微生物檢驗流程和質(zhì)量控制培訓(xùn)課件

微生物檢驗流程和質(zhì)量控制主要內(nèi)容常見標本的檢驗流程血培養(yǎng)（無菌體液培養(yǎng)）痰培養(yǎng)（以及其他呼吸系統(tǒng)標本）尿培養(yǎng)糞便培養(yǎng)質(zhì)量控制人員能力試劑與儀器（包括儀器校準、各項鑒定試驗、藥敏試驗室內(nèi)質(zhì)控）環(huán)節(jié)控制（全程質(zhì)控）首代分離培養(yǎng)基質(zhì)量控制2微生物檢驗流程和質(zhì)量控制常見標本的檢驗流程3微生物檢驗流程和質(zhì)量控制血培養(yǎng)標準化操作流程樣本接收推片法制片染色鏡檢血培養(yǎng)儀增菌陽性培養(yǎng)液涂片一級報告首代培養(yǎng)目標菌落選取鑒定藥敏綜合報告4微生物檢驗流程和質(zhì)量控制痰培養(yǎng)標準化操作流程樣本接收痰液洗滌壓片法制片染色鏡檢肉眼篩選分類鏡下篩選痰液消化痰液接種首代培養(yǎng)目標菌落選取鑒定藥敏綜合報告5微生物檢驗流程和質(zhì)量控制尿培養(yǎng)標準化操作流程樣本接收沉渣涂片離心鏡下篩選染色鏡檢首代培養(yǎng)（菌落計數(shù)）目標菌落選取鑒定藥敏綜合報告6微生物檢驗流程和質(zhì)量控制糞便培養(yǎng)標準化操作流程樣本接收鏡下篩選（糞便常規(guī)）壓片法制片染色鏡檢選擇性增菌培養(yǎng)首代培養(yǎng)目標菌落選取鑒定藥敏綜合報告7微生物檢驗流程和質(zhì)量控制其他標本標準化操作流程《實用臨床微生物檢驗與圖譜》衛(wèi)生部規(guī)范化操作流程圖8微生物檢驗流程和質(zhì)量控制質(zhì)量控制9微生物檢驗流程和質(zhì)量控制概念狹義質(zhì)量控制：對試劑和儀器的控制廣義質(zhì)量控制：對所有影響試驗結(jié)果可靠性的因素進行的全面質(zhì)量控制試驗人員技術(shù)能力的控制——操作的標準化與試驗結(jié)果判讀的標準化試劑的保存與正確使用儀器的正確使用、定期維護與校準鑒定試劑陰陽性結(jié)果的典型性與試劑的穩(wěn)定性考察藥敏試驗（紙片、MIC板卡、E-test試條、MH培養(yǎng)基等）的室內(nèi)質(zhì)控嚴格但合理的首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施流程中不同環(huán)節(jié)試驗之間的相互印證10微生物檢驗流程和質(zhì)量控制質(zhì)量控制中的重點人員能力的培訓(xùn)、考核與權(quán)限的授予流程中不同環(huán)節(jié)試驗之間的相互印證首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施藥敏試驗室內(nèi)質(zhì)量控制11微生物檢驗流程和質(zhì)量控制人員能力的

培訓(xùn)、考核與權(quán)限的授予在所有影響因素中，人的因素居于首位臨床微生物檢驗是一個智力因素占首要地位的行業(yè)，是真正意義上的診斷學(xué)。在歐美從屬于臨床病理的范疇基礎(chǔ)知識的扎實程度、臨場實踐能力的高低、自主學(xué)習(xí)能力的強弱直接影響工作質(zhì)量的好壞個人能力在報告質(zhì)量中有直接而明顯的體現(xiàn)12微生物檢驗流程和質(zhì)量控制人員能力的

培訓(xùn)、考核與權(quán)限的授予在微生物室對后進人員的培訓(xùn)考核是一項長期任務(wù)，對于人才梯隊的形成和特殊能力的傳承有著重要意義根據(jù)每個人員能力的層次分別授予對應(yīng)等級的權(quán)限對于控制微生物室整體質(zhì)量，防范錯誤的發(fā)生，提高報告質(zhì)量有確定的意義13微生物檢驗流程和質(zhì)量控制流程中不同環(huán)節(jié)試驗

