超高效液相色譜

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱

駝、鹿皮源成分杭寶建;田晨穎;陳曉;邢晟;石峰;冷佳蔚;鞏麗萍【摘要】Amethodwasestablishedfordetectingtheingredientsofhorse,ox,sheep,pig,camelanddeerskinincollacoriiasiniusingultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS).Theoreticalmarkerpeptideswereselectedbycomparingthecollagensequencesintheskinsofdonkeys,horses,oxen,sheep,pigs,camels,anddeer.MarkerpeptideswereidentifiedbyproteasecuttingtechniquesandhighresolutionmassspectrometryandthenanalyzedbyUPLC-MS/MS.TheseparationwasperformedonaUPLCsystemwithaBEHC18columnviathegradientelutionofacetonitrilecontaining0.1%(v/v)aceticacidandwatercontaining0.1%(v/v)aceticacid.Themarkerpeptideswereidentifiedinthemodesofelectrospraypositiveionization(ESI+)andmultiplereactionmonitoring(MRM).Themarkerpeptidesforthehorse,ox,sheep,pigandcamelskinweredetectedin15samples.Themethodissimple,highlyreproducible,andsuitablefortheidentificationofmixedskiningredi-entsincollacoriiasini.Ithasbeensuccessfullyusedtodetecttheauthenticityofcollacoriiasini.%建立了阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分的檢測(cè)方法.通過(guò)比對(duì)驢皮和馬皮、牛皮、豬皮、羊皮、駱駝皮、鹿皮膠原蛋白的序列，采用蛋白酶切技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)理論的各雜皮膠原蛋白特征肽.同時(shí)建立三重四極桿質(zhì)譜篩查方法，以含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫,電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè).15批阿膠樣品檢出了雜皮源成分.該方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，可用于阿膠中雜皮源成分的鑒別，并已成功用于阿膠日常打假監(jiān)督抽驗(yàn)工作.【期刊名稱】《色譜》【年(卷)，期】2018(036)004【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P408-412)【關(guān)鍵詞】超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;特征肽;膠原蛋白;阿膠【作者】杭寶建;田晨穎;陳曉;邢晟;石峰;冷佳蔚;鞏麗萍【作者單位】山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東濟(jì)南250101;山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南250355;山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院仙東濟(jì)南250101;山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院仙東濟(jì)南250101;山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院仙東濟(jì)南250101;山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東濟(jì)南250101;山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東濟(jì)南250101【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】O658阿膠出現(xiàn)于先秦，至漢代已成為常用藥物,具有補(bǔ)血益氣、滋潤(rùn)養(yǎng)顏、提高機(jī)體免疫力等功能，可用于失血貧血、缺鐵貧血、再生障礙貧血及年老體弱、兒童、婦女的滋補(bǔ)［1-4］。近年來(lái)，驢皮資源短缺，阿膠生產(chǎn)企業(yè)為了解決原料緊缺問(wèn)題及降低成本,采用供應(yīng)量大的馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿皮等低值皮進(jìn)行摻假，而現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)牛皮源成分進(jìn)行控制,未控制上述其余雜皮的檢查，因此急需對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升。皮的主要成分膠原蛋白經(jīng)高溫熬制后成為不完全水解的肽段,不同物種的膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶切后可形成物種特異性的多肽［3-5］。本研究參考文獻(xiàn)［6-8］,采用蛋白酶酶切技術(shù)和質(zhì)譜多肽識(shí)別技術(shù)建立了馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿等非驢皮源成分的摻假鑒別方法，可有效控制阿膠摻假現(xiàn)象，提升產(chǎn)品品質(zhì)。表1幾種動(dòng)物特征肽的序列及離子信息Table1SequenceandioninformationofthemarkerpeptidesofseveralkindsofanimalsMarkerpeptideSequencetR/minParention(m/z)Production(m/z)Cone/VCollisionenergy/eVHorseGASGPAGVR2.95386.4377.4*4022322.34021OxGEGGPQGPR1.54427.9668.4*5025329.45026SheepGFPGSDGVAGPK(3hydroxylation)10.08553.0450.9*5221787.55235PigGPTGPAGVR6.29406.5657.6*4525556.64524CamelSGHPGTVGPAGLR9.31407.9416.1*4019570.24016DeerSGETGASGPPGFAGEK(10hydroxylation)9.75732.8875.6*4738962.64737*Quantitativeion.