第六章凝膠過濾課件

第六章凝膠過濾第六章凝膠過濾1

凝膠過濾又稱凝膠擴散色譜、排阻色譜、限制擴散色譜、分子篩層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析。凝膠過濾又稱凝膠擴散色譜、排阻色譜、限2特點操作簡便、設(shè)備簡單分離效果好，重復性高分離條件緩和應用廣泛分辨率不高，分離操作慢特點操作簡便、設(shè)備簡單3第一節(jié)凝膠的分類及性質(zhì)

凝膠：是不溶于水但在水中有較大膨脹度和較好分子篩功能的一類化合物。

主要有葡聚糖凝膠、天然瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖。其次，還有聚丙烯酰胺凝膠(生物膠)、交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚凝膠，以及交聯(lián)瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合的凝膠等。第一節(jié)凝膠的分類及性質(zhì)凝膠：是不溶于水4一、葡聚糖凝膠

是應用最廣的一類凝膠，葡聚糖凝膠的商品名稱為sephadex，它是由葡聚糖和3—氯—1，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)在堿性條件下，以透平油作為分散介質(zhì)，在40℃以醚鍵相互交聯(lián)，然后進行酒精脫水，烘干、過篩而成的。一、葡聚糖凝膠是應用最廣的一類凝膠，葡聚糖凝5第六章凝膠過濾課件61．理化性質(zhì)

葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下放大700倍以上，可見其表面的網(wǎng)狀皺紋，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。

1．理化性質(zhì)7

交聯(lián)度：交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分數(shù)。吸水量：每克干凝膠在水中充分膨脹時所需的水量。但不包括顆粒間所帶的水量膨脹度：每g干膠在水或其他規(guī)定的溶劑中，在一定時間與溫度條件下膨脹后所占有的體積毫升數(shù)。S=V/W

交聯(lián)度：交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分數(shù)。8交聯(lián)度

吸水量

膨脹度

分離對象的大小編號交聯(lián)度吸液量膨脹速度凝膠網(wǎng)孔分離限凝膠強度大小小大大小慢快大小大小小大交聯(lián)度9

型號、顆粒大小、分離范圍、吸水量、膨脹度、溶脹時間。G后面的編號為膨脹度的10倍。如：sephadexG-25表示每克干膠吸水量為2.5ml。除了在水中溶漲外，葡聚糖凝膠還可在乙醇、甲酰胺、二甲亞砜中溶漲。sephadexG-25在水中只需溶漲3小時，sephadexG-100需要3天才能飽和。商品葡聚糖凝膠的規(guī)格型號、顆粒大小、分離范圍、吸水量、膨脹度、溶脹時10

2．穩(wěn)定性

葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學降解。

在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可置高溫(120℃)消毒0.5h，其性質(zhì)并不改變。在0.1mol/LHCl溶液中浸泡1-2h，甚至在0.02mol／LHCl溶液中浸泡6個月以上，對分離效果無明顯的影響。

但是，當暴露于強酸或氧化劑溶液時，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。

2．穩(wěn)定性11

3．吸附性

葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì)、這是由于其每克干膠含10－20ug當量的羧基基團所致。該基團能與分離物中電荷基團(尤其是堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用。當離子強度大于0.05時，一般對弱堿性蛋白質(zhì)就無吸附力了。因此進行葡聚糖凝膠層析時，常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。

3．吸附性12

新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但是在制作測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的標準曲線時，或者分離純化極難得到的物質(zhì)時，需先用易得到的蛋白質(zhì)進行預層析，以便消除其影響。新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖13

二、瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中提純的，主要由D半乳糖和3,6脫水L半乳糖連接而成的一種線性多糖。

瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠的孔徑由制膠時瓊脂糖的濃度決定，低濃度瓊脂糖形成的孔徑較大，而高濃度瓊脂糖形成的孔徑較小。

二、瓊脂糖凝膠14

盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可被羧基、甲氧基、硫酸根等取代，因而使瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，樣品與凝膠間的相互靜電作用產(chǎn)生吸附，從而影響分離效果。但是明顯低于葡聚糖。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可被羧15

這種多糖鏈在100℃左右時呈液態(tài)，當溫度到45℃以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。該物質(zhì)對尿素和鹽酸等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力。在pH4.0—9.0的緩沖液中是穩(wěn)定的、瓊脂糖凝膠置室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。

這種多糖鏈在100℃左右時呈液態(tài)16

瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好，分離范圍大。用瓊脂糖凝膠進行柱層析時，流速可以快些。

最好使用條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃，超出此范圍,可能被破壞。瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠17瓊脂糖凝膠規(guī)格國產(chǎn)的產(chǎn)品有3種規(guī)格：Sepharose2B、4B、6B分別表示瓊脂糖濃度為2%、4%、6%。

美國的為Bio－GA，有6個型號:即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯數(shù)字乘以106表示排阻限度。

瓊脂糖凝膠規(guī)格國產(chǎn)的產(chǎn)品有3種規(guī)格：美國的為Bi18濃度大，分離范圍小，顆粒強度大。CL交聯(lián)瓊脂糖：

Sepharose與1，3-二溴異丙醇在強堿條件下生成的。比瓊脂糖的穩(wěn)定性提高，PH范圍3-14。濃度大，分離范圍小，顆粒強度大。19三、聚丙烯酰胺凝膠

