2012―2013年河南地區(qū)PRRSV的多樣性分析,畜牧獸醫(yī)論文

2012―2013年河南地區(qū)PRRSV的多樣性分析,畜牧獸醫(yī)論文豬繁衍與呼吸綜合征是由豬繁衍與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyn-dromevirus,PRRSV)引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等,仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道疾病為特征的傳染病。PRRSV是動(dòng)脈炎病毒屬(ar-terivirus)的成員,為單股正鏈RNA,約為15kb,共9個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),分別編碼2個(gè)非構(gòu)造蛋白和7個(gè)構(gòu)造蛋白?；蜃儺惙植加谡麄€(gè)基因組,尤其是NSP2和ORF5基因變異最大,經(jīng)常作為病毒遺傳變異和進(jìn)化分析的靶基因。當(dāng)前PRRSV主要包括以VR2332毒株為代表的美洲型和以Lelystadvirus(LV)為代表的歐洲型2種基因型,我們國(guó)家大陸流行的病毒株主要為美洲型PRRSV。該病于1987年初次在美國(guó)發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已呈世界性分布。我們國(guó)家于1996年初次報(bào)道該病毒存在,隨后流行于全國(guó)。自2006年夏秋季我們國(guó)家多個(gè)省份豬群爆發(fā)以高熱、厭食、呼吸困難、高發(fā)病率和高病死率等為特征的豬高熱綜合征以來(lái),陸續(xù)有文獻(xiàn)證實(shí)該病是由PRRSV變異毒株NSP2缺失30個(gè)氨基酸的高致病性豬繁衍與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)引起的。本研究主要對(duì)2020―2020年采自河南各地的54份PRRSV疑似病料進(jìn)行核酸檢測(cè)及PRRSV分離,并對(duì)陽(yáng)性樣品的NSP2和GP5基因進(jìn)行序列擴(kuò)增與分析,研究河南地區(qū)PRRSV流行株NSP2和GP5基因變異情況和發(fā)展趨勢(shì),了解河南地區(qū)PRRSV的多樣性,為河南地區(qū)PRRS的防制提供參考根據(jù)。1材料與方式方法1.1病料采集采集河南省鄭州、洛陽(yáng)、鶴壁、新鄉(xiāng)、焦作、濟(jì)源等地共54份疑似PRRSV陽(yáng)性病豬的脾臟、肺臟、淋逢迎等臟器。1.2主要試劑TaqDNA聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑(RnaseInhibitor)、dNTP、pMD18-T載體均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司,TrizolReagent購(gòu)自Invitrogen公司,DEPC購(gòu)自Amresco公司,瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司,Marc-145細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存,胎牛血清購(gòu)自北京四季青公司。1.3引物設(shè)計(jì)參考PRRSVCH-1a株(GenBank登錄號(hào)AF132118)和JXA1株(GenBank登錄號(hào)EF112445)全基因序列應(yīng)用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)針對(duì)GP5基因和NSP2高變區(qū)的特異性引物(表1),引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成?！颈?】1.4病毒的分離與鑒定將采集的陽(yáng)性病料經(jīng)研磨、離心、過(guò)濾,接種于Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)3~5d,天天觀察有無(wú)細(xì)胞病變(CPE)產(chǎn)生。將有病變的毒株傳3~4代后用特異性PRRSVORF5引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),同時(shí)利用PRRSVCH-1a株的GP5特異性單抗通過(guò)間接免疫熒光方式方法進(jìn)行鑒定。將未出現(xiàn)CPE者,經(jīng)凍融3次后盲傳3~5代,有病變者按上述方式方法鑒定。1.5RNA的提取取病豬肺臟、脾臟、淋逢迎等組織樣本,用PBS進(jìn)行稀釋后研磨,凍融3次,8000r/min離心10min后,取上清參照Trizolreagent講明書(shū)進(jìn)行操作,所提取基因組RNA用30L1DEPC水溶解,-70℃保存?zhèn)溆谩?.6PRRSVNSP2基因和GP5基因的RT-PCR擴(kuò)增提取上述部分陽(yáng)性樣品中的總RNA,首先以20L體系反轉(zhuǎn)錄:RNA模板13L,5Buffer4L,dNTP(10mol/mL)1L,隨機(jī)引物1L(20mol/L),RNA酶抑制劑(40U/L)0.5L,反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200U/L)0.5L。