜電效應(yīng):不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個(gè)組氨酸殘基，其pk值是：碳酸酐酶：5.91；6.04；7.00；7.23葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71;5.74；6.50組氨酸殘基在這兩個(gè)蛋白質(zhì)中的pK值范圍是5.37～7.23，幾乎相差2個(gè)pH單位。模型化合物的數(shù)據(jù)指出，這些變化可能是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。靜電效應(yīng):不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK值是不同的。例如，碳10位阻效應(yīng)：處于蛋白質(zhì)表面的功能基，：一般說(shuō)來(lái)比較容易與修飾劑反應(yīng)。但是，如果烷基在空間上緊靠功能基，會(huì)使修飾劑不能與功能基接觸，這時(shí)就要出現(xiàn)位阻效應(yīng)。對(duì)枯草桿菌蛋白酶：它的所有的10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且其羥基幾乎在所有情況下都沒(méi)有形成氫鍵。但是，如果對(duì)它進(jìn)行徹底硝化和碘化后，10個(gè)酪氨酸中，只有8個(gè)被修飾。這種情況很可能是空間障礙引起的。位阻效應(yīng)：處于蛋白質(zhì)表面的功能基，：一般說(shuō)來(lái)比較容易與修飾11蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡(jiǎn)單氨基酸中的同樣基團(tuán)相比，反應(yīng)性要差。但是，每個(gè)蛋白質(zhì)分子中至少有一個(gè)基團(tuán)對(duì)一定的試劑顯示出超反應(yīng)性。酶的催化活性基團(tuán)通常對(duì)修飾劑是有反應(yīng)性的，但酶的超反應(yīng)基團(tuán)不一定是酶活性部位上的基團(tuán)，可能與酶的功能或構(gòu)象沒(méi)有明顯聯(lián)系。例如，木瓜蛋白酶中的19個(gè)酪氨酸殘基中，只有一個(gè)能與二異丙基氟磷酸酯反應(yīng)，修飾后酶活性并不改變。蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別12還有幾種因素也能改變蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性，如電荷轉(zhuǎn)移，共價(jià)鍵形成，金屬螯合旋轉(zhuǎn)自由度等。還有幾種因素也能改變蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性，如電荷轉(zhuǎn)移，共價(jià)鍵13（二）修飾劑反應(yīng)性的決定因素選擇吸附靜電相互作用位阻因素催化因素局部環(huán)境的極性（二）修飾劑反應(yīng)性的決定因素選擇吸附14選擇吸附化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在低或高極性區(qū)的，有時(shí)可以根據(jù)對(duì)速度的飽和效應(yīng)，檢測(cè)出蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物的形成。正象酶-底物復(fù)合物那樣，蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物形成后，修飾過(guò)程的速度加強(qiáng)了。這種速度加強(qiáng)，部分是由于選擇性吸附的結(jié)果。選擇吸附化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在低15靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。靜電相互作用可使修飾劑向多功能部位中的一個(gè)殘基定位，或向雙功能基的一側(cè)定位。此外，靜電排斥力能抑制修飾作用靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電16位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。如果修飾劑的大小超過(guò)這個(gè)部位的大小，則不能發(fā)生修飾反應(yīng)位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生17催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異。例如、對(duì)硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對(duì)胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸的乙?；瘜儆谕粰C(jī)理，但苯乙酸鹽的反應(yīng)性差，這在較大程度上與酶的酸堿催化有關(guān)。催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，18局部環(huán)境的極性許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無(wú)關(guān)。溶劑效應(yīng)是很復(fù)雜的局部環(huán)境的極性許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)19四、設(shè)計(jì)酶的化學(xué)修飾（一）對(duì)酶性質(zhì)的了解酶的活性中心酶的穩(wěn)定條件最佳反應(yīng)條件酶的側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)等等四、設(shè)計(jì)酶的化學(xué)修飾（一）對(duì)酶性質(zhì)的了解20（二）修飾劑的選擇實(shí)際要根據(jù)修飾目的來(lái)選擇：1）：如：對(duì)氨基的修飾可有幾種情況：修飾所有氨基，而不修飾其它基團(tuán)；僅修飾α-氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基以及修飾具有催化活性的氨基等。修飾的部位和程度一般可用選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件來(lái)控制。1.選擇修飾劑要考慮的問(wèn)題（二）修飾劑的選擇實(shí)際要根據(jù)修飾目的來(lái)選擇：1.選擇修飾劑要212）：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須選擇能引入最大電荷量的試劑。用順丁烯二酸酐可將中性的巰基和酸性pH下帶正電荷的氨基轉(zhuǎn)變成在中性pH下帶負(fù)電的衍生物。2）：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須223）：如果要修飾的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，則試劑應(yīng)選擇在水中有一定溶解性的。