是一種全化學合成的人工凝膠。聚丙烯酰胺的商品名為Bio-gelP。它是以甲撐雙丙烯酰胺(雙體)作交聯(lián)劑、以過硫酸銨作催化劑，在四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下，將丙烯胺(單體)聚合而成的。當改變單體濃度時，就可得到吸水率不同的產(chǎn)物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯數(shù)字相當于排阻限度的10-3。三、聚丙烯酰胺凝膠是一種全化學合成的人工20聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)單體丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)單體丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺21

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過調(diào)整交聯(lián)度（一般1%-25%）以及凝膠總濃度（5%-25%）來控制。

以（T）代表100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為凝膠濃度。

交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分比稱為交聯(lián)度，以（C）表示?？倽舛然蚪宦?lián)度增加，孔徑減少。

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過調(diào)整交聯(lián)度（一般1%22

一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，使用的必須溶脹。

穩(wěn)定性：該凝膠不溶于水和普通有機溶劑，能忍受濃的鹽、尿素和胍鹽等溶液的浸泡；在PH1-10或短時間超過此pH范圍的溶液中較穩(wěn)定，要避免長期與強酸和強堿接觸，如果與其接觸并在高溫條件下，酚胺基將迅速發(fā)生分解。

物理化學性質(zhì)一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式23

吸附性：聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象，如使用離子強度略高的洗脫液操作，此弊病可以克服。不為微生物利用，易保存。吸附性：聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合24四、Sephacryl

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成的，此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團。

Sephacryl吸水時，其珠狀顆粒直徑為25-75um，通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機相系統(tǒng)使用時，其孔徑大小略有變化。四、Sephacryl

Sephacry25

化學性質(zhì)穩(wěn)定：

它在所有的溶劑中不溶解，化學降解也很少；它可在pH2—11范圍內(nèi)使用，當pH低時，葡聚糖鏈發(fā)生少許水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室溫)處理100h，對其低流速和多孔性沒有明顯影響;用去污劑(如SDS)、6mo1／L鹽酸胍和8mol/L尿素溶液可作為洗脫劑，高溫(120℃)消毒(pH7.0時)處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化。

化學性質(zhì)穩(wěn)定：26

Sephacryl能用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至大的病毒顆粒（直徑＞300－400nm）也可用它分離。Sephacryl能用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖27五、Superdex

Superdex是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成的。該凝膠具有良好的分子篩特性和物理、化學穩(wěn)定性。在用其分離樣品過程中，溶液的酸堿度可在pH3-12范圍內(nèi)變化，溶液中加入去污劑(如1％SDS)和(或)解離劑(如8mol/L尿素、6mol／L鹽酸胍)時，也不會影響分離效果。此凝膠共有6種類型。(見書)缺點：對蛋白質(zhì)有吸附能力。五、SuperdexSuperdex是由28第二節(jié)基本原理

當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。第二節(jié)基本原理當含有各種組分的樣品流291、分子大小不同混合物上柱；2、洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3、大小分子分開；4、大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中。

1、分子大小不同混合物上柱；2、洗脫開始，小分子擴散進30

凝膠過濾層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而不能排阻某些小分子化合物。任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱被排阻的范圍均在0－100％之間，其被排阻的程度可以用分配系數(shù)Kav(分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系)表示。凝膠過濾層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、31

Kav的大小依賴于凝膠床的總體積(Vt)、外水體積(V0)(outervolume)以及分離物本身的洗脫體積(Ve)(elutionvolume)：=

Kav的大小依賴于凝膠床的總體積(Vt)32

在限定的層析條件下，Vt、和V0都為恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子質(zhì)量的變化而變化的。分離物分子質(zhì)量大，Kav值?。环粗?，則Kav值增大。

因此，在同一凝膠過濾柱上分離分子質(zhì)量不同的物質(zhì)時，由于流動相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴散效應。若緩沖液連續(xù)注入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴散效應也將連續(xù)發(fā)生，其最終結(jié)果是分子質(zhì)量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子質(zhì)量小的物質(zhì)則后從柱中流出。柱出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子質(zhì)量不同的物質(zhì)相互篩分開了。在限定的層析條件下，Vt、和V0都為恒定33

其篩分效果受操作條件(如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等)的影響是顯而易見的，但更為直接的影響是Kav值的差異性。Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小、乃至等于1或等于零(即使樣品中各組分的分子質(zhì)量相差很大)，則分離效果很差，或根在不能分開。

Kav值既是判斷分離效果的參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的重要依據(jù)。從公式可以看出，只要測出床體積Vt，和外水體積Vo以及洗脫體積Ve即可計算出Kav值。其篩分效果受操作條件(如基質(zhì)的顆粒大小34

凝膠床總體積Vt可用兩種方法：計算法：即根據(jù)層析柱體積計算總體積，可用下列公式：Vt=πR2h在用此公式計算凝膠床總體積時，須精確地分段測量，以防內(nèi)徑不勻造成誤差。另外還須注意到，在層析過程中，尤其是軟膠操作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。凝膠床總體積Vt可用兩種方法：35