反響條件:42℃1h,95℃5min,得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。PCR按50L反應(yīng)體系:10Buffer5L,MgCl2(25mol/mL)5L,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)5L,dNTP(10mol/mL)1L,TaqDNA聚合酶0.5L,上下游引物各1L,補(bǔ)加滅菌雙蒸水至50L。反響循環(huán)參數(shù):95℃5min;95℃1min,56℃1min,72℃1.5min,共32個(gè)循環(huán);最后72℃10min。反響產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。1.7PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序分別將上述NSP2基因和ORF5基因擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后克隆入pMD18-T載體,取PCR和酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送北京華大基因公司測(cè)序,每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)序2次。1.8NSP2基因和ORF5基因的序列分析利用DNAStar中的MegAlign對(duì)17株P(guān)RRSV河南毒株及參考毒株(表2)的NSP2基因和ORF5基因進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析,利用MEGA4.0中的鄰接法(neighbor-joining;bootstrapvaluesof1000repli-cates)對(duì)NSP2基因和ORF5基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析?！颈?略】2結(jié)果2.1病毒分離將處理好的病料接種于鋪滿單層的Marc-145上,2~3d可見(jiàn)病變細(xì)胞發(fā)生堆積現(xiàn)象(圖1)。將該毒連續(xù)傳3~4代,通過(guò)RT-PCR可擴(kuò)增出PRRSV的ORF5基因;利用PRRSVGP5單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),能夠在感染的細(xì)胞胞漿內(nèi)觀察到特異性熒光。結(jié)果在17份陽(yáng)性病料分離到3株P(guān)RRSV,分別命名為HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3。2.2RT-PCR檢測(cè)PRRSV結(jié)果對(duì)20202020年采自河南各地的54份PRRSV疑似病料進(jìn)行PRRSVRT-PCR檢測(cè),結(jié)果檢出PRRSV陽(yáng)性樣品17份,陽(yáng)性率為31.5%。2.3NSP2基因和ORF5基因序列的擴(kuò)增和測(cè)定對(duì)17份陽(yáng)性樣本分別提取RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pMDl8-T載體,挑選陽(yáng)性重組質(zhì)粒并測(cè)序,NSP2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1124~1513bp,ORF5擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為864bp?；蛐蛄芯浫隚enBank數(shù)據(jù)庫(kù)(表2)。2.4NSP2基因的核苷酸序列分析測(cè)序結(jié)果顯示:同國(guó)內(nèi)外相關(guān)毒株比擬,17株毒株之間NSP2序列類似性為62.3%~98.9%,與美洲型毒株BJ-4、JXA1等的NSP2序列類似性為61.9%~99.5%,與歐洲毒株Lelystadvirus的NSP2序列類似性為41.7%~45.0%,表示清楚這些毒株均屬于美洲型。華而不實(shí)NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株與HP-PRRSV中國(guó)毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,序列類似度為95.5%~99.2%,且HENAU-QBS-6株在451~452和520~521之間分別插入了2個(gè)和1個(gè)堿基,剩余9株除個(gè)別堿基發(fā)生替換外,NSP2缺失情況一致,均有2個(gè)部位出現(xiàn)缺失,分別有編碼1個(gè)氨基酸的3個(gè)核苷酸的缺失和編碼27個(gè)氨基酸的連續(xù)87個(gè)核苷酸缺失;HENAU-QBS-4、HENAN-XINX-3株與VR2332、S1等經(jīng)典毒株高度同源,序列類似度為98.6%~99.5%,僅在個(gè)別堿基上發(fā)生了替換;HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-HEB、HENAN-JIAOZ株與國(guó)外NADC30、MN184C等毒株高度類似,序列類似度為79.3%~95.2%,與高致病性及經(jīng)典PRRSV均相差較遠(yuǎn),序列相似度分別為63.7%~74.5%和67.0%~69.1%。