轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物課件

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1982年美國華盛頓大學(xué)Palmiter等將大鼠生長激素基因?qū)胄“资蟮氖芫牙?，再將這一受精卵植入借腹懷孕的母鼠體內(nèi)，生下一個(gè)比正常體格大一倍的“超級小鼠”。按照轉(zhuǎn)基因小鼠的思路，人們已經(jīng)成功的獲得了轉(zhuǎn)基因大鼠、雞、山羊、綿羊、豬、兔、牛、蛙、魚等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1982年美國華盛頓大學(xué)Palmiter等將大鼠生2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)概念研制的方法技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)發(fā)展前景克隆動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)概念3含外源基因的載體基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測繁殖后代含外源基因的載體基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測繁4轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物

一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概述（一）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過基因工程對DNA進(jìn)行體外操作，添加或刪除一個(gè)特殊的DNA序列，然后導(dǎo)入早期的胚胎干細(xì)胞中，產(chǎn)生遺傳結(jié)構(gòu)得以修飾的動(dòng)物，其改變的性狀可以遺傳給后代。這些改變包括：（1）外源DNA片段至少整合到一條染色體上；（2）由于外源DNA的插入使任何一個(gè)基因發(fā)生改變；（3）由于外源DNA的插入或內(nèi)源基因的刪除使染色體發(fā)生重排；（4）有意識地導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概述5（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名

1．符號(1)一個(gè)轉(zhuǎn)基因符號由以下三部分組成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段標(biāo)示；＃＃＃＃＃=實(shí)驗(yàn)室指定序號；Zzz=實(shí)驗(yàn)室注冊代號；（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名

1．符號6(2)方式轉(zhuǎn)基因符號通常冠以Tg字頭。隨后的一個(gè)字母（X）表示DNA插入的方式：H代表同源重組；R代表經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的插入；N代表非同源插入。(2)方式7（3）插入片段標(biāo)示An匿名序列；Ge基因組；Im插入突變；Nc非編碼序列；Rp報(bào)告基因；Sn合成序列；Et增強(qiáng)子捕獲裝置；Pt啟動(dòng)子捕獲裝置。（3）插入片段標(biāo)示82.舉例C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg：

來源于美國杰克遜研究所（J）的C57BL/6品系小鼠被轉(zhuǎn)入人的CD8基因組（Ge）；轉(zhuǎn)基因在JonW.Gordon(Jwg)實(shí)驗(yàn)室完成，獲取于一系列顯微注射后得到的序號為23的小鼠。2.舉例9二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本原理和方法（一）基本原理將改建后的目的基因用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵，然后將此受精卵再植入受體動(dòng)物的輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，人們可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良品種的工程動(dòng)物等。二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本原理和方法（一）基本原理101.外源目的基因的分離2.外源目的基因與轉(zhuǎn)性基因表達(dá)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、報(bào)告基因等構(gòu)件的拼接重組3.重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞4.胚胎移植技術(shù)5.鑒定及篩選6.目的基因整合率及表達(dá)效率的檢測（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)111.采取受精卵采取受精卵的方法分為獲得自然排卵的受精卵的方法和以激素誘發(fā)排卵的方法，還有采取未受精卵，然后在體外受精的方法。2.向受精卵雄性原核注入DNA溶液通過微分干涉顯微鏡觀察受精卵，會(huì)看到兩個(gè)大的原核。兩個(gè)核不久即可融合，接著核膜消失。雄性原核要比雌性原核能容納更多的DNA溶液，一般是向雄性原核注入DNA溶液。3.向假妊雌小鼠移植（1）假妊雌小鼠的制作（2）將操作卵移植至輸卵管4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測Ⅰ顯微注射法1.采取受精卵Ⅰ顯微注射法12Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法

原理：逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸為一條單鏈RNA分子，其基因由兩部分組成，一是順式作用序列，為病毒復(fù)制和整合所必需；二是反式作用序列，編碼病毒的包裝蛋白。將外源基因取代反式作用序列構(gòu)建成重組載DNA。另外將包裝蛋白基因?qū)雽ｉT的細(xì)胞并使之整合到染色體上，形成包裝細(xì)胞。如果重組病毒DNA導(dǎo)入這種包裝細(xì)胞中，病毒包裝蛋白能將DNA包裝成具有感染力的重組蛋白顆粒，能浸染動(dòng)物細(xì)胞而將重組DNA引入宿主細(xì)胞。Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法原理：13Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法步驟：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建2.選擇和培養(yǎng)包裝細(xì)胞系3.重組病毒DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞4.收集重組病毒顆粒5.感染胚細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化此法是目前制備轉(zhuǎn)基因雞最有效和最成功的方法。Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法步驟：14Ⅲ胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞是在人（哺乳動(dòng)物）胚胎發(fā)育早期——囊胚（受精后約5—7天）中未分化的細(xì)胞。囊胚含有約140個(gè)細(xì)胞，外表是一層扁平細(xì)胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群，稱內(nèi)細(xì)胞群，這些未分化的細(xì)胞可進(jìn)一步分裂、分化，發(fā)育成個(gè)體。由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，我們稱之為胚胎干細(xì)胞。