測量法：由凝膠床的組成可知，床體積Vt等于外水體積V0、內(nèi)水體積Vi與凝膠顆粒實際占有體積Vg之和。即：

Vt=Vo+Vi+Vg因Vg和Vt相比很小，可忽略不計，故：Vt=V0+Vi。

測量法：36當把分子質(zhì)量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內(nèi)水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者，不能進入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中，凝膠床的洗脫體積Ve認剛好等于外水體積V0。即Ve＝V0（Kav＝0）然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者，能自由進入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積應等于凝膠床總體積，即Ve=Vt=V0+Vi（Kav＝1）。而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限者，則有一部分能進入凝膠網(wǎng)孔，故其洗脫體積Ve是在V0和Vt之間。當把分子質(zhì)量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在37不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù)

型號VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-20030920不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù)

型號VtV0ViG-1020.838第三節(jié)操作

一、凝膠的選擇和處理1．凝膠的選擇

選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。

第三節(jié)操作

一、凝膠的選擇和處理39（1）型號：不同凝膠篩分范圍各不相相同Sephadex的分離范圍，常用于測定高聚糖或球蛋白。SephadexG型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。如果用于分離核酸時，則限于其空間結(jié)構(gòu)和所帶基團的影響。選用高于它們分子質(zhì)量范圍的型號，或者選用適當型號的生物膠和sephacy1。各種型號凝膠的規(guī)格和性質(zhì)不同。

在除去蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時，可選用凝膠SephadexG-25。當溶液通過G-25柱時．蛋白質(zhì)被排阻住凝膠外面先流出來，而鹽類則擴散到凝膠網(wǎng)孔里后流出來，這樣就便蛋白質(zhì)得到純化，一般來說，在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間分子質(zhì)量差別越大，分離的效果越好。（1）型號：40

（2）粒度：

凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響。一般來說，細粒凝膠柱之間空間小，裝柱易均一，流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。由于細顆粒凝膠流速慢，故宜用大直徑的層析柱，這類凝膠用于小型試驗，可得到滿意結(jié)果。而粗顆粒凝膠流速快．宜用于小直徑的層析柱，如操作得當也可得到較滿意的結(jié)果。（2）粒度：41

凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖

凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖42

在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應在150μm左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm43

對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以最常用的葡聚糖凝膠類為例，分別加以討論。對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式441．類分離

目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組分。選擇凝膠時，應使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數(shù)Kd=0，小分子的Kd＝1。這樣能取得最好的分離效果。1．類分離目的是分開樣品中分子量懸殊的“45

例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用SephadexG-25凝膠作為分離固定相，因為它的分離范圍是1000～5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達最大值1。對于分子量小于5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用SephadexG-15凝膠。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知462．分級分離

目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有3個組分的話，最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1／3。2．分級分離目的是分開分子量不很懸殊的47

因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運動所受的約束很小，不易與低分子組分分開。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開。如用SephadexG-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比SephadexG-150為好。但也有人選用G-150，那是因為G-200強度太低不便操作的緣故（見下圖）。因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆48不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖49

2．凝膠用量的計算

根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度，按下面的公式可計算出所需干凝膠的用量：干凝膠用量(g)＝πr2h/（床體積/g）用此法計算出的干凝膠用量還需增加10％—20％，因為凝膠在處理過程中會有一部分損失掉。

2．凝膠用量的計算503．凝膠的處理干凝膠加入5、10倍的蒸餾水

充分浸泡

去小顆粒

用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液浸泡0.5h

去堿液

蒸餾水洗至中性。

抽氣

除去凝膠中的氣泡的方法加熱煮沸注意點:避免置于酸或堿溶液中加熱。3．凝膠的處理51

二、凝膠柱的制備

1．柱的選擇

同樣直徑的層析柱長層析柱比短的分辨率高；同樣長度的層析柱直徑大的比小的分辨率高；同樣體積的層析柱層析柱長的比短的分辨率高。理想的層析柱直徑與長度之比是1：25-1：100。層析柱最好有夾央套，這樣溫度可以控制，得到的結(jié)果容易重復。二、凝膠柱的制備52

一般選用細長的柱作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。一般選用細長的柱作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高53

2．裝柱

2．裝柱541）除去氣泡的溶脹凝膠應與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度也要恒定。2）應調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除。3）將柱子固定在穩(wěn)定的支架上，并保證其垂直。4）先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要排除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15％。1）除去氣泡的溶脹凝膠應與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度55

5）柱頂接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注入柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)生氣泡。6）柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑。7）柱內(nèi)膠面上部保留2～3cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來。8）調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速。檢查流體靜壓力，不要超過規(guī)定數(shù)值。如果使用蠕動泵，注意使流速不超過穩(wěn)定后利用重力調(diào)節(jié)所達到的流速，一般要低于后者10％。5）柱頂接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注入柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)56

三、加樣與洗脫1．加樣

加樣量與測定方法和層析柱大小有關(guān)。如測定樣品含量的方法靈敏或床體積小時，加樣量可少，否則反之。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小(樣品濃度高時)，分辨率越高。但是，當用于樣品的制備和脫鹽時、加樣量應在不影響分辨率的前提下增大。究竟加樣體積多少為宜?這要視被分離物在層析柱的分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來決定。假設(shè)，A、B兩個被分離物在層析柱中的洗脫體積分別為Vea、Veb，A、B洗脫體積之差稱為分離體積，以Vs表示。則