本研究通過(guò)提取阿膠原材料驢皮及摻假馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等雜皮的膠原蛋白,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，將驢皮與摻假皮源進(jìn)行蛋白質(zhì)組比對(duì)，找出各雜皮的理論特征肽，同時(shí)采用高分辨質(zhì)譜結(jié)合蛋白搜庫(kù)技術(shù)對(duì)理論特征肽進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證，根據(jù)確證的雜皮特征肽，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿等非驢皮源成分的摻假鑒別方法，可有效控制阿膠摻假現(xiàn)象，提升產(chǎn)品品質(zhì)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試藥ABSCIEXTripleQuad6500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB公司)；KQ-300GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲器(昆山市超聲儀器有限公司);Vortex-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)Merck公司）、甲酸為色譜純（美國(guó)Fisher公司）,胰蛋白酶為優(yōu)級(jí)純（美國(guó)西格瑪公司）,水為去離子水（Milli-Q純水系統(tǒng)生產(chǎn)）碳酸氫銨為分析純（上海國(guó)藥集團(tuán)）。對(duì)照品:馬皮特征肽、牛皮特征肽、羊皮特征肽、豬皮特征肽、駱駝皮特征肽、鹿皮特征肽對(duì)照品均由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成,純度為98%。樣品:研究用阿膠、馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品為實(shí)驗(yàn)室自制，其余阿膠樣品為日常監(jiān)督抽驗(yàn)樣品，共15批。1.2馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征的序列鑒別本工作參考文獻(xiàn)[9],通過(guò)提取阿膠原材料驢皮及摻假馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等雜皮的膠原蛋白,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，將驢皮與摻假皮源進(jìn)行蛋白質(zhì)組比對(duì),找出各雜皮的理論特征肽，同時(shí)采用高分辨質(zhì)譜結(jié)合蛋白質(zhì)搜庫(kù)技術(shù)對(duì)理論特征肽進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證，序列見表1。1.3色譜、質(zhì)譜條件液相色譜條件:色譜柱為ACQUITYUPLC?BEHC18（100mmx2.1mm,1.7pm）,流速0.3mL/min,流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序:0~3min,4%B;3~8min,4%B~8%B;8-15min,8%B~50%B;15~16min,50%B;16~16.1min,4%B;16.1~25min,4%B;流速:0.3mL/min。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源溫度:550°C。定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量見表1。1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)溶液:取研究用自制阿膠樣品0.1^置于50mL量瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1%的NH4HCO3水溶液（1g固體,加入100mL水溶解）40mL,超聲處理30min,使樣品完全溶解并加1%NH4HCO3水溶液定容至刻度，搖勻，得阿膠基質(zhì)溶液。分別取馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征肽適量，加阿膠基質(zhì)溶液制成各特征肽質(zhì)量濃度為2pg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用阿膠基質(zhì)溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品溶液:取胰蛋白酶適量，加1%NH4HCO3溶液溶解，制成質(zhì)量濃度為1pg/pL的胰蛋白酶溶液。取阿膠樣品0.19置于50mL量瓶中，加1%NH4HCO3溶液40mL,超聲處理30min,使樣品完全溶解并加入上述1%NH4HCO3溶液定容至刻度，過(guò)0.22pm濾膜敞100pL續(xù)濾液至300pL微量進(jìn)樣瓶中，同時(shí)加入上述1pg/pL的胰蛋白酶溶液10pL,搖勻,37°C恒溫酶解12h,即得。表2幾種動(dòng)物特征肽的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table2Linearranges,regressionequations,correlationcoefficients(R2),LODsandLOQsforthemarkerpeptidesofseveralkindsofanimalsMarkerpeptideLinearrange/(mg/L)RegressionequationR2LOD/(ng/kg)LOQ/(ng/kg)Horse0.022.0Y=3.052x107X+1.369x1060.9998933Ox0.022.0Y=9.077x107X+1.808x1060.99721960Sheep0.022.0Y=6.208x108X+2.101x1070.999128Pig0.022.0Y=1.697x107X+3.010x1050.998739120Camel0.022.0Y=2.839x106X+9.242x1040.99901030Deer0.022.0Y=1.742x107X+1.715x1050.999950160Y:peakareaofmarkerpeptide;X:massconcentrationofmarkerpeptide,mg/L.2結(jié)果與討論2.1特征肽的發(fā)現(xiàn)阿膠中的主要成分為驢皮膠原蛋白水解后的多肽。皮類膠原蛋白主要由I型膠原蛋白組成[10],占膠原蛋白總量的80%~85%,I型膠原蛋白又包括I型a1、a2亞型。通過(guò)對(duì)馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿的I型a1、a2膠原蛋白序列進(jìn)行blast多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了膠原蛋白COL1a2之間的差異序列,進(jìn)一步模擬胰蛋白酶酶切膠原蛋白獲得物種相對(duì)的理論特征肽段。如果al特征序列數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有找到特征序列，就在a2中找，如果a2中沒有，則嘗試在其他類型膠原蛋白中找，最終找出理論特征肽，并通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)各特征肽進(jìn)行驗(yàn)證，各特征肽碎片歸屬均與數(shù)據(jù)庫(kù)中信息一致。2.2質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化質(zhì)譜的錐孔電壓、碰撞能對(duì)待測(cè)物的裂解有重要的影響，配制100ng/mL的各特征肽的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化:在電噴霧正離子模式下，通過(guò)蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣方式,確定待測(cè)物母離子;逐漸改變碰撞能量，通過(guò)觀察離子的豐度變化并與高分辨質(zhì)譜碎片歸屬相結(jié)合確定定量離子、定性離子;最終通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),確定碎裂電壓及碰撞能量。