之間的相互印證建立全程質(zhì)控的觀點對于提高微生物檢驗質(zhì)量意義重大通過不同環(huán)節(jié)試驗結(jié)果之間的推衍和反證可及時發(fā)現(xiàn)一些錯誤的存在，并及時進行糾正可防止錯誤報告的發(fā)出不同環(huán)節(jié)之間的推衍與反證可讓我們發(fā)現(xiàn)平時質(zhì)控中難以發(fā)現(xiàn)的失控現(xiàn)象，便于我們制訂相應(yīng)的規(guī)則堵住漏洞，對于工作的持續(xù)改進有著重要的意義14微生物檢驗流程和質(zhì)量控制首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施目前國內(nèi)有超過10家商品成品培養(yǎng)基制造商，由于生產(chǎn)工藝簡單，技術(shù)壁壘較低，有無研發(fā)實力的公司都來趟這趟渾水，導(dǎo)致成品培養(yǎng)基市場非?；靵y，質(zhì)量良莠不齊首代分離培養(yǎng)基是制約微生物檢驗陽性率的門戶，分離到細菌是一切成功檢驗的前提條件。其質(zhì)量的好壞直接影響微生物檢驗的整體質(zhì)量。在“檢驗中”階段，所有影響因素中，該因素所占的比重最大15微生物檢驗流程和質(zhì)量控制藥敏試驗質(zhì)控過程控制結(jié)果控制16微生物檢驗流程和質(zhì)量控制藥敏試驗過程控制17微生物檢驗流程和質(zhì)量控制擴散法18微生物檢驗流程和質(zhì)量控制試驗方法與條件CLSI推薦培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)要求細菌使用水解酪蛋白瓊脂（MHA）平板肺鏈使用含5%綿羊血的含血MHA嗜血桿菌使用HTM培養(yǎng)基淋球菌使用含1%生長因子（不含L-半胱氨酸）補充劑的GC培養(yǎng)基平皿大?。鹤钚?0mm，通常使用150mm平板瓊脂厚度4±1mm菌液濃度0.5McF（約1.5×108CFU/ml）19微生物檢驗流程和質(zhì)量控制涂布方法：無菌棉簽浸透菌液后稍微擠干，棉簽與平板呈30°左右的傾角密集左右來回涂布，完成一遍后旋轉(zhuǎn)120°后再涂，如此三次，最后繞邊緣一次紙片之間最佳間距30mm，不得低于25mm培養(yǎng)溫度；35℃；重疊時不超過3個碟子氣體環(huán)境：普通細菌大氣環(huán)境；嗜血桿菌、淋球菌、肺鏈置CO2環(huán)境培養(yǎng)時間：18小時20微生物檢驗流程和質(zhì)量控制測量方法透射光葡萄球菌利奈唑胺苯唑西林萬古霉素腸球菌萬古霉素21微生物檢驗流程和質(zhì)量控制反射光測量其他細菌與藥物時22微生物檢驗流程和質(zhì)量控制變形桿菌忽略環(huán)內(nèi)的遷徙生長23微生物檢驗流程和質(zhì)量控制測量肉眼可見的明顯抑菌區(qū)忽略環(huán)邊緣的微弱生長24微生物檢驗流程和質(zhì)量控制環(huán)內(nèi)生長現(xiàn)象大腸藥敏，被腸球菌污染銅綠假單胞菌耐藥亞群25微生物檢驗流程和質(zhì)量控制特殊處理方法當受測抑菌環(huán)與旁邊的融合時，選擇完整部分測量當受測抑菌環(huán)部分變形時，選擇正常部分測量26微生物檢驗流程和質(zhì)量控制擴散法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度（腸球菌能生長）厚度抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控）鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控）菌懸液濃度高抑菌環(huán)縮小濃度低則擴大細菌純度氣體環(huán)境普通細菌放CO2時由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長不良，導(dǎo)致假敏感培養(yǎng)時間粘液性銅綠需48小時測量方法27微生物檢驗流程和質(zhì)量控制稀釋法28微生物檢驗流程和質(zhì)量控制試驗方法與條件CLSI推薦培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)要求細菌使用補充陽離子MH肉湯肺鏈使用含2%凍融馬血的MH肉湯嗜血桿菌使用HTM肉湯厭氧菌和微需氧菌使用布氏肉湯淋病奈瑟菌推薦強化GC作瓊脂稀釋法菌液濃度（5×104CFU/ml）：初始菌液0.5McF（約1.5×108CFU/ml）鹽水稀釋200倍，加入0.1ml菌液到含有0.1ml雙倍濃縮的MH肉湯的微孔板中（或預(yù)先用標準濃度的MH肉湯稀釋后再加到微孔中）29微生物檢驗流程和質(zhì)量控制接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度；35℃氣體環(huán)境：所有細菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2培養(yǎng)時間：18小時結(jié)果讀?。阂姾竺娴幕脽簦?0微生物檢驗流程和質(zhì)量控制常量稀釋法藥敏試驗的參考方法：