3）：如果要修飾的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中進(jìn)行234）.在選擇試劑時(shí)，還必須考慮反應(yīng)生成物容易進(jìn)行定量測(cè)定。如果引入的基團(tuán)有特殊的光吸收用同位素標(biāo)記。。。4）.在選擇試劑時(shí)，還必須考慮反應(yīng)生成物容易進(jìn)行定量測(cè)定。245）.試劑體積過(guò)大，往往由于空間障礙而不能與作用的基團(tuán)接近。一般來(lái)說(shuō)，試劑的體積小一些為宜，這樣既能保證修飾反應(yīng)順利進(jìn)行，又可減少因空間障礙而破壞蛋白質(zhì)分子嚴(yán)密結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn)。5）.試劑體積過(guò)大，往往由于空間障礙而不能與作用的基團(tuán)接近。25選擇修飾劑是個(gè)綜合權(quán)衡的過(guò)程：修飾反應(yīng)要完成到什么程度；對(duì)個(gè)別氨基酸殘基是否專一；在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒(méi)有限度；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物；反應(yīng)是否需要可逆；是否適合于建立快速、方便的分析方法等等選擇修飾劑是個(gè)綜合權(quán)衡的過(guò)程：修飾反應(yīng)要完成到什么程度；26就修飾劑本身而言：修飾劑自身的性質(zhì)：修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長(zhǎng)度對(duì)蛋白的吸附性修飾劑反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目和位置修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件一般而言：要求修飾劑有較大的分子量、良好的生物相容性和水溶性、修飾劑分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長(zhǎng)就修飾劑本身而言：修飾劑自身的性質(zhì)：272.用于修飾酶活性中心的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備以下—些特征：選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行；標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過(guò)降解分離出來(lái)，進(jìn)行鑒定；反應(yīng)的程度能用簡(jiǎn)單的技術(shù)測(cè)定。當(dāng)然，不是單獨(dú)一種試劑就能滿足所有這些條件。一種試劑可能在某一方面比其它試劑優(yōu)越，而在另—方面則較差。因此，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮吞囟ǖ臉悠穪?lái)決定使用什么樣的試劑。2.用于修飾酶活性中心的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備以下—些特征：28(三）反應(yīng)條件的選擇除允許修飾能順利進(jìn)行外，還必須滿足如下要求：一是不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性。（必須做對(duì)照試驗(yàn)）二是有利于專一性修飾蛋白質(zhì)。為此，反應(yīng)條件應(yīng)盡可能在保證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變或少變的情況下進(jìn)行。要考慮反應(yīng)的溫度、pH、反應(yīng)介質(zhì)和緩沖液組成緩沖液可改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象或封閉反應(yīng)部位，因而影響修飾反應(yīng)，如，磷酸鹽是某些酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，碳酸酐酶的酯酶活力能被氯離子抑制(三）反應(yīng)條件的選擇除允許修飾能順利進(jìn)行外，還必須滿足如下要29反應(yīng)基本條件1.反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例2.反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度和pH條件3.反應(yīng)溫度和時(shí)間以上條件隨修飾類型不同有很大差異，需做大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定反應(yīng)基本條件1.反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例30（四）反應(yīng)的專一性在蛋白質(zhì)化學(xué)修飾研究中，反應(yīng)的專一性非常重要。若修飾劑專一性較差，除控制反應(yīng)條件外，還可利用其它途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)修飾的專一性。（四）反應(yīng)的專一性在蛋白質(zhì)化學(xué)修飾研究中，反應(yīng)的專一性非常重311．利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性活性蛋白質(zhì)特殊的空間結(jié)構(gòu)能影響某些基團(tuán)的活性。同樣條件下，二異丙基氟磷酸酯（DFP）能與胰凝乳蛋白酶的Ser作用，迅速使酶失活不能與胰凝乳蛋白酶原及一些簡(jiǎn)單的模擬化合物作用。在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團(tuán)，在適當(dāng)條件下只是其本身發(fā)生作用，而其它基團(tuán)皆不作用，這種現(xiàn)象稱為“位置專一性”，這是由于它在蛋白質(zhì)分子中所處的位置環(huán)境所決定的1．利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性活性蛋白質(zhì)特殊的空間322．選擇不同的反應(yīng)pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)(pKa)是不同的。所以控制不同的反應(yīng)pH，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的專一性2．選擇不同的反應(yīng)pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)(pK33如：用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí)，試劑在不同pH條件下可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側(cè)鏈及α-氨基、ε-氨基發(fā)生作用。