2.3專屬性實(shí)驗(yàn)以馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品為陽(yáng)性樣品以自制阿膠樣品為陰性樣品，選擇馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征肽檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定[11,12],結(jié)果見圖1。在這幾種陽(yáng)性樣品中，各特征肽對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間位置上均呈現(xiàn)出各相應(yīng)皮特征肽離子流色譜峰，兩兩間各特征肽互不檢出,說(shuō)明每一特征肽相對(duì)于其他5個(gè)物種是具有特征性的。阿膠樣品的色譜圖中,在與馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品相應(yīng)的位置上均無(wú)相應(yīng)的色譜峰，因此認(rèn)為所選各特征肽具有一定的代表性,且阿膠樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。圖1(a)阿膠和(b)幾種動(dòng)物特征肽對(duì)照品的MRM色譜圖Fig.1MRMchromatogramsof(a)collacoriiasiniand(b)markerpeptidesofseveralkindsofanimals2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)得峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，各特征肽對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明各組分在0.02~2.0mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程、相關(guān)系數(shù)見表2。在阿膠樣品中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液后，以3倍信噪比計(jì)算檢出限以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見表2。2.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品，按1.4節(jié)方法平行制備6份供試品溶液，以監(jiān)測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定，馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠特征肽峰面積的RSD分別為6.8%、6.1%、6.3%、6.9%、6.9%和1.5%。2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取研究用同一樣品，平行制備6份樣品溶液,將6份樣品置于-20°C條件下分別冷凍1天、7天、14天、30天、45天、60天后，融化后室溫進(jìn)樣,以監(jiān)測(cè)離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均可檢出各特征肽，說(shuō)明酶解樣品在冷凍條件下60天內(nèi)均穩(wěn)定。2.7不同工藝對(duì)雜皮膠特征肽檢出的影響由于阿膠生產(chǎn)廠家較多，各廠家之間工藝差別較大，因此實(shí)驗(yàn)?zāi)M了弱（100C水解2h）、中（120C水解2h）、強(qiáng)（125C水解4h）3種程度的熬膠條件，制備出不同制膠工藝下這幾種雜皮膠樣品,以各特征肽離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè)。由表3結(jié)果可見,3種條件下制備的膠類樣品中均可以檢出相應(yīng)特征肽。表3不同工藝對(duì)幾種動(dòng)物特征肽檢出的影響Table3EffectsofdifferentprocessesonthemarkerpeptidesofseveralkindsofanimalsProcessContents/（mg/g）HorseOxSheepPigCamelDeerWeak0.500.310.0330.090.300.37Middle0.530.310.0330.100.300.37Strong0.500.300.0320.090.300.38Weak:hydrolysisfor2hat100C;middle:hydrolysisfor2hat120C;strong:hydrolysisfor2hat125C.2.8樣品測(cè)定以所建立的方法對(duì)15批阿膠樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明,14批樣品檢出馬源性成分,6批樣品檢出牛源性成分,1批樣品檢出羊源性成分,2批樣品檢出豬源性成分,1批樣品檢出駱駝源性成分(見表4)。表4阿膠樣品中雜皮源成分檢測(cè)結(jié)果Table4TestresultsofmiscellaneousskiningredientsincollacoriiasinisamplesSampleNo.Contents/(mg/g)HorseOxSheepPigCamelDeer10.60NDNDNDNDND20.091NDNDNDNDND321.140.003NDNDNDND40.51NDNDNDNDND534.080.0940.1511.65NDND60.13NDNDNDNDND70.50NDNDNDNDND843.840.007NDNDNDND9NDNDNDNDNDND100.16NDNDNDNDND1112.730.003NDNDNDND1236.480.002NDNDND0.151336.310.004ND1.41NDND1435.28NDNDNDNDND150.40NDNDNDNDNDND:notdetected.3結(jié)論本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分的檢測(cè)方法，樣品前處理操作簡(jiǎn)單,方法專屬性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法具有較好的靈敏度、特異性和精密度，能滿足阿膠中雜皮源成分的檢測(cè)要求,15批日常抽檢阿膠樣品不同程度地檢出了摻假成分，因此非常有必要建立阿膠中雜皮源成分的檢測(cè)方法，以提升產(chǎn)品質(zhì)量,為阿膠品質(zhì)的監(jiān)控提供技術(shù)支持。參考文獻(xiàn)：PharmacopoeiaCommissionofthePeople'sRepublicofChina.PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina,Part1.Beijing:ChinaMedicalSciencePress,2015:189國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典,一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:189ZhangGF,LiuT,WangQ,etal.PharmaceuticalBiotechnology,2009,16(3):250張貴鋒，劉濤，王前，等.藥物生物技術(shù),2009,16(3):250HuJY,ChengXL,XiaoXY,etal.ChinesePharmaceuticalAffairs,2007,21(3):193胡軍影,程顯隆,肖新月，等.中國(guó)藥事,2007,21(3):193ZhangGF,LiuT,WangQ,etal.ChinaJournalofChineseMateriaMedica,2009,34(10)