將標準接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中.過夜培養(yǎng).MIC即是能抑制細菌生長的含最低抗生素的濃度的那一管所標示的濃度值.104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml31微生物檢驗流程和質(zhì)量控制微量肉湯稀釋法32微生物檢驗流程和質(zhì)量控制微量肉湯稀釋法

結(jié)果讀取技巧磺胺類藥物容易出現(xiàn)弱生長，只要滿足70%以上抑菌率即可視為未生長真菌藥敏三唑類藥物容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象（即低濃度孔易出現(xiàn)弱生長），判讀時以對照孔為參照，＞80%的抑菌率即可視為未生長大于三孔不同梯度濃度的抗生素測試中，出現(xiàn)的高濃度生長，而低濃度不生長現(xiàn)象叫跳孔。造成跳孔的主要原因，菌懸液乳化不充分，細菌分散不足，以及藥敏卡某些孔被污染跳孔的解決方法：根據(jù)其他藥理學(xué)特征類似的抗生素的敏感性以及分析其他同類不同種抗生素的敏感性進行推斷性修正修正低濃度——耐藥修正高濃度——敏感33微生物檢驗流程和質(zhì)量控制肉湯稀釋法注意事項生長緩慢微生物（形成肉眼可見生長＞1周）不適合用MIC法在肉湯中發(fā)育不良的微生物不適合用MIC粘液性銅綠假單胞菌——只能用擴散法，48小時觀察結(jié)果淋病奈瑟菌——CLSI無肉湯稀釋法藥敏指南注意微弱生長導(dǎo)致的假敏感（結(jié)果需要修正）例如銅綠對磺胺、四環(huán)素、頭孢噻肟/曲松鮑曼不動桿菌對氨曲南肺克、陰溝、變形桿菌對呋喃妥因34微生物檢驗流程和質(zhì)量控制稀釋法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度抗生素拮抗劑含量鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5μg/ml）菌懸液（5×104CFU/ml）接種效應(yīng)濃度高MIC抬高濃度低MIC壓低細菌純度氣體環(huán)境所有需氧細菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥培養(yǎng)時間真菌需48小時奴卡菌需5天35微生物檢驗流程和質(zhì)量控制E-test法36微生物檢驗流程和質(zhì)量控制MIC值標注于試條的光面Etest試條毛面貼于MHA上37微生物檢驗流程和質(zhì)量控制Etest操作程序按照擴散法標準操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng)15-18小時讀取抑菌濃度并按標準解釋38微生物檢驗流程和質(zhì)量控制

肺炎鏈球菌

青霉素MIC=3g/ml結(jié)果讀取39微生物檢驗流程和質(zhì)量控制40微生物檢驗流程和質(zhì)量控制藥敏試驗結(jié)果控制41微生物檢驗流程和質(zhì)量控制藥敏試驗結(jié)果解釋標準CLSI標準；全球性每年更新非強制性學(xué)術(shù)機構(gòu)FDA標準（全球標準）建立在CLSI基礎(chǔ)上6~8年更新一次官方機構(gòu)，標準帶有強制性法國CASFM標準；

梅里埃產(chǎn)品習(xí)慣采用的CLSI以外的標準英國BSAC標準；歐洲應(yīng)用比較廣泛的標準歐洲EUCAST標準……..42微生物檢驗流程和質(zhì)量控制CLSI藥敏解釋標準CLSI(ClinicalLaboratorystandardinstitution)藥敏指南

