生物催化劑課件

第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現與篩選第三節(jié)國內外酶制劑的工業(yè)概況第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產

第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性1第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念定義：是生物反應過程中起催化作用的游離細胞、游離酶、固定化細胞或固定化酶的總稱。（一）分類：1、按結構形態(tài)：細胞、酶、多細胞生物體2、按形式：游離型催化劑、固定化型催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念2（二）分離純化酶和微生物整細胞體系的優(yōu)缺點生物催化劑存在形式優(yōu)點缺點分離純化酶任意形式設備簡單；產物易分離；由于能忍受較高濃度，產率較高需要進行輔助因子再循環(huán)溶于水酶活性高可能發(fā)生副反應；親油底物不溶；產物分離時需要萃取懸浮于有機溶劑容易操作；產物易分離；親油底物可溶；酶的回收容易酶活性降低固定化酶的回收容易固定化過程中損失酶活性微生物細胞任意形式不需要輔助因子再循環(huán)設備昂貴；產物分離過程冗長；產率低；對有機溶劑忍受力差；可能有副反應生長培養(yǎng)活性高生物量大；副產物多；操作控制困難休止細胞產物分離較容易；副產物較少活性較低固定化細胞細胞可再利用活性較低（二）分離純化酶和微生物整細胞體系的優(yōu)缺點生物催化劑存在形式3酶催化劑（酶反應過程）活細胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時，用于單一反應；多酶系統(tǒng)時，可用于若干串聯反應系列的串聯反應，產物可以是簡單以及復雜的代謝產物來源和價格從細胞中提取，技術較為困難，除若干商品酶制劑外，價格昂貴發(fā)酵開始時，接入少量種子液，價格低廉穩(wěn)定性較差，只有高穩(wěn)定性的或經穩(wěn)定性修飾的，才能工業(yè)應用略高，但須不斷保持其穩(wěn)定性輔酶再生在需要進行輔酶再生的反應中，技術和經濟問題難以解決在新陳代謝過程中自行解決原料要求簡單，但要求較高純度的化合物作底物可用粗原料，但要考慮菌體生長和產物形成的必要成分作培養(yǎng)基反應時間短，數分鐘至數小時長，一天左右至一周以上反應器體積較小，但較復雜，體積較大，但較簡單過程控制簡單復雜，過程常分菌體生長和產物形成兩個階段；物料成分性質復雜，反應途徑易于失控。產品分離簡單復雜，反應終了時產物含量低，副產物較多，且含有菌體工業(yè)應用較少，目前用于工業(yè)生產的不超過10種較多，常見的有數十種酶催化劑（酶反應過程）活細胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時4二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現在微生物的多樣性。土壤、水域、動植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現在微生5第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選對于一個特定的生物轉化過程，生物催化劑的篩選和制備是非常重要的一個環(huán)節(jié)，因為其活性、選擇性和穩(wěn)定性的高低將直接影響生物催化過程的效率，也是關系將來能否實現大規(guī)模產業(yè)化應用的關鍵因素之一。要獲得一個具有潛在工業(yè)化應用前景的優(yōu)良生物催化劑，往往要經過微生物菌種的自然分離、誘變育種或定向改造，酶的發(fā)酵、提取和純化，以及酶或細胞的固定化等一系列環(huán)節(jié)。有時還要采用基因克隆、蛋白質工程和定向進化等分子生物學方法進一步提高菌種的產酶水平或者改變酶的催化性能。

第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選對于一個特定的生物轉化過程，生6第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選一方面，我們設計一個新的酶促反應過程時，必須找到一個適合這個反應的酶，另一方面，新酶的發(fā)現也為設計新的酶促過程提供新的思路。發(fā)現新酶最有效和成功的方法之一，就是從微生物生活的自然界篩選獲得一定數量的微生物菌種。第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選一方面，我們設計一個新的酶促7微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現的一般過程：（一）設計反應過程（二）選擇合適的酶或產酶微生物（三）建立有效且方便的分析方法。微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現的一般過程：8（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計在設計目標化合物合成的酶促反應過程中，選擇合適的反應底物、合適的反應途徑以及目標化合物的性質都非常重要。（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計9（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