Ⅲ胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞是在人（哺乳動(dòng)物）胚胎15利用胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程1.3.5天的孕鼠2.分離胚細(xì)胞3.轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4.分離內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)5.收集干細(xì)胞克隆6.酶處理解散細(xì)胞7.培養(yǎng)干細(xì)胞8.轉(zhuǎn)染干細(xì)胞9.植入代孕母鼠體內(nèi)利用胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程1.3.5天的孕鼠16在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)

2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)分別授予兩名美國人馬里奧·卡佩基、奧利弗·史密斯和一名英國人馬丁·埃文斯，以表彰他們在“基因靶向”技術(shù)方面的突出貢獻(xiàn)。諾貝爾獎(jiǎng)評審委員會(huì)發(fā)布的公報(bào)說，三位科學(xué)家“在涉及胚胎干細(xì)胞和哺乳動(dòng)物ＤＮＡ重組方面有著一系列突破性發(fā)現(xiàn)”，為“基因靶向”技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。在“基因靶向”技術(shù)的幫助下，科學(xué)家可以使小鼠體內(nèi)的特定基因喪失功能。此類“基因敲除”試驗(yàn)可以幫助人們了解基因在胚胎發(fā)育等多種現(xiàn)象中發(fā)揮何種作用。“基因靶向”技術(shù)為闡明人類疾病的發(fā)生機(jī)理方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)2007年諾17在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)基因打靶是指通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能?；虼虬屑夹g(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段，它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干(ES)細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)成就的基礎(chǔ)之上，并促進(jìn)了相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。通過對生物活體遺傳信息的定向修飾包括基因滅活、點(diǎn)突變引入、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳，表達(dá)突變的性狀，從而可以研究基因功能等生命科學(xué)的重大問題，以及提供相關(guān)的疾病治療、新藥篩選評價(jià)模型等?；虼虬屑夹g(shù)的發(fā)展己使得對特定細(xì)胞、組織或者動(dòng)物個(gè)體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾成為可能。在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)基因打靶是指通18Ⅳ精子載體法精子載體法是精子和外源DNA混合培養(yǎng)時(shí)，外源DNA可直接進(jìn)入精子的頭部，通過受精將外源基因引入動(dòng)物細(xì)胞中。外源DNA導(dǎo)入精細(xì)胞的方法有DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。Ⅳ精子載體法精子載體法是精子和外源DNA混合19Ⅴ體細(xì)胞核移植法1997年，英國科學(xué)家Schnieke和Wilmut等通過體細(xì)胞核移植技術(shù)成功克隆了“多莉”。1997年6月Wilmut報(bào)道用胚胎細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)治療人血友病的凝血因子IX轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波莉”。1999年，美國科學(xué)家Alexander克隆了３頭山羊，改變了它們的基因性狀，使它們的乳液內(nèi)含有一種對心臟病具有療效作用的蛋白質(zhì)。Ⅴ體細(xì)胞核移植法1997年，英國科學(xué)家Schn20Ⅵ受體介導(dǎo)法是將外源DNA與受體分子連接后與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)，受體可以介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。1999年，Ivanava用受體介導(dǎo)法制作了轉(zhuǎn)基因鼠。Ⅵ受體介導(dǎo)法是將外源DNA與受體分子連接后與胚21提高轉(zhuǎn)基因效率的策略1、對外源基因的整合機(jī)制進(jìn)行深入研究，避免基因的隨機(jī)整合，提高基因的表達(dá)效率。2、建立更完善的轉(zhuǎn)基因方法。利用胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)可以進(jìn)行基因表達(dá)的體外選擇，是提高轉(zhuǎn)基因效率的有效方法。3.探索有效的陽性胚胎篩選方法。4.使用大的外源DNA片段。5.選擇表達(dá)效率高的啟動(dòng)子。6.其它DNA順序的影響。如順式調(diào)控區(qū)元件等。提高轉(zhuǎn)基因效率的策略1、對外源基因的整合機(jī)制進(jìn)行深入研究，避22三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用（一）提高動(dòng)物優(yōu)良性狀、改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量（二）動(dòng)物抗病育種（三）生產(chǎn)藥用蛋白（四）生產(chǎn)人用營養(yǎng)保健品（五）生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官（六）建立診斷、治療人類疾病及新藥篩選的動(dòng)物模型三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用23四、克隆動(dòng)物