Vs=Vea—Veb三、加樣與洗脫573．凝膠柱的鑒定

新裝的吸附柱用適當?shù)木彌_液平衡后，將帶色的藍色葡聚糖-2000、或者紅色葡聚糖、細胞色素C、血紅蛋白等物質(zhì)配成2mg/ml的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降，如均勻下降，則表明柱中凝膠是均勻的，或者說柱中沒裂縫和氣泡，是可以使用的，否則就須重新裝柱。3．凝膠柱的鑒定58

由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導致粘度增大，而使層析分辨率下降（下圖）。一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后上柱。由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才59樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為5%，相對粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使終濃度為1%.樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為560

2．洗脫

所有的洗脫液均以能溶解被洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。除個別特殊情況外，一般都以單一緩沖液(如磷酸緩沖液、Tis-HCl緩沖液等)或者鹽溶液作為洗脫液，有時甚至也可以用蒸餾水作洗脫液。洗脫時的流速要嚴格控制，否則收集的每一部分洗脫體積就不會恒定，理想的分配系數(shù)就難以測出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵(微量泵)，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。另一種是恒壓重力洗脫。凝膠過濾層析的洗脫流速與操作壓、層析柱體積以及基質(zhì)的性質(zhì)是有密切關(guān)系的。2．洗脫61流速對洗脫曲線的影響

流速對洗脫曲線的影響62

對強度較大的凝膠，如SephadexG-10～50，在相當大的柱壓范圍內(nèi)流速（Ⅴ）與操作壓（F）成正比，與柱長（L）成反比：Ⅴ=KΔP／L

而對于強度差的凝膠，符合以上公式壓力范圍很小。進一步加大壓力時，由于凝膠顆粒變形流速反而降低。

對強度較大的凝膠，如Sepha63各種層析柱裝置的操作壓（或靜水壓）（a），（b）操作壓等于柱或貯液器內(nèi)液面和出水接管末端的高度差；（c），（d）壓力的大小是由恒壓瓶內(nèi)空氣入口管的底部至出口接管末端的高度計算。向下（c）或向上（d）移動出水管無關(guān)緊要各種層析柱裝置的操作壓（或靜水壓）64

四、凝膠柱的再生及保存1、再生僅使用過一次的凝膠柱，通常進行更新平衡后即可再次使用；但使用過多次后，由于凝膠床體積變小、流動速度降低或污染雜質(zhì)過多等原因，致使其正常性能受到影響。在此情況下，如欲重復使用，就須進行再生處理。方法是：先用水反復進行逆向沖洗，再用緩沖液進行平衡，平衡畢，即可重復使用；另一種方法是，把凝膠倒出，用低濃度的酸或堿按其預處理方法進行，處理后重新裝柱即可再行使用。四、凝膠柱的再生及保存65保存方法：

濕法：洗凈的凝膠懸浮于蒸餾水和緩沖液中，應加入適量的防腐劑如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物將生長。干法：用濃度逐步升高的乙醇洗凈凝膠，使其脫水收縮，再抽干乙醇，用60-80℃的暖風吹干，在室溫下保存。半縮法：是過度法，用60%-70%的乙醇使凝膠部分脫水，然后封口，4℃保存。保存方法：濕法：洗凈的凝膠懸浮于蒸餾水66第六章凝膠過濾課件67第四節(jié)應用一、脫鹽和濃縮二、分離生命物質(zhì)三、去熱源物質(zhì)四、測定分子質(zhì)量五、其他第四節(jié)應用一、脫鹽和濃縮681、脫鹽高分子溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。優(yōu)點：

操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等不易變性適用的凝膠：

SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、61、脫鹽高分子溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這69

用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡上樣用同樣緩沖液洗脫收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類蛋白質(zhì)不會因為脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上

用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡上樣用同樣緩沖液洗脫702、分離提純凝膠過濾的載體可以根據(jù)它們的孔徑分為很多種不同的規(guī)格。每種規(guī)格都有其特定的分級的范圍，一旦超出分組范圍，不論是其上限還是下限，即使分子量有大有小，但載體的排阻情況基本相同，就不能分離。在凝膠過濾層析時，要根據(jù)所要純化的樣品的分子量選擇所用的凝膠過濾的基質(zhì)。

2、分離提純凝膠過濾的載體可以根據(jù)它們的孔徑分為很多種不同的71天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50柱(1.8cm×100cm)用50mmol/LTris-HCl,pH7.8緩沖液平衡天花粉硫酸銨糊(90％飽和度的沉淀)溶于2m1平衡緩沖液中上樣洗脫天花粉毒蛋白除去不溶物↓↘↘↓天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50柱(1.8c72