酰胺烷基化D-脫酰胺酶D-海因酶自發(fā)消旋化

5-單取代海因

（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

酰胺烷基化D-脫酰胺酶10（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

產生多種副產物Rhodococcusrhodochrous（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

產生多種副產物Rhod11微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產酶微生物1、途徑和方法（1）從國內外市售的商品酶和菌種保藏機構保藏的相關微生物中發(fā)現目標催化劑；（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現新的非天然催化活力；（4）利用新的反應條件、改變反應介質或尋找新的影響因子；（5）采用基因工程、蛋白質工程等技術獲取新的催化劑。微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產酶微生物12（二）酶或產酶微生物的篩選一般產酶微生物篩選的原則1、能夠通過發(fā)酵在相對較短的時間內高產目標酶2、微生物應該盡可能地利用便宜和方便的原料生產酶3、微生物所產生的酶最好有比較高的專一性4、所采用的微生物應該是不產生有害物質的非致病性的安全微生物5、微生物的遺傳穩(wěn)定性應該比較高（二）酶或產酶微生物的篩選一般產酶微生物篩選的原則131、途徑和方法（1）從國內外市售的商品酶和菌種保藏機構保藏的相關微生物中發(fā)現目標催化劑；只能提供少數幾個有限的催化劑來源

世界主要酶制劑公司公司名國家公司名國家Amano日本NovoNordisk丹麥Genecor美國Sigma美國1、途徑和方法（1）從國內外市售的商品酶和菌種保藏機構保藏的14丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和生化制品集團公司，成立于1923年，憑借自身的研發(fā)實力成為世界糖尿病治療領域先導，在行業(yè)內擁有為廣泛的糖尿病治療產品，生產的胰島素和酶制劑分別占世界市場份額的50%和40%以上。

丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和15我國主要菌種保藏單位及其隸屬機構保藏單位（縮寫）保藏單位名稱隸屬機構ACCC(AgriculturalCultureCollectionofChina)

中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所CFCC(ChinaForestryCultureCollectionCenter)中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國林業(yè)科學院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所CGMCC

中國普通微生物菌種保藏管理中心中國科學院微生物研究所CICC(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所CMCC中國醫(yī)學細菌保藏管理中心中國藥品生物制品檢定所、中國醫(yī)學科學院南京皮膚病研究所、中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所CPCC中國藥用微生物菌種保藏管理中心中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所、四川抗生素工業(yè)研究所、華北制藥廠抗生素研究所CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國獸藥監(jiān)察所我國主要菌種保藏單位及其隸屬機構保藏單位（縮寫）保藏單位名稱16著名的國際菌種保藏機構菌種保藏機構網站美國典型菌種保藏中心：ATCC(AmericanTypeCultureCollection）德國微生物和細胞收藏中心DSMhttp://www.dsmz.de/dsmzhome.htmNRRL(ARS)美國農業(yè)服務菌種中心CBS荷蘭菌種收藏中心著名的國際菌種保藏機構菌種保藏機構網站美國典型菌種保藏中心：17（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現新的非天然催化活力；（4）利用新的反應條件、改變反應介質或尋找新的影響因子；（5）采用基因工程、蛋白質工程等技術獲取新的催化劑。（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催18（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有效方法；目標底物是最好的篩選因素；（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有19第三節(jié)：國內外酶制劑工業(yè)概況一．國內外酶制劑生產和應用現狀二．國內外酶制劑生產應用差異三．我國酶制劑工業(yè)的若干對策建議第三節(jié)：國內外酶制劑工業(yè)概況一．國內外酶制劑生產和應用現狀20一．國內外酶制劑生產和應用現狀1世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%一．國內外酶制劑生產和應用現狀1世界三大酶制劑公司212、國際市場酶制劑銷售額比例