動(dòng)物克隆是一種通過核移植過程進(jìn)行無性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。四、克隆動(dòng)物

動(dòng)物克隆是一種通過核移植過程進(jìn)行無性繁殖的技術(shù)24五、克隆動(dòng)物的基本方法

（一）細(xì)胞核移植技術(shù)，是指將一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核移植至去核的卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生與供細(xì)胞核動(dòng)物的遺傳成份一樣的動(dòng)物的技術(shù)?？茖W(xué)家們已經(jīng)先后在綿羊、小鼠、牛、豬、山羊等動(dòng)物上獲得胚胎細(xì)胞核移植后代，目前，體細(xì)胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功。（二）細(xì)胞核移植方法先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)?，篩選獲得帶轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。然后，將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。重構(gòu)胚胎經(jīng)移植到母體中，產(chǎn)生的仔畜百分之百是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。五、克隆動(dòng)物的基本方法

（一）細(xì)胞核移植技術(shù)，是指將一個(gè)動(dòng)物25（三）細(xì)胞核和克隆的分類按使用的細(xì)胞性質(zhì)不同克隆可分為：①胚性克隆用未分化的胚胎進(jìn)行胚胎細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞核移植、胚胎成纖維細(xì)胞核移植、胚胎分割或胚胎嵌合等操作培育出新個(gè)體；②無性克隆用已分化的體細(xì)胞進(jìn)行核移植培育出新個(gè)體，亦稱體細(xì)胞克隆。當(dāng)前談?wù)摰目寺《嘀阁w細(xì)胞克隆。根據(jù)供核體細(xì)胞的不同，動(dòng)物克隆又可分為兩種類型：①同種體細(xì)胞克隆用相同物種體細(xì)胞進(jìn)行核移植；②異種體細(xì)胞克隆將一種動(dòng)物的體細(xì)胞核移植到另一種動(dòng)物的去核（遺傳物質(zhì)）卵母細(xì)胞中。按研究目的不同，克隆可分為生殖性克隆與治療性克隆；生殖性克隆指無性繁殖新個(gè)體，治療性克隆指用克隆技術(shù)培育出某些組織器官用于醫(yī)療。（三）細(xì)胞核和克隆的分類26六、克隆動(dòng)物的應(yīng)用克隆技術(shù)已展示出廣闊的應(yīng)用前景，概括起來大致有以下四個(gè)方面：（1）培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；（2）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；（3）生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法；（4）復(fù)制瀕危的動(dòng)物物種，保存和傳播動(dòng)物物種資源。六、克隆動(dòng)物的應(yīng)用27技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以提高生產(chǎn)能力。（瘦肉型豬）2.轉(zhuǎn)基因能增強(qiáng)抗病能力。（轉(zhuǎn)基因鮭魚）3.轉(zhuǎn)基因能生產(chǎn)生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。（轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人血紅蛋白）技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以提高生產(chǎn)能力。（瘦肉型豬）28技術(shù)的憂患1.基因污染：

人工組合的基因，可能會(huì)通過轉(zhuǎn)基因作物或家養(yǎng)動(dòng)物擴(kuò)展到其他栽培作物或自然界野生物種，并成為后者基因的一部分。這就是基因污染。2.基因武器運(yùn)用遺傳工程技術(shù)，按人們需要，在一些致病細(xì)菌或病毒中，接入能對抗普通疫苗或藥物的基因，產(chǎn)生具有顯著抗藥性的致病菌；或者在一些本來不會(huì)致病的微生物體內(nèi)接入致病基因，而制造出新的生物制劑。轉(zhuǎn)基因生物的危害.flv不要把他們的成果用于戰(zhàn)爭技術(shù)的憂患1.基因污染：不要把他們的成果用于戰(zhàn)爭29轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物30轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1982年美國華盛頓大學(xué)Palmiter等將大鼠生長激素基因?qū)胄“资蟮氖芫牙?，再將這一受精卵植入借腹懷孕的母鼠體內(nèi)，生下一個(gè)比正常體格大一倍的“超級小鼠”。按照轉(zhuǎn)基因小鼠的思路，人們已經(jīng)成功的獲得了轉(zhuǎn)基因大鼠、雞、山羊、綿羊、豬、兔、牛、蛙、魚等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1982年美國華盛頓大學(xué)Palmiter等將大鼠生31轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)概念研制的方法技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)發(fā)展前景克隆動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)概念32含外源基因的載體基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測繁殖后代含外源基因的載體基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測繁33轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物