733、測定高分子物質(zhì)的分子量測大于所用載體上限分子的洗脫體積測小于下限的分子的洗脫體積標定凝膠過濾柱的Vo標定凝膠過濾柱的Vi測定一系列已知分子量的標淮樣品在柱上的洗脫體積Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作圖測得了待測分子量的樣品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)從標準曲線上可以求得未知樣品的分子量藍色葡聚糖氨基酸、有色鹽類↓↓↓↓↓↘↙以標準樣品的分子量的1ogMw對Ve作圖or3、測定高分子物質(zhì)的分子量測大于所用載體上限分子的洗脫體積測74分子量的測定方法有兩種

（1）求解法為了求得上述方程中的兩個常數(shù)K和C,先以兩個已知分子量的蛋白質(zhì)過柱。設(shè)其分子量分別為M1、M2，洗脫體積分別為Vl、V2，解方程組：

Ve1=C-KLogM1

Ve2=C-KLogM2

求得C和K以后，將任何一個待測物質(zhì)的Ve值代入方程便可計算得出其分子量。分子量的測定方法有兩種（1）求解法為了求得上述方程中的75

（2）標準曲線法對于特定的測定系統(tǒng)，先以3個以上（最好更多些）的已知分子的標準蛋白（目前已有配套標準蛋白系列產(chǎn)品出售）過柱，測取各自的Ve值。以Ve作縱坐標，LogM作橫坐標制做標準曲線。在同一測定系統(tǒng)中測出未知物質(zhì)的Ve值便可由標標準曲線求得分子量。分子量在10000～150000之間的球形蛋白用此法測出的分子量誤差在10％左右。對于線性分子的誤差還可大于此值。

如果以Ve／Vo對分子量對數(shù)作圖，同樣也可以得到一個線性關(guān)系的標準曲線。Ve／Vo與柱子大小無關(guān)，也不受吸附效應的影響，因此測定效果較好。蛋白質(zhì)、酶、激素、多肽、多核苷酸、多糖類高分子量生化產(chǎn)品都可以用凝膠過濾法測定分子量。（2）標準曲線法對于特定的測定系統(tǒng)，先以3個以上（最好76第六章凝膠過濾課件774、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物質(zhì)就會進入凝膠粒子內(nèi)部高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外離心或過濾，去除溶脹的凝膠濃縮的高分子溶液↓4、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入785、蛋白質(zhì)復性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲變性蛋白體積大，只能進入顆粒間隙，遷移速度快變性劑分子量小，進入顆粒內(nèi)部，遷移速度慢緩沖液洗脫蛋白變性劑濃度降低，轉(zhuǎn)成復性緩沖液變性蛋白復性，以天然形態(tài)洗脫出柱↓↓↓↓↓↓5、蛋白質(zhì)復性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈79凝膠過濾層析經(jīng)常遇見的問題

1．流速慢（1）有氣泡、出水管阻塞（2）沒打開夾子（3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣）

2．柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡

（1）上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流（2）接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊凝膠過濾層析經(jīng)常遇見的問題1．流速慢80

3．條帶扭曲

（1）膠面不平（2）樣品或洗脫液中有顆粒（3）裝柱不均勻4．分辯率不高

（1）裝柱不均勻（2）樣品量過大（3）流速太快（4）柱不垂直或柱不合適（5）長菌（6）柱下口軟管太長（7）膠不適當3．條帶扭曲81第六章凝膠過濾第六章凝膠過濾82

凝膠過濾又稱凝膠擴散色譜、排阻色譜、限制擴散色譜、分子篩層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析。凝膠過濾又稱凝膠擴散色譜、排阻色譜、限83特點操作簡便、設(shè)備簡單分離效果好，重復性高分離條件緩和應用廣泛分辨率不高，分離操作慢特點操作簡便、設(shè)備簡單84第一節(jié)凝膠的分類及性質(zhì)

凝膠：是不溶于水但在水中有較大膨脹度和較好分子篩功能的一類化合物。

主要有葡聚糖凝膠、天然瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖。其次，還有聚丙烯酰胺凝膠(生物膠)、交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚凝膠，以及交聯(lián)瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合的凝膠等。第一節(jié)凝膠的分類及性質(zhì)凝膠：是不溶于水85一、葡聚糖凝膠

是應用最廣的一類凝膠，葡聚糖凝膠的商品名稱為sephadex，它是由葡聚糖和3—氯—1，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)在堿性條件下，以透平油作為分散介質(zhì)，在40℃以醚鍵相互交聯(lián)，然后進行酒精脫水，烘干、過篩而成的。一、葡聚糖凝膠是應用最廣的一類凝膠，葡聚糖凝86第六章凝膠過濾課件871．理化性質(zhì)

葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下放大700倍以上，可見其表面的網(wǎng)狀皺紋，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。

1．理化性質(zhì)88

交聯(lián)度：交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分數(shù)。吸水量：每克干凝膠在水中充分膨脹時所需的水量。但不包括顆粒間所帶的水量膨脹度：每g干膠在水或其他規(guī)定的溶劑中，在一定時間與溫度條件下膨脹后所占有的體積毫升數(shù)。S=V/W

交聯(lián)度：交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分數(shù)。89交聯(lián)度