pH＞７ICH2COO-+蛋白質(zhì)-SH－－→蛋白質(zhì)-S-CH2COO-+H++I-

pH＞2

ICH2COO-+蛋白質(zhì)-SCH3－－→蛋白質(zhì)-S(CH3)–CH2COO-+I-

pH＞8.5ICH2COO-+蛋白質(zhì)-NH2－－→蛋白質(zhì)-NH-CH2COO-+H++I-

pH＞5.5ICH2COO-+蛋白質(zhì)—咪唑基-NH－－→蛋白質(zhì)-咪唑基-N-CH2COO-如：用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí)，試劑在343．利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性在高pH下：

氰酸、二硫化碳、O-甲基異脲和亞氨酸等氨基脲和胍的衍生物。雖然巰基也能與上述試劑作用，但因pH高，與巰基形成的產(chǎn)物迅速被分解3．利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性在高pH下：354．親和標(biāo)記親和標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)專一性修飾的重要途徑。親和標(biāo)記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。在作用前，試劑先以非共價(jià)形式結(jié)合到蛋白質(zhì)的活性部位上，然后再發(fā)生化學(xué)作用，將試劑掛在活性部位基團(tuán)上。例如，對(duì)甲基苯磺酰氯能作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上4．親和標(biāo)記親和標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)專一性修飾的重要途徑。36又如：

TPCK對(duì)胰凝乳蛋白酶活性中心組氨酸咪唑環(huán)的親和標(biāo)記

又如：

TPCK對(duì)胰凝乳蛋白酶活性中心組氨酸咪唑環(huán)的親和標(biāo)記375．差別標(biāo)記在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們保護(hù)著蛋白質(zhì)的活性部位基團(tuán)，使這些基團(tuán)不能與試劑作用。然后將底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位素標(biāo)記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來(lái)被底物或抑制劑保護(hù)的基團(tuán)是帶放射性同位素標(biāo)記的。用這一方法可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)。5．差別標(biāo)記在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們386．利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異有時(shí)在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。例如，核糖核酸酶在晶體狀態(tài)下進(jìn)行羧甲基化時(shí)，反應(yīng)主要集中在119號(hào)His上，對(duì)第12號(hào)His的修飾很少，兩者之比為60：1。但在水溶液中進(jìn)行同樣的修飾時(shí)，兩者之比為15:1，換言之，在晶體狀態(tài)下羧甲基化反應(yīng)的專一性比溶液狀態(tài)下提高3倍6．利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異有時(shí)在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高39目前采用的方法：對(duì)酶蛋白的非活性主鏈進(jìn)行部分水解；利用小分子或大分子物質(zhì)對(duì)酶的活性部位或非活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾；對(duì)酶輔因子的置換而力圖改變酶的反應(yīng)類型等等五、酶分子的化學(xué)修飾目前采用的方法：五、酶分子的化學(xué)修飾40（一）酶的表面修飾1.化學(xué)固定化：一般是直接通過(guò)酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。（一）酶的表面修飾412.酶的小分子修飾作用：主要是利用一些小分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有乙基、糖基和甲基等。2.酶的小分子修飾作用：42幾種重要的修飾反應(yīng)1．酰化及其相關(guān)反應(yīng)幾種重要的修飾反應(yīng)1．?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)432．烷基化反應(yīng)2．烷基化反應(yīng)443．氧化和還原反應(yīng)3．氧化和還原反應(yīng)454．芳香環(huán)取代反應(yīng)4．芳香環(huán)取代反應(yīng)46附：特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1．巰基的化學(xué)修飾常用：烷基化劑、?；?、馬來(lái)酰亞胺附：特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1．巰基的化學(xué)修飾常用472．氨基的化學(xué)修飾2．氨基的化學(xué)修飾483．羧基的化學(xué)修飾3．羧基的化學(xué)修飾494．咪唑基的化學(xué)修飾4．咪唑基的化學(xué)修飾505．胍基的化學(xué)修飾5．胍基的化學(xué)修飾513.酶的大分子修飾作用：可分為非共價(jià)修飾和共價(jià)修飾兩大類：1）大分子非共價(jià)修飾：利用一些大分子試劑通過(guò)與酶非共價(jià)相互作用，對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)。例如：聚乙二醇、右旋糖苷等通過(guò)氫鍵固定于酶分子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶活力；另外一些蛋白質(zhì)可以通過(guò)相互作用，排除分子表面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。3.酶的大分子修飾作用：522）大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。

例如：用聚乙二醇共價(jià)修飾SOD，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。2）大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶53聚乙二醇（PEG）

___常使用的水溶性大分子修飾劑

溶解度高既溶于水，又溶于大多數(shù)有機(jī)試劑通常無(wú)毒性，也無(wú)抗原性生物相容性好聚乙二醇（PEG）

___常使用的水溶性大分子修飾劑544.分子內(nèi)交聯(lián)：增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如：胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過(guò)羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。4.分子內(nèi)交聯(lián)：555.分子間交聯(lián)：利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如：用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。第七章酶分子工程-化學(xué)修飾課件56蛋白質(zhì)類修飾血漿蛋白質(zhì)，其中人血清白蛋白應(yīng)用較多蛋白質(zhì)類修飾血漿蛋白質(zhì)，其中人血清白蛋白應(yīng)用較多576.脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問(wèn)題。制止提是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。6.脂質(zhì)體包埋：587.反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性。7.反相膠團(tuán)微囊化：59