缺失部位和數(shù)量也有所不同,即在975~1307、1452~1454、1515~1571位共缺失393個(gè)核苷酸。這是在2006年美國(guó)出現(xiàn)NSP2基因缺失393個(gè)核苷酸以來(lái),國(guó)內(nèi)初次出現(xiàn)核苷酸缺失數(shù)量如此之多的毒株。2.5NSP2基因的氨基酸同源性分析17株P(guān)RRSV之間的氨基酸同源性為59.7%~98.7%。其中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株與HP-PRRSV中國(guó)毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,氨基酸類似度為88%~99.2%;HENAU-QBS-4、HENAN-XINX-3株與經(jīng)典PRRSVVR2332、S1毒株氨基酸相似度為97.8%~99.2%;而HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株與經(jīng)典PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株差異均較大,與國(guó)外毒株NADC30等同源性較高,類似度為81.3%~91.4%,且5毒株的氨基酸缺失部位和數(shù)量與以往的HP-PRRSV或其他變異毒株以及經(jīng)典毒株都有很大不同,在323~433、482、501~519位共缺失131個(gè)氨基酸。這種缺失在美國(guó)(2006年)和韓國(guó)(2020年)相繼發(fā)現(xiàn),但在國(guó)內(nèi)尚屬初次。2.6基于NSP2部分序列的PRRSV遺傳進(jìn)化分析基于NSP2部分序列的PRRSV遺傳進(jìn)化分析顯示,美洲型PRRSV能夠分為3個(gè)亞群(圖2),即以HP-PRRSVJXA1、HuN4等為代表的亞群1,以經(jīng)典毒S1、VR2332為代表的亞群2,以及以NADC30、MN184C等為代表的亞群3。而17株河南地區(qū)PRRSV毒株中有10株(NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF)屬于亞群1,2株(HENAU-QBS-4、HENAN-XINX-3)屬于亞群2,另外5株(HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-HEB、HENAN-JIAOZ)則屬于亞群3。由此可見(jiàn),近兩年河南省流行的PRRSV仍以NSP2存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失為特點(diǎn)的HP-PRRSV為主,在有經(jīng)典毒株存在的同時(shí)又不斷有新的變異毒株出現(xiàn)。2.7ORF5基因的核苷酸序列分析基于ORF5基因的核苷酸序列分析顯示,17株P(guān)RRSV河南毒株之間ORF5基因序列類似性為84.4%~99.5%,同VR2332、JXA1等美洲型參考毒株的ORF5基因序列類似性為82.8%~99.5%,同歐洲型參考毒株Lelystadvirus的ORF5基因序列類似性為62.1%~64.6%。其中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株與HP-PRRSV中國(guó)毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,序列類似度為94.5%~99.5%;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株與經(jīng)典毒株VR2332、S1高度同源,相似度為98.8%~99.5%;HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB、HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2與國(guó)外毒株MN184c,NADC30等高度同源,序列類似度為89.6%~95.0%。17株毒株除有數(shù)量不等堿基替換外,未出現(xiàn)堿基的插入和缺失。2.8ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸同源性分析17株P(guān)RRSV之間的氨基酸同源性為84.1%~99.5%。其中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株與HP-PRRSV中國(guó)毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,氨基酸相似度為94.5%~99.5%;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株與PRRSV經(jīng)典毒株BJ-4、VR2332、S1等氨基酸類似度為97.5%~99.5%。而HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株與經(jīng)典PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株差異均較大,與國(guó)外毒株NADC30、MN184c等同源性較高,類似度為89.6%~99.0%,表示清楚國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了新的變異毒株。2.9ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)分析利用DNAStar等軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),17株河南PRRSV毒株的GP5蛋白存在多處氨基酸突變,高變區(qū)主要集中在糖基化位點(diǎn)區(qū)域和中和表位(37~44位氨基酸)及誘騙表位(27~30位氨基酸)。美洲型PRRSVGP5蛋白糖基化位點(diǎn)一般為3~5個(gè),根據(jù)N-糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果,糖基化位點(diǎn)在數(shù)目上,經(jīng)典毒株4個(gè),高致病性毒株為4~5個(gè),新變異毒株為3~5個(gè)。在中和表位和誘騙表位中,HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOY、HENAN-LUOH、HENAN-KAIF、HENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6株與HP-PRRSV一致,L39突變?yōu)镮39;HENAN-JIAO-Z、NENAN-JIY、HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6株與中國(guó)的一些經(jīng)典毒株和全部的HP-PRRSV一樣,發(fā)生了A29V的突變。在PRRSVGP5的毒力相關(guān)位點(diǎn)(第13位和第151位氨基酸)處,與經(jīng)典毒株高度同源的HENAN-XINX-3、HENAUQ-BS-4株及出現(xiàn)的新變異株HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株的第13位氨基酸均發(fā)生R13Q13的突變;其余與HP-PRRSV高度同源的毒株則一致,與返強(qiáng)毒株VR2332一樣,即R13,R151。2.10基于ORF5序列的PRRSV遺傳進(jìn)化分析基于ORF5基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析顯示,美洲型PRRSV可以分為3個(gè)亞群(圖3)。HENAN-LUOY、HENAN-KAIF、HENAN-ZHENGZ、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6株同HP-PRRSVTJ、HuN4、JXA1株組成亞群1;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株與經(jīng)典毒株VR2332、S1、BJ-4組成亞群2;HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB、HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2株與2007年美國(guó)毒株MN184c和2020年美國(guó)毒株NADC30等同屬于亞群3。國(guó)內(nèi)毒株初次出如今亞群3中,預(yù)示著國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了新的PRRSV毒株,應(yīng)當(dāng)給予一定的關(guān)注。3討論從1996年初次證實(shí)PRRSV在我們國(guó)家存在,到2006年夏秋季節(jié),高致病性藍(lán)耳病在我們國(guó)家南方部分地區(qū)開(kāi)場(chǎng)爆發(fā),HP-PRRSV近些年在我們國(guó)家大部分地區(qū)流行,PRRSV在我們國(guó)家先后經(jīng)歷了傳播、變異、爆發(fā)、再變異、流行等不斷變化的經(jīng)過(guò)。研究表示清楚,同一基因型的分離毒株之間存在明顯的序列差異,十分是在基因組ORF1a的NSP1和NSP2,ORF3和ORF5的變異性較大。病毒在豬體內(nèi)持續(xù)感染經(jīng)過(guò)中,會(huì)出現(xiàn)不同的亞群,近些年,由于弱毒活疫苗的使用,在選擇壓的作用下弱毒活疫苗發(fā)生返強(qiáng)突變,進(jìn)而造成PRRS的爆發(fā)。當(dāng)前我們國(guó)家PRRSV流行情況比較復(fù)雜,以廣泛流行的美洲型HP-PRRSV為主型,經(jīng)典毒株和其他變異毒株也時(shí)有出現(xiàn),同時(shí)偶有歐洲毒株存在的相關(guān)報(bào)道。