吸水量

膨脹度

分離對象的大小編號交聯(lián)度吸液量膨脹速度凝膠網(wǎng)孔分離限凝膠強度大小小大大小慢快大小大小小大交聯(lián)度90

型號、顆粒大小、分離范圍、吸水量、膨脹度、溶脹時間。G后面的編號為膨脹度的10倍。如：sephadexG-25表示每克干膠吸水量為2.5ml。除了在水中溶漲外，葡聚糖凝膠還可在乙醇、甲酰胺、二甲亞砜中溶漲。sephadexG-25在水中只需溶漲3小時，sephadexG-100需要3天才能飽和。商品葡聚糖凝膠的規(guī)格型號、顆粒大小、分離范圍、吸水量、膨脹度、溶脹時91

2．穩(wěn)定性

葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學降解。

在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可置高溫(120℃)消毒0.5h，其性質(zhì)并不改變。在0.1mol/LHCl溶液中浸泡1-2h，甚至在0.02mol／LHCl溶液中浸泡6個月以上，對分離效果無明顯的影響。

但是，當暴露于強酸或氧化劑溶液時，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。

2．穩(wěn)定性92

3．吸附性

葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì)、這是由于其每克干膠含10－20ug當量的羧基基團所致。該基團能與分離物中電荷基團(尤其是堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用。當離子強度大于0.05時，一般對弱堿性蛋白質(zhì)就無吸附力了。因此進行葡聚糖凝膠層析時，常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。

3．吸附性93

新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但是在制作測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的標準曲線時，或者分離純化極難得到的物質(zhì)時，需先用易得到的蛋白質(zhì)進行預層析，以便消除其影響。新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖94

二、瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中提純的，主要由D半乳糖和3,6脫水L半乳糖連接而成的一種線性多糖。

瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠的孔徑由制膠時瓊脂糖的濃度決定，低濃度瓊脂糖形成的孔徑較大，而高濃度瓊脂糖形成的孔徑較小。

二、瓊脂糖凝膠95

盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可被羧基、甲氧基、硫酸根等取代，因而使瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，樣品與凝膠間的相互靜電作用產(chǎn)生吸附，從而影響分離效果。但是明顯低于葡聚糖。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可被羧96

這種多糖鏈在100℃左右時呈液態(tài)，當溫度到45℃以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。該物質(zhì)對尿素和鹽酸等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力。在pH4.0—9.0的緩沖液中是穩(wěn)定的、瓊脂糖凝膠置室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。

這種多糖鏈在100℃左右時呈液態(tài)97

瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好，分離范圍大。用瓊脂糖凝膠進行柱層析時，流速可以快些。

最好使用條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃，超出此范圍,可能被破壞。瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠98瓊脂糖凝膠規(guī)格國產(chǎn)的產(chǎn)品有3種規(guī)格：Sepharose2B、4B、6B分別表示瓊脂糖濃度為2%、4%、6%。

美國的為Bio－GA，有6個型號:即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯數(shù)字乘以106表示排阻限度。

瓊脂糖凝膠規(guī)格國產(chǎn)的產(chǎn)品有3種規(guī)格：美國的為Bi99濃度大，分離范圍小，顆粒強度大。CL交聯(lián)瓊脂糖：

Sepharose與1，3-二溴異丙醇在強堿條件下生成的。比瓊脂糖的穩(wěn)定性提高，PH范圍3-14。濃度大，分離范圍小，顆粒強度大。100三、聚丙烯酰胺凝膠

是一種全化學合成的人工凝膠。聚丙烯酰胺的商品名為Bio-gelP。它是以甲撐雙丙烯酰胺(雙體)作交聯(lián)劑、以過硫酸銨作催化劑，在四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下，將丙烯胺(單體)聚合而成的。當改變單體濃度時，就可得到吸水率不同的產(chǎn)物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯數(shù)字相當于排阻限度的10-3。三、聚丙烯酰胺凝膠是一種全化學合成的人工101聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)單體丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)單體丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺102

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過調(diào)整交聯(lián)度（一般1%-25%）以及凝膠總濃度（5%-25%）來控制。

以（T）代表100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為凝膠濃度。

交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分比稱為交聯(lián)度，以（C）表示?？倽舛然蚪宦?lián)度增加，孔徑減少。

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過調(diào)整交聯(lián)度（一般1%103

一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，使用的必須溶脹。

穩(wěn)定性：該凝膠不溶于水和普通有機溶劑，能忍受濃的鹽、尿素和胍鹽等溶液的浸泡；在PH1-10或短時間超過此pH范圍的溶液中較穩(wěn)定，要避免長期與強酸和強堿接觸，如果與其接觸并在高溫條件下，酚胺基將迅速發(fā)生分解。

物理化學性質(zhì)一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式104

吸附性：聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象，如使用離子強度略高的洗脫液操作，此弊病可以克服。不為微生物利用，易保存。吸附性：聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合105四、Sephacryl

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成的，此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團。

Sephacryl吸水時，其珠狀顆粒直徑為25-75um，通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機相系統(tǒng)使用時，其孔徑大小略有變化。四、Sephacryl

Sephacry106

化學性質(zhì)穩(wěn)定：

它在所有的溶劑中不溶解，化學降解也很少；它可在pH2—11范圍內(nèi)使用，當pH低時，葡聚糖鏈發(fā)生少許水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室溫)處理100h，對其低流速和多孔性沒有明顯影響;用去污劑(如SDS)、6mo1／L鹽酸胍和8mol/L尿素溶液可作為洗脫劑，高溫(120℃)消毒(pH7.0時)處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化。