CLSI43微生物檢驗流程和質(zhì)量控制CLSI藥敏文件M100-S22常見菌(2012)**M11-A7

厭氧菌(2007)M39-A3

積累抗菌譜(2009)M24-A

分枝桿菌,奴卡菌,以及其他需氧放線菌M27-A2酵母樣真菌MIC法(2002)M44-A

真菌紙片擴散法(2004)M45-A低頻分離菌與苛養(yǎng)菌(2006)* M100updatedyearly44微生物檢驗流程和質(zhì)量控制CLSIM100-S22解釋標準

覆蓋的細菌類別腸桿菌科銅綠假單胞菌不動桿菌屬洋蔥伯克霍爾德菌嗜麥芽窄食單胞菌其他非腸道桿菌葡萄球菌屬腸球菌屬流感嗜血桿菌與副流感桿菌淋病奈瑟菌肺炎鏈球菌Β-溶血鏈球菌草綠色鏈球菌腦膜炎奈瑟菌厭氧菌45微生物檢驗流程和質(zhì)量控制不同細菌適用的藥敏方法部分細菌同時具有擴散法標準和MIC標準，但具有擴散法標準的藥物相對較少部分細菌（某些藥物）只有MIC標準其他非腸道細菌所有藥物葡萄球菌萬古霉素、托達霉素腸球菌托達霉素肺鏈除苯唑西林以外的其他β內(nèi)酰胺類Β溶血鏈球菌除青霉素、氨芐青霉素、頭孢吡肟、噻肟、曲松外的其他β內(nèi)酰胺類草綠色鏈球菌除頭孢吡肟、噻肟、曲松外的其他β內(nèi)酰胺類厭氧菌所有藥物淋菌只有擴散法和瓊脂稀釋法，無肉湯稀釋法標準46微生物檢驗流程和質(zhì)量控制少見菌和苛養(yǎng)菌的特殊藥敏參考方法：M45-A乏養(yǎng)菌與顆粒鏈菌——稀釋法嗜水氣單胞菌復(fù)合群——稀釋法與擴散法弧菌屬細菌（霍亂除外）——稀釋法與擴散法芽孢桿菌屬（炭疽除外）——稀釋法空腸/大腸彎曲菌——稀釋法與擴散法棒狀桿菌——稀釋法（可用的藥物標準比BSAC標準提供的多）MethodsforAntimicrobialDilutionandDiskSusceptibilityTestingofInfrequentlyIsolatedorFastidiousBacteria；Approvedguideline47微生物檢驗流程和質(zhì)量控制分枝桿菌,奴卡菌,以及