加H2O

疏水尾部

親水頭部

加酶液

S

PEEE

圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布加H2O疏水尾部親水頭部加酶液SPEEE圖：反60（二）酶分子的內(nèi)部修飾非催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力；通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核的，也可以是親電子的，還可以是是可氧化殘基。酶蛋白主鏈的修飾：主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。（二）酶分子的內(nèi)部修飾61催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為化學(xué)突變法。肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)62（三）與輔因子相關(guān)的修飾1.對(duì)依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的,可以將輔因子共價(jià)結(jié)合于酶分子上；引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。（三）與輔因子相關(guān)的修飾63（四）金屬酶的金屬取代：酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性等。概念通過(guò)改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾。常用二價(jià)金屬離子。金屬離子置換修飾法只適用于本來(lái)在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶（四）金屬酶的金屬取代：64舉例將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2-3倍。舉例將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白65

修飾效果評(píng)價(jià),對(duì)修飾反應(yīng)評(píng)價(jià)因素：有多少修飾劑已經(jīng)結(jié)合到蛋白質(zhì)上；哪些氨基酸被修飾劑修飾，修飾度是多少；修飾物中有多少種不同形式的修飾劑－蛋白質(zhì)偶合物，每種各有多少

修飾效果評(píng)價(jià),對(duì)修飾反應(yīng)評(píng)價(jià)因素：66酶的化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響酶化學(xué)修飾影響α－淀粉酶修飾活性部位的Trp產(chǎn)物中葡萄糖與麥芽糖百分含量加大α－胰凝乳蛋白酶加入吡哆醛可使帶有自由氨基的D－芳香族氨基酸酯水解，減少對(duì)正常底物的活力木瓜蛋白酶用7α溴乙酰－10－甲基異噁烷將Cys烷基化使二氫尼古丁酰胺氧化凝乳酶用各種酐進(jìn)行?；古Ｄ棠Y(jié)力增加100倍以上酶的化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響酶化學(xué)修飾影響α－淀粉酶修飾活67修飾蛋白在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用修飾蛋白在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用68如:抗白血病藥物天冬酞胺酶的游離氨基經(jīng)過(guò)脫氨基作用，?；磻?yīng)或羰工亞胺反應(yīng)進(jìn)行修飾后，該酶在血漿中的穩(wěn)定性得到很大的提高；人的α-半乳糖苷酶A經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)修飾后，酶活性比自然酶穩(wěn)定；酶與聚乙二醇、多糖、某些蛋白質(zhì)結(jié)合后酶的性質(zhì)亦可得到改善，α淀粉酶與葡聚糖結(jié)合后，熱穩(wěn)定性顯著增加，該自然酶的半壽期只有2.5分鐘，結(jié)合酶則為63分鐘。如:69六、修飾酶的化學(xué)性質(zhì)1.熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修飾試劑的多個(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。六、修飾酶的化學(xué)性質(zhì)1.熱穩(wěn)定性：70天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較酶修飾劑修飾酶天然酶處理?xiàng)l件(℃/時(shí)間)殘留酶活(%)酰苷脫氫酶

胰蛋白酶

過(guò)氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較酶修飾劑修飾酶天然酶處712.抗原性：修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，目前比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果較好。2.抗原性：72酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶Arg酶過(guò)氧化氫酶胰蛋白酶抗原性修飾劑-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除修飾酶的抗原性變化酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶733.對(duì)各類失活因子的抵抗力:化學(xué)修飾酶與天然酶相比,對(duì)蛋白酶、抑制劑等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高3.對(duì)各類失活因子的抵抗力:74天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾劑抗失活劑過(guò)氧化氫酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑——抗尿素抗SDS天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾75天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶過(guò)氧化氫酶修飾劑半衰期天然酶修飾酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h4.修飾酶在體內(nèi)的半衰期：多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶76天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸酶吲哚-3-鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶產(chǎn)沅假絲酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.05.最適pH:大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生了變化，這在應(yīng)用上具有重要意義。天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸776.Km的變化:有些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，Km變大，這可能是由于屏蔽效應(yīng)引起的。6.Km的變化:78七、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域七、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域79在基礎(chǔ)酶學(xué)研究上探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動(dòng)酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶分子的拓?fù)鋵W(xué)以及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài)酶的固定化技術(shù)酶純度的分析與檢測(cè)在基礎(chǔ)酶學(xué)研究上80在疾病治療上克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶細(xì)胞在工業(yè)上的應(yīng)用酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長(zhǎng)導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。在疾病治療上81八、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性（1）某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對(duì)的，很少有

對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈絕對(duì)專一的化學(xué)修飾劑。因?yàn)橥环N氨基酸殘基在不同酶分子中所存在的狀態(tài)不同，所以同一種修飾劑對(duì)不同酶的修飾行為也不同。（2）化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象的變化將妨礙對(duì)修飾結(jié)果的解釋。但是，如果在實(shí)驗(yàn)中控制好溫度，pＨ等實(shí)驗(yàn)條件，選擇適當(dāng)?shù)男揎梽?，這個(gè)問(wèn)題可以得到解決。八、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性（1）某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的82（3）酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，但是Ｘ射線衍射結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明其它氨基酸側(cè)鏈在維持酶的空間構(gòu)像方面也有重要作用，而且從種屬差異的比較分析，它們?cè)谶M(jìn)化中是比較保守的。目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究這些氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用。（4）酶化學(xué)修飾的結(jié)果對(duì)于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸殘基被修飾后，酶活完全喪失，說(shuō)明該殘基是酶活性所“必需“的，為什么是必需的，還得用Ｘ射線和其它方法。因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。（3）酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，但是83第七章酶的分子工程之二：酶蛋白的化學(xué)修飾第七章酶的分子工程之二：84酶修飾的方向