2001年工業(yè)酶制劑的世界市場約為15億美元用于制藥工業(yè)與精細化學工業(yè)約1.2億~1.5億美元2、國際市場酶制劑銷售額比例223、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶21979糖化酶3堿性蛋白酶4中性蛋白酶51993耐高溫淀粉酶61998國外大公司紛紛入駐1999年投產3、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶23國內酶制劑銷售額比例國內酶制劑銷售額比例24二．國內外酶制劑生產應用差異1．規(guī)模：國外多公司重組國內重復建設、效益低2投入：國外：開發(fā)經費高達15%，甚至19%銷售額國內：研究、開發(fā)投入不足，占1%銷售額3開發(fā)重點國外：大力研制、開發(fā)新酶種和新用途國內：品種少、劑型少二．國內外酶制劑生產應用差異1．規(guī)模：國外多公司重組25三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應，有利于選擇性生物催化反應的專一性；穩(wěn)定性好，包括操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定型批次之間的實驗重復性好能夠反復實驗。三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應，有利于選擇性生26四、商品酶的劑型液體酶制劑固體粗酶制劑純酶制劑固定化酶制劑四、商品酶的劑型液體酶制劑27第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產一、微生物產酶菌種二、產酶培養(yǎng)基三、種子培養(yǎng)與發(fā)酵產酶四、微生物生長與發(fā)酵產酶動力學五、發(fā)酵條件對產酶的影響第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產一、微生物產酶菌種28一.常用的產酶微生物Escherichia

coli

PseudomonasBacillussubtilis

StreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaePenicilliumTrichodermaRhizopusMucorSaccharomycescerevisiaeCandida第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產一.常用的產酶微生物Escherichiacoli29Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；?、半乳糖苷酶Bacillussubtilis：α-淀粉酶、中性蛋白酶Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、30二、產酶微生物優(yōu)良菌種選育1.自然育種：未經人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育。

2.誘變育種：利用誘變劑處理微生物細胞，提高基因突變頻率，再通過適當的篩選方法獲得所需的高產優(yōu)質菌種的育種方法。

(1)使誘導型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株

培養(yǎng)基中添加誘導酶抑制劑，使組成型菌株被富集。

β-半乳糖苷酶的抑制劑鄰硝基-β-D-巖藻糖苷交替培養(yǎng)法：乳糖培養(yǎng)基葡萄糖培養(yǎng)基乳糖培養(yǎng)基顯色反應：不含誘導物的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種后，β-半乳糖苷酶酶解鄰硝基苯半乳糖苷

二、產酶微生物優(yōu)良菌種選育31(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜虯.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：解除反饋阻遏(降低末端產物濃度）B.選育結構類似物抗性突變

(代謝失調，抗反饋阻遏突變株)(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?2A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代謝產物；利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產物

A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代33在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進行鳥氨酸發(fā)酵

L-Glu乙酰谷氨酸激酶L-鳥氨酸轉氨甲酰酶瓜氨酸精氨酸？由于合成途徑中酶6(轉氨甲酰酶)的缺陷，必須供應精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生長，但是這種供應要維持在亞適量水平，使菌體達到最高生長，又不引起終產物對酶②(N—乙酰谷氨酸激酶)的反饋抑制，從而使鳥氨酸得以大量分泌累積。在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進34L-谷氨酸脫氫酶

谷氨酰胺合成酶

酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產物L-谷氨酸谷氨酰胺酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝35選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（添加脯氨酸）中生長，基礎培養(yǎng)基中不長的為缺陷型。

選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（36選育結構類似物抗性突變：篩選抗反饋阻遏和反饋抑制突變株。這種突變屬于代謝失調，即在細胞中已有大量的末端產物，仍不斷合成這一代謝產物。例子：L-精氨酸的生產篩選培養(yǎng)基(g/L):基本培養(yǎng)基添加少量D-Arg和脯氨酸。篩選營養(yǎng)缺陷型和結構類似物抗性突變株可結合使用。選育結構類似物抗性突變：篩選抗反饋阻遏和反饋抑制突變株。這種37

三、產酶動力學

（一）酶生物合成的模式

根據酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分為四種模式，即：同步合成型生長偶聯型——中期合成型部分生長偶聯型——延續(xù)合成型非生長偶聯型——滯后合成型三、產酶動力學381.生長偶聯型（又稱同步合成型）

酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導，但不受分解代謝物阻遏和反應產物阻遏。如利用米根霉生產脂肪酶。

當去除誘導物、細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應的mRNA很不穩(wěn)定。1.生長偶聯型（又稱同步合成型）392、生長偶聯型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。所對應的mRNA是不穩(wěn)定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲403.部分生長偶聯型（又稱延續(xù)合成型）

酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導，一般不受分解代謝物和產物阻遏。所對應的mRNA相當穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線3.部分生長偶聯型（又稱延續(xù)合成型）黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成414.非生長偶聯型（又稱滯后合成型）

只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。所對應的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

4.非生長偶聯型（又稱滯后合成型）黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線42總結：影響酶生物合成模式的主要因素高：可在細胞停止生長后繼

1）mRNA的穩(wěn)定性續(xù)合成酶差：隨著細胞停止生長而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細胞的生長而開始酶的合成。受阻遏：細胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始合成?？偨Y：影響酶生物合成模式的主要因素43

酶生產中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。對于：同步合成型：提高對應的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。酶生產中最理想的合成模式：44第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現與篩選第三節(jié)國內外酶制劑的工業(yè)概況第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產

第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性45第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念定義：是生物反應過程中起催化作用的游離細胞、游離酶、固定化細胞或固定化酶的總稱。（一）分類：1、按結構形態(tài)：細胞、酶、多細胞生物體2、按形式：游離型催化劑、固定化型催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念46（二）分離純化酶和微生物整細胞體系的優(yōu)缺點生物催化劑存在形式優(yōu)點缺點分離純化酶任意形式設備簡單；產物易分離；由于能忍受較高濃度，產率較高需要進行輔助因子再循環(huán)溶于水酶活性高可能發(fā)生副反應；親油底物不溶；產物分離時需要萃取懸浮于有機溶劑容易操作；產物易分離；親油底物可溶；酶的回收容易酶活性降低固定化酶的回收容易固定化過程中損失酶活性微生物細胞任意形式不需要輔助因子再循環(huán)設備昂貴；產物分離過程冗長；產率低；對有機溶劑忍受力差；可能有副反應生長培養(yǎng)活性高生物量大；副產物多；操作控制困難休止細胞產物分離較容易；副產物較少活性較低固定化細胞細胞可再利用活性較低（二）分離純化酶和微生物整細胞體系的優(yōu)缺點生物催化劑存在形式47酶催化劑（酶反應過程）活細胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時，用于單一反應；多酶系統(tǒng)時，可用于若干串聯反應系列的串聯反應，產物可以是簡單以及復雜的代謝產物來源和價格從細胞中提取，技術較為困難，除若干商品酶制劑外，價格昂貴發(fā)酵開始時，接入少量種子液，價格低廉穩(wěn)定性較差，只有高穩(wěn)定性的或經穩(wěn)定性修飾的，才能工業(yè)應用略高，但須不斷保持其穩(wěn)定性輔酶再生在需要進行輔酶再生的反應中，技術和經濟問題難以解決在新陳代謝過程中自行解決原料要求簡單，但要求較高純度的化合物作底物可用粗原料，但要考慮菌體生長和產物形成的必要成分作培養(yǎng)基反應時間短，數分鐘至數小時長，一天左右至一周以上反應器體積較小，但較復雜，體積較大，但較簡單過程控制簡單復雜，過程常分菌體生長和產物形成兩個階段；物料成分性質復雜，反應途徑易于失控。產品分離簡單復雜，反應終了時產物含量低，副產物較多，且含有菌體工業(yè)應用較少，目前用于工業(yè)生產的不超過10種較多，常見的有數十種酶催化劑（酶反應過程）活細胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時48二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現在微生物的多樣性。土壤、水域、動植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現在微生49第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選對于一個特定的生物轉化過程，生物催化劑的篩選和制備是非常重要的一個環(huán)節(jié)，因為其活性、選擇性和穩(wěn)定性的高低將直接影響生物催化過程的效率，也是關系將來能否實現大規(guī)模產業(yè)化應用的關鍵因素之一。要獲得一個具有潛在工業(yè)化應用前景的優(yōu)良生物催化劑，往往要經過微生物菌種的自然分離、誘變育種或定向改造，酶的發(fā)酵、提取和純化，以及酶或細胞的固定化等一系列環(huán)節(jié)。有時還要采用基因克隆、蛋白質工程和定向進化等分子生物學方法進一步提高菌種的產酶水平或者改變酶的催化性能。