PRRSV將來(lái)怎樣衍變,致病性怎樣發(fā)展等均值得我們高度關(guān)注,因而有必要對(duì)其流行情況及相關(guān)基因型的進(jìn)化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。NSP2是經(jīng)歷顯著遺傳變異的PRRSV基因組中突變率最高的部分,其在同一基因型中和各基因型之間變異都很大。同為美洲型的HB-2株、BJ-4株、VR2332株和CH-1a株,其NSP2的氨基酸同源性為78.3%~88.9%。同時(shí),其具有很高的耐缺失或插入的能力,如MN184的NSP2缺失了100多個(gè)氨基酸,sp184212株的NSP2插入了30多個(gè)氨基酸,而HP-PRRSV共同缺失了30個(gè)不連續(xù)的氨基酸。此外,由于NSP2的蛋白酶活性,使NSP2編碼區(qū)可能在病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)宿主免疫方面具有至關(guān)重要的作用。因而,NSP2能夠作為監(jiān)測(cè)PRRSV變異的獨(dú)特標(biāo)記,用于對(duì)PRRSV進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。GP5蛋白是病毒粒子外表主要的囊膜蛋白之一,該蛋白不僅僅是PRRSV的重要免疫原性蛋白,含有重要的中和抗原表位和誘騙表位,而且是PRRSV的一個(gè)最多樣性的構(gòu)造蛋白,使得ORF5已經(jīng)成為分析PRRSV遺傳多樣性的靶基因。因而,在研究NSP2的缺失和突變的同時(shí),GP5的遺傳多樣性也遭到了很高的關(guān)注。本研究通過(guò)對(duì)2020―2020年間收集自河南的54份PRRSV疑似樣品進(jìn)行PRRSVRT-PCR檢測(cè),共檢出PRRSV陽(yáng)性樣品17份,陽(yáng)性率為31.5%。為研究中國(guó)河南地區(qū)PRRSV毒株基因變異及分子流行病學(xué)情況,本研究對(duì)其中17株P(guān)RRSV陽(yáng)性樣品的ORF5全基因和NSP2部分基因序列進(jìn)行了序列測(cè)定與分析。NSP2基因序列分析結(jié)果顯示,17份檢樣與PRRSV美洲型代表毒株序列類似性為63.9%~99.2%,與PRRSV歐洲型代表毒株序列類似性為41.3%~44.1%,講明17株P(guān)RRSV均為美洲型PRRSV。ORF5的遺傳進(jìn)化分析能夠?qū)⒑幽系貐^(qū)美洲型PRRSV分為3個(gè)亞群,即以JXA1、TJ等為代表的HP-PRRSV為亞群1,以VR2332、S1等經(jīng)典毒株為代表的亞群2,以及以NADC30、MN184c等為代表的亞群3;且由氨基酸推導(dǎo)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),亞群2中所有的39位點(diǎn)都發(fā)生L39-I39的突變。亞群1和亞群3均為L(zhǎng)39,該點(diǎn)的突變將會(huì)影響中和抗體的結(jié)合。研究表示清楚N-多糖對(duì)病毒糖蛋白的折疊和功能具有重要的作用,糖基化位點(diǎn)的突變可能會(huì)影響病毒顆粒的產(chǎn)生和病毒的感染性。通過(guò)對(duì)17株河南毒株GP5的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),亞群1含有4~5個(gè)糖基化位點(diǎn),亞群2含有3~5個(gè),亞群3則含有4個(gè)糖基化位點(diǎn),講明河南地區(qū)美洲型PRRSV外表有3~5個(gè)糖基化位點(diǎn)。亞群1和亞群2中的毒株可能通過(guò)糖基化位點(diǎn)的位置和數(shù)目上的變化影響中和抗體與相應(yīng)整合抗原位點(diǎn)的結(jié)合以及病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染力,進(jìn)而進(jìn)行免疫逃避。綜合兩基因的核苷酸與氨基酸同源性及遺傳進(jìn)化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF等10株樣品與HP-PRRSV中國(guó)毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,在進(jìn)化樹(shù)中均位于亞群1中,這些毒株很可能起源于早期HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4等;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株與經(jīng)典毒株高度同源,在進(jìn)化樹(shù)中均位于經(jīng)典毒株S1、BJ-4、VR2332為代表的亞群2中,提示河南省豬群中依然存在不斷進(jìn)化的經(jīng)典PRRSV;HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株與國(guó)外NADC30、MN184C等高度同源,與經(jīng)典的PRRSV毒株相比存在較大的基因缺失,同時(shí)基因缺失部