1．核酸水平2．蛋白質(zhì)水平本章主要介紹第二個(gè)部分酶修飾的方向

1．核酸水平本章主要介紹第二個(gè)部分85一、酶蛋白的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾主要是利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)一定的活化步驟后與酶分子上的某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶分子的結(jié)構(gòu)與功能。一、酶蛋白的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾主要是利用修飾86二、酶的分子修飾的目的：1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能2.增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性3.維持酶結(jié)構(gòu)功能的完整性與抗蛋白水解酶4.消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境二、酶的分子修飾的目的：1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能87SOD：對(duì)普通非活性部位賴氨酸中∈—氨基的修飾在保留原有的生物活性，穩(wěn)定性增強(qiáng)、在體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，由6min-15min,延長(zhǎng)到15hr以上。SOD的化學(xué)修飾可以增強(qiáng)SOD構(gòu)象的穩(wěn)定性、抗蛋白水解酶的能力及消除對(duì)人體的免疫原性。真正能夠產(chǎn)生抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗炎、祛班美容等功效。SOD：對(duì)普通非活性部位賴氨酸中∈—氨基的修飾88具體說(shuō)來(lái)，如：提高酶活力改進(jìn)酶的穩(wěn)定性允許酶在一個(gè)變化的環(huán)境中起作用改變最適pH值或最適溫度改變酶的特異性；使它能催化不同的底物，使之轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物改變催化反應(yīng)的類型提高催化過(guò)程的反應(yīng)效率等等具體說(shuō)來(lái)，如：89三、影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素（一）影響蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的因素微區(qū)的極性氫鍵效應(yīng)靜電效應(yīng)位阻效應(yīng)蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性三、影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素（一）影響蛋白質(zhì)功能基90微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。介質(zhì)極性降低，pK升高：乙酸：水80%乙醇100%乙醇pK：4.766.8710.32微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。91從整體來(lái)看，局部極性的改變對(duì)色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的影響最?。粚?duì)氨基和組氨酸反應(yīng)性的影響較大；對(duì)酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應(yīng)性影響最大。極性對(duì)整個(gè)反應(yīng)速度的影響還與反應(yīng)的類型有密切關(guān)系從整體來(lái)看，局部極性的改變對(duì)色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的92靜電效應(yīng):不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個(gè)組氨酸殘基，其pk值是：碳酸酐酶：5.91；6.04；7.00；7.23葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71;5.74；6.50組氨酸殘基在這兩個(gè)蛋白質(zhì)中的pK值范圍是5.37～7.23，幾乎相差2個(gè)pH單位。模型化合物的數(shù)據(jù)指出，這些變化可能是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。靜電效應(yīng):不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK值是不同的。例如，碳93位阻效應(yīng)：處于蛋白質(zhì)表面的功能基，：一般說(shuō)來(lái)比較容易與修飾劑反應(yīng)。但是，如果烷基在空間上緊靠功能基，會(huì)使修飾劑不能與功能基接觸，這時(shí)就要出現(xiàn)位阻效應(yīng)。對(duì)枯草桿菌蛋白酶：它的所有的10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且其羥基幾乎在所有情況下都沒(méi)有形成氫鍵。但是，如果對(duì)它進(jìn)行徹底硝化和碘化后，10個(gè)酪氨酸中，只有8個(gè)被修飾。這種情況很可能是空間障礙引起的。位阻效應(yīng)：處于蛋白質(zhì)表面的功能基，：一般說(shuō)來(lái)比較容易與修飾94蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡(jiǎn)單氨基酸中的同樣基團(tuán)相比，反應(yīng)性要差。但是，每個(gè)蛋白質(zhì)分子中至少有一個(gè)基團(tuán)對(duì)一定的試劑顯示出超反應(yīng)性。酶的催化活性基團(tuán)通常對(duì)修飾劑是有反應(yīng)性的，但酶的超反應(yīng)基團(tuán)不一定是酶活性部位上的基團(tuán)，可能與酶的功能或構(gòu)象沒(méi)有明顯聯(lián)系。例如，木瓜蛋白酶中的19個(gè)酪氨酸殘基中，只有一個(gè)能與二異丙基氟磷酸酯反應(yīng)，修飾后酶活性并不改變。蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別95還有幾種因素也能改變蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性，如電荷轉(zhuǎn)移，共價(jià)鍵形成，金屬螯合旋轉(zhuǎn)自由度等。還有幾種因素也能改變蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性，如電荷轉(zhuǎn)移，共價(jià)鍵96（二）修飾劑反應(yīng)性的決定因素選擇吸附靜電相互作用位阻因素催化因素局部環(huán)境的極性（二）修飾劑反應(yīng)性的決定因素選擇吸附97選擇吸附化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在低或高極性區(qū)的，有時(shí)可以根據(jù)對(duì)速度的飽和效應(yīng)，檢測(cè)出蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物的形成。正象酶-底物復(fù)合物那樣，蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物形成后，修飾過(guò)程的速度加強(qiáng)了。這種速度加強(qiáng)，部分是由于選擇性吸附的結(jié)果。選擇吸附化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在低98靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。靜電相互作用可使修飾劑向多功能部位中的一個(gè)殘基定位，或向雙功能基的一側(cè)定位。此外，靜電排斥力能抑制修飾作用靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電99位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。如果修飾劑的大小超過(guò)這個(gè)部位的大小，則不能發(fā)生修飾反應(yīng)位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生100催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異。例如、對(duì)硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對(duì)胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸的乙?；瘜儆谕粰C(jī)理，但苯乙酸鹽的反應(yīng)性差，這在較大程度上與酶的酸堿催化有關(guān)。