一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概述（一）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過基因工程對DNA進(jìn)行體外操作，添加或刪除一個(gè)特殊的DNA序列，然后導(dǎo)入早期的胚胎干細(xì)胞中，產(chǎn)生遺傳結(jié)構(gòu)得以修飾的動(dòng)物，其改變的性狀可以遺傳給后代。這些改變包括：（1）外源DNA片段至少整合到一條染色體上；（2）由于外源DNA的插入使任何一個(gè)基因發(fā)生改變；（3）由于外源DNA的插入或內(nèi)源基因的刪除使染色體發(fā)生重排；（4）有意識地導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概述34（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名

1．符號(1)一個(gè)轉(zhuǎn)基因符號由以下三部分組成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段標(biāo)示；＃＃＃＃＃=實(shí)驗(yàn)室指定序號；Zzz=實(shí)驗(yàn)室注冊代號；（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名

1．符號35(2)方式轉(zhuǎn)基因符號通常冠以Tg字頭。隨后的一個(gè)字母（X）表示DNA插入的方式：H代表同源重組；R代表經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的插入；N代表非同源插入。(2)方式36（3）插入片段標(biāo)示An匿名序列；Ge基因組；Im插入突變；Nc非編碼序列；Rp報(bào)告基因；Sn合成序列；Et增強(qiáng)子捕獲裝置；Pt啟動(dòng)子捕獲裝置。（3）插入片段標(biāo)示372.舉例C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg：

來源于美國杰克遜研究所（J）的C57BL/6品系小鼠被轉(zhuǎn)入人的CD8基因組（Ge）；轉(zhuǎn)基因在JonW.Gordon(Jwg)實(shí)驗(yàn)室完成，獲取于一系列顯微注射后得到的序號為23的小鼠。2.舉例38二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本原理和方法（一）基本原理將改建后的目的基因用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵，然后將此受精卵再植入受體動(dòng)物的輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，人們可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良品種的工程動(dòng)物等。二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本原理和方法（一）基本原理391.外源目的基因的分離2.外源目的基因與轉(zhuǎn)性基因表達(dá)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、報(bào)告基因等構(gòu)件的拼接重組3.重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞4.胚胎移植技術(shù)5.鑒定及篩選6.目的基因整合率及表達(dá)效率的檢測（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)401.采取受精卵采取受精卵的方法分為獲得自然排卵的受精卵的方法和以激素誘發(fā)排卵的方法，還有采取未受精卵，然后在體外受精的方法。2.向受精卵雄性原核注入DNA溶液通過微分干涉顯微鏡觀察受精卵，會(huì)看到兩個(gè)大的原核。兩個(gè)核不久即可融合，接著核膜消失。雄性原核要比雌性原核能容納更多的DNA溶液，一般是向雄性原核注入DNA溶液。3.向假妊雌小鼠移植（1）假妊雌小鼠的制作（2）將操作卵移植至輸卵管4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測Ⅰ顯微注射法1.采取受精卵Ⅰ顯微注射法41Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法

原理：逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸為一條單鏈RNA分子，其基因由兩部分組成，一是順式作用序列，為病毒復(fù)制和整合所必需；二是反式作用序列，編碼病毒的包裝蛋白。將外源基因取代反式作用序列構(gòu)建成重組載DNA。另外將包裝蛋白基因?qū)雽ｉT的細(xì)胞并使之整合到染色體上，形成包裝細(xì)胞。如果重組病毒DNA導(dǎo)入這種包裝細(xì)胞中，病毒包裝蛋白能將DNA包裝成具有感染力的重組蛋白顆粒，能浸染動(dòng)物細(xì)胞而將重組DNA引入宿主細(xì)胞。Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法原理：42Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法步驟：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建2.選擇和培養(yǎng)包裝細(xì)胞系3.重組病毒DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞4.收集重組病毒顆粒5.感染胚細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化此法是目前制備轉(zhuǎn)基因雞最有效和最成功的方法。Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄病毒法步驟：43Ⅲ胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞是在人（哺乳動(dòng)物）胚胎發(fā)育早期——囊胚（受精后約5—7天）中未分化的細(xì)胞。囊胚含有約140個(gè)細(xì)胞，外表是一層扁平細(xì)胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群，稱內(nèi)細(xì)胞群，這些未分化的細(xì)胞可進(jìn)一步分裂、分化，發(fā)育成個(gè)體。由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，我們稱之為胚胎干細(xì)胞。