第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選對于一個特定的生物轉化過程，生50第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選一方面，我們設計一個新的酶促反應過程時，必須找到一個適合這個反應的酶，另一方面，新酶的發(fā)現也為設計新的酶促過程提供新的思路。發(fā)現新酶最有效和成功的方法之一，就是從微生物生活的自然界篩選獲得一定數量的微生物菌種。第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現和篩選一方面，我們設計一個新的酶促51微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現的一般過程：（一）設計反應過程（二）選擇合適的酶或產酶微生物（三）建立有效且方便的分析方法。微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現的一般過程：52（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計在設計目標化合物合成的酶促反應過程中，選擇合適的反應底物、合適的反應途徑以及目標化合物的性質都非常重要。（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計53（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

酰胺烷基化D-脫酰胺酶D-海因酶自發(fā)消旋化

5-單取代海因

（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

酰胺烷基化D-脫酰胺酶54（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

產生多種副產物Rhodococcusrhodochrous（一）生物催化劑篩選中的反應過程設計

產生多種副產物Rhod55微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產酶微生物1、途徑和方法（1）從國內外市售的商品酶和菌種保藏機構保藏的相關微生物中發(fā)現目標催化劑；（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現新的非天然催化活力；（4）利用新的反應條件、改變反應介質或尋找新的影響因子；（5）采用基因工程、蛋白質工程等技術獲取新的催化劑。微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產酶微生物56（二）酶或產酶微生物的篩選一般產酶微生物篩選的原則1、能夠通過發(fā)酵在相對較短的時間內高產目標酶2、微生物應該盡可能地利用便宜和方便的原料生產酶3、微生物所產生的酶最好有比較高的專一性4、所采用的微生物應該是不產生有害物質的非致病性的安全微生物5、微生物的遺傳穩(wěn)定性應該比較高（二）酶或產酶微生物的篩選一般產酶微生物篩選的原則571、途徑和方法（1）從國內外市售的商品酶和菌種保藏機構保藏的相關微生物中發(fā)現目標催化劑；只能提供少數幾個有限的催化劑來源

世界主要酶制劑公司公司名國家公司名國家Amano日本NovoNordisk丹麥Genecor美國Sigma美國1、途徑和方法（1）從國內外市售的商品酶和菌種保藏機構保藏的58丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和生化制品集團公司，成立于1923年，憑借自身的研發(fā)實力成為世界糖尿病治療領域先導，在行業(yè)內擁有為廣泛的糖尿病治療產品，生產的胰島素和酶制劑分別占世界市場份額的50%和40%以上。

丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和59我國主要菌種保藏單位及其隸屬機構保藏單位（縮寫）保藏單位名稱隸屬機構ACCC(AgriculturalCultureCollectionofChina)

中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所CFCC(ChinaForestryCultureCollectionCenter)中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國林業(yè)科學院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所CGMCC

中國普通微生物菌種保藏管理中心中國科學院微生物研究所CICC(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所CMCC中國醫(yī)學細菌保藏管理中心中國藥品生物制品檢定所、中國醫(yī)學科學院南京皮膚病研究所、中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所CPCC中國藥用微生物菌種保藏管理中心中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所、四川抗生素工業(yè)研究所、華北制藥廠抗生素研究所CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國獸藥監(jiān)察所我國主要菌種保藏單位及其隸屬機構保藏單位（縮寫）保藏單位名稱60著名的國際菌種保藏機構菌種保藏機構網站美國典型菌種保藏中心：ATCC(AmericanTypeCultureCollection）德國微生物和細胞收藏中心DSMhttp://www.dsmz.de/dsmzhome.htmNRRL(ARS)美國農業(yè)服務菌種中心CBS荷蘭菌種收藏中心著名的國際菌種保藏機構菌種保藏機構網站美國典型菌種保藏中心：61（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現新的非天然催化活力；（4）利用新的反應條件、改變反應介質或尋找新的影響因子；（5）采用基因工程、蛋白質工程等技術獲取新的催化劑。（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催62（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有效方法；目標底物是最好的篩選因素；（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有63第三節(jié)：國內外酶制劑工業(yè)概況一．國內外酶制劑生產和應用現狀二．國內外酶制劑生產應用差異三．我國酶制劑工業(yè)的若干對策建議第三節(jié)：國內外酶制劑工業(yè)概況一．國內外酶制劑生產和應用現狀64一．國內外酶制劑生產和應用現狀1世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%一．國內外酶制劑生產和應用現狀1世界三大酶制劑公司652、國際市場酶制劑銷售額比例