催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，101局部環(huán)境的極性許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無(wú)關(guān)。溶劑效應(yīng)是很復(fù)雜的局部環(huán)境的極性許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)102四、設(shè)計(jì)酶的化學(xué)修飾（一）對(duì)酶性質(zhì)的了解酶的活性中心酶的穩(wěn)定條件最佳反應(yīng)條件酶的側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)等等四、設(shè)計(jì)酶的化學(xué)修飾（一）對(duì)酶性質(zhì)的了解103（二）修飾劑的選擇實(shí)際要根據(jù)修飾目的來(lái)選擇：1）：如：對(duì)氨基的修飾可有幾種情況：修飾所有氨基，而不修飾其它基團(tuán)；僅修飾α-氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基以及修飾具有催化活性的氨基等。修飾的部位和程度一般可用選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件來(lái)控制。1.選擇修飾劑要考慮的問(wèn)題（二）修飾劑的選擇實(shí)際要根據(jù)修飾目的來(lái)選擇：1.選擇修飾劑要1042）：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須選擇能引入最大電荷量的試劑。用順丁烯二酸酐可將中性的巰基和酸性pH下帶正電荷的氨基轉(zhuǎn)變成在中性pH下帶負(fù)電的衍生物。2）：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須1053）：如果要修飾的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，則試劑應(yīng)選擇在水中有一定溶解性的。3）：如果要修飾的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中進(jìn)行1064）.在選擇試劑時(shí)，還必須考慮反應(yīng)生成物容易進(jìn)行定量測(cè)定。如果引入的基團(tuán)有特殊的光吸收用同位素標(biāo)記。。。4）.在選擇試劑時(shí)，還必須考慮反應(yīng)生成物容易進(jìn)行定量測(cè)定。1075）.試劑體積過(guò)大，往往由于空間障礙而不能與作用的基團(tuán)接近。一般來(lái)說(shuō)，試劑的體積小一些為宜，這樣既能保證修飾反應(yīng)順利進(jìn)行，又可減少因空間障礙而破壞蛋白質(zhì)分子嚴(yán)密結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn)。5）.試劑體積過(guò)大，往往由于空間障礙而不能與作用的基團(tuán)接近。108選擇修飾劑是個(gè)綜合權(quán)衡的過(guò)程：修飾反應(yīng)要完成到什么程度；對(duì)個(gè)別氨基酸殘基是否專一；在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒(méi)有限度；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物；反應(yīng)是否需要可逆；是否適合于建立快速、方便的分析方法等等選擇修飾劑是個(gè)綜合權(quán)衡的過(guò)程：修飾反應(yīng)要完成到什么程度；109就修飾劑本身而言：修飾劑自身的性質(zhì)：修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長(zhǎng)度對(duì)蛋白的吸附性修飾劑反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目和位置修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件一般而言：要求修飾劑有較大的分子量、良好的生物相容性和水溶性、修飾劑分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長(zhǎng)就修飾劑本身而言：修飾劑自身的性質(zhì)：1102.用于修飾酶活性中心的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備以下—些特征：選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行；標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過(guò)降解分離出來(lái)，進(jìn)行鑒定；反應(yīng)的程度能用簡(jiǎn)單的技術(shù)測(cè)定。當(dāng)然，不是單獨(dú)一種試劑就能滿足所有這些條件。一種試劑可能在某一方面比其它試劑優(yōu)越，而在另—方面則較差。因此，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮吞囟ǖ臉悠穪?lái)決定使用什么樣的試劑。2.用于修飾酶活性中心的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備以下—些特征：111(三）反應(yīng)條件的選擇除允許修飾能順利進(jìn)行外，還必須滿足如下要求：一是不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性。（必須做對(duì)照試驗(yàn)）二是有利于專一性修飾蛋白質(zhì)。為此，反應(yīng)條件應(yīng)盡可能在保證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變或少變的情況下進(jìn)行。要考慮反應(yīng)的溫度、pH、反應(yīng)介質(zhì)和緩沖液組成緩沖液可改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象或封閉反應(yīng)部位，因而影響修飾反應(yīng)，如，磷酸鹽是某些酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，碳酸酐酶的酯酶活力能被氯離子抑制(三）反應(yīng)條件的選擇除允許修飾能順利進(jìn)行外，還必須滿足如下要112反應(yīng)基本條件1.反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例2.反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度和pH條件3.反應(yīng)溫度和時(shí)間以上條件隨修飾類型不同有很大差異，需做大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定反應(yīng)基本條件1.反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例113（四）反應(yīng)的專一性在蛋白質(zhì)化學(xué)修飾研究中，反應(yīng)的專一性非常重要。若修飾劑專一性較差，除控制反應(yīng)條件外，還可利用其它途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)修飾的專一性。（四）反應(yīng)的專一性在蛋白質(zhì)化學(xué)修飾研究中，反應(yīng)的專一性非常重1141．利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性活性蛋白質(zhì)特殊的空間結(jié)構(gòu)能影響某些基團(tuán)的活性。同樣條件下，二異丙基氟磷酸酯（DFP）能與胰凝乳蛋白酶的Ser作用，迅速使酶失活不能與胰凝乳蛋白酶原及一些簡(jiǎn)單的模擬化合物作用。在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團(tuán)，在適當(dāng)條件下只是其本身發(fā)生作用，而其它基團(tuán)皆不作用，這種現(xiàn)象稱為“位置專一性”，這是由于它在蛋白質(zhì)分子中所處的位置環(huán)境所決定的1．利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性活性蛋白質(zhì)特殊的空間1152．選擇不同的反應(yīng)pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)(pKa)是不同的。所以控制不同的反應(yīng)pH，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的專一性2．選擇不同的反應(yīng)pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)(pK116如：用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí)，試劑在不同pH條件下可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側(cè)鏈及α-氨基、ε-氨基發(fā)生作用。