其他需氧放線菌藥敏參考方法：M24-A結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群——比例法緩慢生長非結(jié)核分枝桿菌——稀釋法快速生長分枝桿菌——稀釋法奴卡菌等需氧放線菌——稀釋法SusceptibilityTestingofMycobacteria,Nocardiae,andOtherAerobicActinomycetes;ApprovedStandard49微生物檢驗流程和質(zhì)量控制真菌藥敏M27-A2用于酵母樣真菌的稀釋法藥敏——只有氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶有解釋標準，其他藥物的測試結(jié)果報告MICM44-A用于酵母樣真菌的擴散法藥敏——只有氟康唑有解釋標準M38-P用于絲狀真菌的稀釋法藥敏——只有操作方法，報告MIC值，但無解釋標準50微生物檢驗流程和質(zhì)量控制藥敏試驗質(zhì)量控制要點意義：保障藥敏結(jié)果的可靠性——準確性和精密度控制環(huán)節(jié)要點（重要的五大環(huán)節(jié)）：*質(zhì)控1：人員操作能力質(zhì)控2：菌液濃度（比濁）質(zhì)控3：培養(yǎng)基質(zhì)量質(zhì)控4：藥敏試劑（紙片或MIC試卡/板）、讀取藥敏結(jié)果的儀器設(shè)備*質(zhì)控5：異常結(jié)果的發(fā)現(xiàn)與修正參照指南：CLSI文件51微生物檢驗流程和質(zhì)量控制*質(zhì)控1：人員標準操作指南：擴散法參照CLSI-M2文件；MIC法參照M7文件考核內(nèi)容：基本操作步驟的熟練程度結(jié)果的正確讀取52微生物檢驗流程和質(zhì)量控制人員：操作步驟的熟練程度按照標準程序操作，能在15分鐘內(nèi)完成單個分離菌的藥敏試驗操作操作過程：菌落的挑取手法菌液的配制操作與菌液混勻操作擴散法中菌液涂布操作MIC法中菌液的稀釋操作儀器法中儀器的標準操作手法菌懸液純度和濁度的驗證性操作；53微生物檢驗流程和質(zhì)量控制人員：結(jié)果的正確讀取抑菌環(huán)的正確測量——忽略邊緣的微弱生長環(huán)內(nèi)生長的檢測——污染菌的發(fā)現(xiàn)或耐藥亞群的分離確認MIC值的正確讀取包括跳孔現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與糾正微弱生長孔的發(fā)現(xiàn)與結(jié)果修正（磺胺、四環(huán)、氯霉素、氨曲南…）拖尾現(xiàn)象的正確忽略（磺胺、真菌）生長不良的確認與補救措施（重做、延長）54微生物檢驗流程和質(zhì)量控制質(zhì)控2：菌液濁度控制目測法控制內(nèi)容：主要是0.5McF濁度的感知能力參照物：0.5McF硫酸鋇比濁管，對應(yīng)1.5×108CFU/ml參考方法：菌液稀釋后菌落計數(shù)法允許誤差：1.5×107~1.5×109CFU/ml儀器法控制內(nèi)容：同上校準品：0.5~4McF硫酸鋇比濁管參考方法：同上允許誤差：同上55微生物檢驗流程和質(zhì)量控制質(zhì)控3：MH培養(yǎng)基質(zhì)量控制pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度：不加血的情況下就能支持ATCC29212的生長抗生素拮抗劑含量：使用ATCC29212監(jiān)測，擴散法有抑菌環(huán)出現(xiàn)，并且環(huán)內(nèi)只允許微量小菌落出現(xiàn)；MIC法抑菌率＞80%鈣鎂離子含量：鈣10-25、鎂10-12.5μg/ml鋅離子含量：ATCC27853亞胺配能結(jié)果在允許范圍內(nèi)56微生物檢驗流程和質(zhì)量控制質(zhì)控4：藥敏試劑質(zhì)控CLSI提供擴散法和稀釋法的質(zhì)控標準擴散法標準適合于紙片擴散法稀釋法標準適合于微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法，以及E-test法內(nèi)容標準菌株質(zhì)控頻率各種藥物的控制范圍57微生物檢驗流程和質(zhì)量控制擴散法質(zhì)控菌株非苛養(yǎng)菌：腸桿菌科ATCC25922大腸；非發(fā)酵菌27853銅綠；葡萄球菌25923金葡；加酶抑制劑抗生素質(zhì)控35218產(chǎn)ESBL大腸苛養(yǎng)菌：嗜血桿菌49247流感，49766流感用于補充，彌補49247某些不能檢測的藥物；淋菌用49226；肺鏈用4961958微生物檢驗流程和質(zhì)量控制擴散法控制范圍點擊放大59微生物檢驗流程和質(zhì)量控制稀釋法質(zhì)控菌株非苛養(yǎng)菌：腸桿菌科25922；葡萄球菌29213；腸球菌29212；非發(fā)酵菌27853；加酶抑制劑抗生素質(zhì)控35218苛養(yǎng)菌：嗜血桿菌49247，49766流感用于補充；淋菌用49226；肺鏈、其他鏈球菌，以及腦膜炎球菌藥敏質(zhì)控用49619；49226用于淋菌瓊脂稀釋法質(zhì)控其他低頻分離菌：根據(jù)相應(yīng)的文件規(guī)定。一般都是選用上述質(zhì)控菌株中的某些60微生物檢驗流程和質(zhì)量控制稀釋法控制范圍點擊放大61微生物檢驗流程和質(zhì)量控制自動化藥敏儀器的質(zhì)控主要是光學(xué)部件讀取數(shù)據(jù)時的準確性與穩(wěn)定性——由儀器內(nèi)置自檢部件按規(guī)定時間間隔自動進行，如果自檢不能通過，