Ⅲ胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞是在人（哺乳動(dòng)物）胚胎44利用胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程1.3.5天的孕鼠2.分離胚細(xì)胞3.轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4.分離內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)5.收集干細(xì)胞克隆6.酶處理解散細(xì)胞7.培養(yǎng)干細(xì)胞8.轉(zhuǎn)染干細(xì)胞9.植入代孕母鼠體內(nèi)利用胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程1.3.5天的孕鼠45在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)

2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)分別授予兩名美國人馬里奧·卡佩基、奧利弗·史密斯和一名英國人馬丁·埃文斯，以表彰他們在“基因靶向”技術(shù)方面的突出貢獻(xiàn)。諾貝爾獎(jiǎng)評審委員會(huì)發(fā)布的公報(bào)說，三位科學(xué)家“在涉及胚胎干細(xì)胞和哺乳動(dòng)物ＤＮＡ重組方面有著一系列突破性發(fā)現(xiàn)”，為“基因靶向”技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。在“基因靶向”技術(shù)的幫助下，科學(xué)家可以使小鼠體內(nèi)的特定基因喪失功能。此類“基因敲除”試驗(yàn)可以幫助人們了解基因在胚胎發(fā)育等多種現(xiàn)象中發(fā)揮何種作用?！盎虬邢颉奔夹g(shù)為闡明人類疾病的發(fā)生機(jī)理方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)2007年諾46在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)基因打靶是指通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能?；虼虬屑夹g(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段，它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干(ES)細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)成就的基礎(chǔ)之上，并促進(jìn)了相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。通過對生物活體遺傳信息的定向修飾包括基因滅活、點(diǎn)突變引入、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳，表達(dá)突變的性狀，從而可以研究基因功能等生命科學(xué)的重大問題，以及提供相關(guān)的疾病治療、新藥篩選評價(jià)模型等?；虼虬屑夹g(shù)的發(fā)展己使得對特定細(xì)胞、組織或者動(dòng)物個(gè)體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾成為可能。在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)基因打靶是指通47Ⅳ精子載體法精子載體法是精子和外源DNA混合培養(yǎng)時(shí)，外源DNA可直接進(jìn)入精子的頭部，通過受精將外源基因引入動(dòng)物細(xì)胞中。外源DNA導(dǎo)入精細(xì)胞的方法有DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。Ⅳ精子載體法精子載體法是精子和外源DNA混合48Ⅴ體細(xì)胞核移植法1997年，英國科學(xué)家Schnieke和Wilmut等通過體細(xì)胞核移植技術(shù)成功克隆了“多莉”。1997年6月Wilmut報(bào)道用胚胎細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)治療人血友病的凝血因子IX轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波莉”。1999年，美國科學(xué)家Alexander克隆了３頭山羊，改變了它們的基因性狀，使它們的乳液內(nèi)含有一種對心臟病具有療效作用的蛋白質(zhì)。Ⅴ體細(xì)胞核移植法1997年，英國科學(xué)家Schn49Ⅵ受體介導(dǎo)法是將外源DNA與受體分子連接后與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)，受體可以介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。1999年，Ivanava用受體介導(dǎo)法制作了轉(zhuǎn)基因鼠。Ⅵ受體介導(dǎo)法是將外源DNA與受體分子連接后與胚50提高轉(zhuǎn)基因效率的策略1、對外源基因的整合機(jī)制進(jìn)行深入研究，避免基因的隨機(jī)整合，提高基因的表達(dá)效率。2、建立更完善的轉(zhuǎn)基因方法。利用胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)可以進(jìn)行基因表達(dá)的體外選擇，是提高轉(zhuǎn)基因效率的有效方法。3.探索有效的陽性胚胎篩選方法。4.使用大的外源DNA片段。5.選擇表達(dá)效率高的啟動(dòng)子。6.其它DNA順序的影響。如順式調(diào)控區(qū)元件等。提高轉(zhuǎn)基因效率的策略1、對外源基因的整合機(jī)制進(jìn)行深入研究，避51三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用（一）提高動(dòng)物優(yōu)良性狀、改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量（二）動(dòng)物抗病育種（三）生產(chǎn)藥用蛋白（四）生產(chǎn)人用營養(yǎng)保健品（五）生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官（六）建立診斷、治療人類疾病及新藥篩選的動(dòng)物模型三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用52四、克隆動(dòng)物

動(dòng)物克隆是一種通過核移植過程進(jìn)行無性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。四、克隆動(dòng)物

動(dòng)物克隆是一種通過核移植過程進(jìn)行無性繁殖的技術(shù)53五、克隆動(dòng)物的基本方法

（一）細(xì)胞核移植技術(shù)，是指