pH＞７ICH2COO-+蛋白質(zhì)-SH－－→蛋白質(zhì)-S-CH2COO-+H++I-

pH＞2

ICH2COO-+蛋白質(zhì)-SCH3－－→蛋白質(zhì)-S(CH3)–CH2COO-+I-

pH＞8.5ICH2COO-+蛋白質(zhì)-NH2－－→蛋白質(zhì)-NH-CH2COO-+H++I-

pH＞5.5ICH2COO-+蛋白質(zhì)—咪唑基-NH－－→蛋白質(zhì)-咪唑基-N-CH2COO-如：用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí)，試劑在1173．利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性在高pH下：

氰酸、二硫化碳、O-甲基異脲和亞氨酸等氨基脲和胍的衍生物。雖然巰基也能與上述試劑作用，但因pH高，與巰基形成的產(chǎn)物迅速被分解3．利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性在高pH下：1184．親和標(biāo)記親和標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)專一性修飾的重要途徑。親和標(biāo)記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。在作用前，試劑先以非共價(jià)形式結(jié)合到蛋白質(zhì)的活性部位上，然后再發(fā)生化學(xué)作用，將試劑掛在活性部位基團(tuán)上。例如，對(duì)甲基苯磺酰氯能作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上4．親和標(biāo)記親和標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)專一性修飾的重要途徑。119又如：

TPCK對(duì)胰凝乳蛋白酶活性中心組氨酸咪唑環(huán)的親和標(biāo)記

又如：

TPCK對(duì)胰凝乳蛋白酶活性中心組氨酸咪唑環(huán)的親和標(biāo)記1205．差別標(biāo)記在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們保護(hù)著蛋白質(zhì)的活性部位基團(tuán)，使這些基團(tuán)不能與試劑作用。然后將底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位素標(biāo)記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來(lái)被底物或抑制劑保護(hù)的基團(tuán)是帶放射性同位素標(biāo)記的。用這一方法可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán)。5．差別標(biāo)記在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們1216．利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異有時(shí)在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。例如，核糖核酸酶在晶體狀態(tài)下進(jìn)行羧甲基化時(shí)，反應(yīng)主要集中在119號(hào)His上，對(duì)第12號(hào)His的修飾很少，兩者之比為60：1。但在水溶液中進(jìn)行同樣的修飾時(shí)，兩者之比為15:1，換言之，在晶體狀態(tài)下羧甲基化反應(yīng)的專一性比溶液狀態(tài)下提高3倍6．利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異有時(shí)在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高122目前采用的方法：對(duì)酶蛋白的非活性主鏈進(jìn)行部分水解；利用小分子或大分子物質(zhì)對(duì)酶的活性部位或非活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾；對(duì)酶輔因子的置換而力圖改變酶的反應(yīng)類型等等五、酶分子的化學(xué)修飾目前采用的方法：五、酶分子的化學(xué)修飾123（一）酶的表面修飾1.化學(xué)固定化：一般是直接通過(guò)酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。（一）酶的表面修飾1242.酶的小分子修飾作用：主要是利用一些小分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有乙基、糖基和甲基等。2.酶的小分子修飾作用：125幾種重要的修飾反應(yīng)1．酰化及其相關(guān)反應(yīng)幾種重要的修飾反應(yīng)1．?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)1262．烷基化反應(yīng)2．烷基化反應(yīng)1273．氧化和還原反應(yīng)3．氧化和還原反應(yīng)1284．芳香環(huán)取代反應(yīng)4．芳香環(huán)取代反應(yīng)129附：特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1．巰基的化學(xué)修飾常用：烷基化劑、?；?、馬來(lái)酰亞胺附：特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1．巰基的化學(xué)修飾常用1302．氨基的化學(xué)修飾2．氨基的化學(xué)修飾1313．羧基的化學(xué)修飾3．羧基的化學(xué)修飾1324．咪唑基的化學(xué)修飾4．咪唑基的化學(xué)修飾1335．胍基的化學(xué)修飾5．胍基的化學(xué)修飾1343.酶的大分子修飾作用：可分為非共價(jià)修飾和共價(jià)修飾兩大類：1）大分子非共價(jià)修飾：利用一些大分子試劑通過(guò)與酶非共價(jià)相互作用，對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)。例如：聚乙二醇、右旋糖苷等通過(guò)氫鍵固定于酶分子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶活力；另外一些蛋白質(zhì)可以通過(guò)相互作用，排除分子表面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。3.酶的大分子修飾作用：1352）大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。