2001年工業(yè)酶制劑的世界市場約為15億美元用于制藥工業(yè)與精細化學工業(yè)約1.2億~1.5億美元2、國際市場酶制劑銷售額比例663、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶21979糖化酶3堿性蛋白酶4中性蛋白酶51993耐高溫淀粉酶61998國外大公司紛紛入駐1999年投產3、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶67國內酶制劑銷售額比例國內酶制劑銷售額比例68二．國內外酶制劑生產應用差異1．規(guī)模：國外多公司重組國內重復建設、效益低2投入：國外：開發(fā)經費高達15%，甚至19%銷售額國內：研究、開發(fā)投入不足，占1%銷售額3開發(fā)重點國外：大力研制、開發(fā)新酶種和新用途國內：品種少、劑型少二．國內外酶制劑生產應用差異1．規(guī)模：國外多公司重組69三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應，有利于選擇性生物催化反應的專一性；穩(wěn)定性好，包括操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定型批次之間的實驗重復性好能夠反復實驗。三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應，有利于選擇性生70四、商品酶的劑型液體酶制劑固體粗酶制劑純酶制劑固定化酶制劑四、商品酶的劑型液體酶制劑71第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產一、微生物產酶菌種二、產酶培養(yǎng)基三、種子培養(yǎng)與發(fā)酵產酶四、微生物生長與發(fā)酵產酶動力學五、發(fā)酵條件對產酶的影響第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產一、微生物產酶菌種72一.常用的產酶微生物Escherichia

coli

PseudomonasBacillussubtilis

StreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaePenicilliumTrichodermaRhizopusMucorSaccharomycescerevisiaeCandida第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產一.常用的產酶微生物Escherichiacoli73Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；?、半乳糖苷酶Bacillussubtilis：α-淀粉酶、中性蛋白酶Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、74二、產酶微生物優(yōu)良菌種選育1.自然育種：未經人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育。

2.誘變育種：利用誘變劑處理微生物細胞，提高基因突變頻率，再通過適當的篩選方法獲得所需的高產優(yōu)質菌種的育種方法。

(1)使誘導型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株

培養(yǎng)基中添加誘導酶抑制劑，使組成型菌株被富集。

β-半乳糖苷酶的抑制劑鄰硝基-β-D-巖藻糖苷交替培養(yǎng)法：乳糖培養(yǎng)基葡萄糖培養(yǎng)基乳糖培養(yǎng)基顯色反應：不含誘導物的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種后，β-半乳糖苷酶酶解鄰硝基苯半乳糖苷

二、產酶微生物優(yōu)良菌種選育75(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜虯.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：解除反饋阻遏(降低末端產物濃度）B.選育結構類似物抗性突變

(代謝失調，抗反饋阻遏突變株)(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?6A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代謝產物；利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產物

A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代77在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進行鳥氨酸發(fā)酵

L-Glu乙酰谷氨酸激酶L-鳥氨酸轉氨甲酰酶瓜氨酸精氨酸？由于合成途徑中酶6(轉氨甲酰酶)的缺陷，必須供應精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生長，但是這種供應要維持在亞適量水平，使菌體達到最高生長，又不引起終產物對酶②(N—乙酰谷氨酸激酶)的反饋抑制，從而使鳥氨酸得以大量分泌累積。在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進78L-谷氨酸脫氫酶

谷氨酰胺合成酶

酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產物L-谷氨酸谷氨酰胺酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝79選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（添加脯氨酸）中生長，基礎培養(yǎng)基中不長的為缺陷型。

選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（80選育結構類似物抗性突變：篩選抗反饋阻遏和反饋抑制突變株。這種突變屬于代謝失調，即在細胞中已有大量的末端產物，仍不斷合成這一代謝產物。例子：L-精氨酸的生產篩選培養(yǎng)基(g/L):基本培養(yǎng)基添加少量D-Arg和脯氨酸。