化學性質(zhì)穩(wěn)定：107

Sephacryl能用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至大的病毒顆粒（直徑＞300－400nm）也可用它分離。Sephacryl能用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖108五、Superdex

Superdex是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成的。該凝膠具有良好的分子篩特性和物理、化學穩(wěn)定性。在用其分離樣品過程中，溶液的酸堿度可在pH3-12范圍內(nèi)變化，溶液中加入去污劑(如1％SDS)和(或)解離劑(如8mol/L尿素、6mol／L鹽酸胍)時，也不會影響分離效果。此凝膠共有6種類型。(見書)缺點：對蛋白質(zhì)有吸附能力。五、SuperdexSuperdex是由109第二節(jié)基本原理

當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。第二節(jié)基本原理當含有各種組分的樣品流1101、分子大小不同混合物上柱；2、洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3、大小分子分開；4、大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中。

1、分子大小不同混合物上柱；2、洗脫開始，小分子擴散進111

凝膠過濾層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而不能排阻某些小分子化合物。任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱被排阻的范圍均在0－100％之間，其被排阻的程度可以用分配系數(shù)Kav(分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系)表示。凝膠過濾層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、112

Kav的大小依賴于凝膠床的總體積(Vt)、外水體積(V0)(outervolume)以及分離物本身的洗脫體積(Ve)(elutionvolume)：=

Kav的大小依賴于凝膠床的總體積(Vt)113

在限定的層析條件下，Vt、和V0都為恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子質(zhì)量的變化而變化的。分離物分子質(zhì)量大，Kav值?。环粗?，則Kav值增大。

因此，在同一凝膠過濾柱上分離分子質(zhì)量不同的物質(zhì)時，由于流動相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴散效應。若緩沖液連續(xù)注入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴散效應也將連續(xù)發(fā)生，其最終結(jié)果是分子質(zhì)量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子質(zhì)量小的物質(zhì)則后從柱中流出。柱出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子質(zhì)量不同的物質(zhì)相互篩分開了。在限定的層析條件下，Vt、和V0都為恒定114

其篩分效果受操作條件(如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等)的影響是顯而易見的，但更為直接的影響是Kav值的差異性。Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小、乃至等于1或等于零(即使樣品中各組分的分子質(zhì)量相差很大)，則分離效果很差，或根在不能分開。

Kav值既是判斷分離效果的參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的重要依據(jù)。從公式可以看出，只要測出床體積Vt，和外水體積Vo以及洗脫體積Ve即可計算出Kav值。其篩分效果受操作條件(如基質(zhì)的顆粒大小115

凝膠床總體積Vt可用兩種方法：計算法：即根據(jù)層析柱體積計算總體積，可用下列公式：Vt=πR2h在用此公式計算凝膠床總體積時，須精確地分段測量，以防內(nèi)徑不勻造成誤差。另外還須注意到，在層析過程中，尤其是軟膠操作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。凝膠床總體積Vt可用兩種方法：116

測量法：由凝膠床的組成可知，床體積Vt等于外水體積V0、內(nèi)水體積Vi與凝膠顆粒實際占有體積Vg之和。即：

Vt=Vo+Vi+Vg因Vg和Vt相比很小，可忽略不計，故：Vt=V0+Vi。

測量法：117當把分子質(zhì)量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內(nèi)水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者，不能進入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中，凝膠床的洗脫體積Ve認剛好等于外水體積V0。即Ve＝V0（Kav＝0）然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者，能自由進入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積應等于凝膠床總體積，即Ve=Vt=V0+Vi（Kav＝1）。而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限者，則有一部分能進入凝膠網(wǎng)孔，故其洗脫體積Ve是在V0和Vt之間。當把分子質(zhì)量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在118不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù)

型號VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-20030920不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù)

型號VtV0ViG-1020.8119第三節(jié)操作

一、凝膠的選擇和處理1．凝膠的選擇

選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。

第三節(jié)操作

一、凝膠的選擇和處理120（1）型號：不同凝膠篩分范圍各不相相同Sephadex的分離范圍，常用于測定高聚糖或球蛋白。SephadexG型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。如果用于分離核酸時，則限于其空間結(jié)構(gòu)和所帶基團的影響。選用高于它們分子質(zhì)量范圍的型號，或者選用適當型號的生物膠和sephacy1。各種型號凝膠的規(guī)格和性質(zhì)不同。

在除去蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時，可選用凝膠SephadexG-25。當溶液通過G-25柱時．蛋白質(zhì)被排阻住凝膠外面先流出來，而鹽類則擴散到凝膠網(wǎng)孔里后流出來，這樣就便蛋白質(zhì)得到純化，一般來說，在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間分子質(zhì)量差別越大，分離的效果越好。（1）型號：121

（2）粒度：

凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響。一般來說，細粒凝膠柱之間空間小，裝柱易均一，流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。由于細顆粒凝膠流速慢，故宜用大直徑的層析柱，這類凝膠用于小型試驗，可得到滿意結(jié)果。而粗顆粒凝膠流速快．宜用于小直徑的層析柱，如操作得當也可得到較滿意的結(jié)果。（2）粒度：122

凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖

凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖123

在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應在150μm左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm124

對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以最常用的葡聚糖凝膠類為例，分別加以討論。對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式1251．類分離

目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組分。選擇凝膠時，應使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數(shù)Kd=0，小分子的Kd＝1。這樣能取得最好的分離效果。1．類分離目的是分開樣品中分子量懸殊的“126

例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用SephadexG-25凝膠作為分離固定相，因為它的分離范圍是1000～5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達最大值1。對于分子量小于5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用SephadexG-15凝膠。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知1272．分級分離

目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有3個組分的話，最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1／3。2．分級分離目的是分開分子量不很懸殊的128

因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運動所受的約束很小，不易與低分子組分分開。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開。如用SephadexG-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比SephadexG-150為好。但也有人選用G-150，那是因為G-200強度太低不便操作的緣故（見下圖）。因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆129不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖130

2．凝膠用量的計算

根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度，按下面的公式可計算出所需干凝膠的用量：干凝膠用量(g)＝πr2h/（床體積/g）用此法計算出的干凝膠用量還需增加10％—20％，因為凝膠在處理過程中會有一部分損失掉。

2．凝膠用量的計算1313．凝膠的處理干凝膠加入5、10倍的蒸餾水

充分浸泡

去小顆粒

用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液浸泡0.5h

去堿液

蒸餾水洗至中性。

抽氣

除去凝膠中的氣泡的方法加熱煮沸注意點:避免置于酸或堿溶液中加熱。3．凝膠的處理132

二、凝膠柱的制備

1．柱的選擇

同樣直徑的層析柱長層析柱比短的分辨率高；同樣長度的層析柱直徑大的比小的分辨率高；同樣體積的層析柱層析柱長的比短的分辨率高。理想的層析柱直徑與長度之比是1：25-1：100。層析柱最好有夾央套，這樣溫度可以控制，得到的結(jié)果容易重復。二、凝膠柱的制備133

一般選用細長的柱作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。一般選用細長的柱作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高134

2．裝柱

2．裝柱1351）除去氣泡的溶脹凝膠應與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度也要恒定。2）應調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除。3）將柱子固定在穩(wěn)定的支架上，并保證其垂直。4）先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要排除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15％。1）除去氣泡的溶脹凝膠應與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度136

5）柱頂接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注入柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)生氣泡。6）柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑。7）柱內(nèi)膠面上部保留2～3cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來。8）調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速。檢查流體靜壓力，不要超過規(guī)定數(shù)值。如果使用蠕動泵，注意使流速不超過穩(wěn)定后利用重力調(diào)節(jié)所達到的流速，一般要低于后者10％。5）柱頂接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注入柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)137

三、加樣與洗脫1．加樣

加樣量與測定方法和層析柱大小有關(guān)。如測定樣品含量的方法靈敏或床體積小時，加樣量可少，否則反之。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小(樣品濃度高時)，分辨率越高。但是，當用于樣品的制備和脫鹽時、加樣量應在不影響分辨率的前提下增大。究竟加樣體積多少為宜?這要視被分離物在層析柱的分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來決定。假設(shè)，A、B兩個被分離物在層析柱中的洗脫體積分別為Vea、Veb，A、B洗脫體積之差稱為分離體積，以Vs表示。則

Vs=Vea—Veb三、加樣與洗脫1383．凝膠柱的鑒定

新裝的吸附柱用適當?shù)木彌_液平衡后，將帶色的藍色葡聚糖-2000、或者紅色葡聚糖、細胞色素C、血紅蛋白等物質(zhì)配成2mg/ml的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降，如均勻下降，則表明柱中凝膠是均勻的，或者說柱中沒裂縫和氣泡，是可以使用的，否則就須重新裝柱。3．凝膠柱的鑒定139

由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導致粘度增大，而使層析分辨率下降（下圖）。一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后上柱。由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應盡可能大才140樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為5%，相對粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使終濃度為1%.樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2000，使終濃度為5141

2．洗脫

所有的洗脫液均以能溶解被洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。除個別特殊情況外，一般都以單一緩沖液(如磷酸緩沖液、Tis-HCl緩沖液等)或者鹽溶液作為洗脫液，有時甚至也可以用蒸餾水作洗脫液。洗脫時的流速要嚴格控制，否則收集的每一部分洗脫體積就不會恒定，理想的分配系數(shù)就難以測出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵(微量泵)，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。另一種是恒壓重力洗脫。凝膠過濾層析的洗脫流速與操作壓、層析柱體積以及基質(zhì)的性質(zhì)是有密切關(guān)系的。2．洗脫142流速對洗脫曲線的影響

流速對洗脫曲線的影響143

對強度較大的凝膠，如SephadexG-10～50，在相當大的柱壓范圍內(nèi)流速（Ⅴ）與操作壓（F）成正比，與柱長（L）成反比：Ⅴ=KΔP／L

而對于強度差的凝膠，符合以上公式壓力范圍很小。進一步加大壓力時，由于凝膠顆粒變形流速反而降低。

對強度較大的凝膠，如Sepha144各種層析柱裝置的操作壓（或靜水壓）