例如：用聚乙二醇共價(jià)修飾SOD，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。2）大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶136聚乙二醇（PEG）

___常使用的水溶性大分子修飾劑

溶解度高既溶于水，又溶于大多數(shù)有機(jī)試劑通常無(wú)毒性，也無(wú)抗原性生物相容性好聚乙二醇（PEG）

___常使用的水溶性大分子修飾劑1374.分子內(nèi)交聯(lián)：增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如：胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過(guò)羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。4.分子內(nèi)交聯(lián)：1385.分子間交聯(lián)：利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如：用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。第七章酶分子工程-化學(xué)修飾課件139蛋白質(zhì)類修飾血漿蛋白質(zhì)，其中人血清白蛋白應(yīng)用較多蛋白質(zhì)類修飾血漿蛋白質(zhì)，其中人血清白蛋白應(yīng)用較多1406.脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問(wèn)題。制止提是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。6.脂質(zhì)體包埋：1417.反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性。7.反相膠團(tuán)微囊化：142

加H2O

疏水尾部

親水頭部

加酶液

S

PEEE

圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布加H2O疏水尾部親水頭部加酶液SPEEE圖：反143（二）酶分子的內(nèi)部修飾非催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力；通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核的，也可以是親電子的，還可以是是可氧化殘基。酶蛋白主鏈的修飾：主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。（二）酶分子的內(nèi)部修飾144催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為化學(xué)突變法。肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)145（三）與輔因子相關(guān)的修飾1.對(duì)依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的,可以將輔因子共價(jià)結(jié)合于酶分子上；引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。（三）與輔因子相關(guān)的修飾146（四）金屬酶的金屬取代：酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性等。概念通過(guò)改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾。常用二價(jià)金屬離子。金屬離子置換修飾法只適用于本來(lái)在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶（四）金屬酶的金屬取代：147舉例將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2-3倍。舉例將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白148

修飾效果評(píng)價(jià),對(duì)修飾反應(yīng)評(píng)價(jià)因素：有多少修飾劑已經(jīng)結(jié)合到蛋白質(zhì)上；哪些氨基酸被修飾劑修飾，修飾度是多少；修飾物中有多少種不同形式的修飾劑－蛋白質(zhì)偶合物，每種各有多少

修飾效果評(píng)價(jià),對(duì)修飾反應(yīng)評(píng)價(jià)因素：149酶的化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響酶化學(xué)修飾影響α－淀粉酶修飾活性部位的Trp產(chǎn)物中葡萄糖與麥芽糖百分含量加大α－胰凝乳蛋白酶加入吡哆醛可使帶有自由氨基的D－芳香族氨基酸酯水解，減少對(duì)正常底物的活力木瓜蛋白酶用7α溴乙酰－10－甲基異噁烷將Cys烷基化使二氫尼古丁酰胺氧化凝乳酶用各種酐進(jìn)行酰化使牛奶凝結(jié)力增加100倍以上酶的化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響酶化學(xué)修飾影響α－淀粉酶修飾活150修飾蛋白在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用修飾蛋白在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用151如:抗白血病藥物天冬酞胺酶的游離氨基經(jīng)過(guò)脫氨基作用，?；磻?yīng)或羰工亞胺反應(yīng)進(jìn)行修飾后，該酶在血漿中的穩(wěn)定性得到很大的提高；人的α-半乳糖苷酶A經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)修飾后，酶活性比自然酶穩(wěn)定；酶與聚乙二醇、多糖、某些蛋白質(zhì)結(jié)合后酶的性質(zhì)亦可得到改善，α淀粉酶與葡聚糖結(jié)合后，熱穩(wěn)定性顯著增加，該自然酶的半壽期只有2.5分鐘，結(jié)合酶則為63分鐘。如:152六、修飾酶的化學(xué)性質(zhì)