基因工程中常用的工具酶課件

二、基因工程的基本程序載體質(zhì)粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞選出含有重組DNA的細(xì)胞擴增表達(dá)abbAAb二、基因工程的基本程序載體質(zhì)粒外源DNA片段外源DNA插入剪1第二章

基因工程中常用的工具酶

第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節(jié)

其他工具酶第二章

基因工程中常用的工具酶

第一節(jié)

2第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體切割限制性核酸內(nèi)切酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。一、寄主控制的限制與修飾作用如圖2-1，圖2-2二、限制性核酸內(nèi)切酶的制備方法三、限制性核酸內(nèi)切酶分類和命名四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體切割3分類：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：識別和切割位點不固定，隨機性。Ⅲ：核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是不分開的。Ⅱ：能在識別位點處切割DNA，切割位點固定。核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的。常用。分類：ⅠⅡⅢ4四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別序列：1.4~7個核苷酸組成的特定核苷酸序列2.回文結(jié)構(gòu)：兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別序列：1.4~7個核5經(jīng)限制酶切割后的位點,DNA斷裂類型1.粘性末端(1)3’-OH單鏈延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P單鏈延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’經(jīng)限制酶切割后的位點,DNA斷裂類型62.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’兩種特殊的限制酶(1)同尾酶

識別位點不同，酶切后產(chǎn)生同樣的粘性末段的兩種酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶識別序列相同，對甲基化切點敏感性不同的兩種酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同識別序列GATC，但對GmeATC切點,前者不能切，后者能切。2.平末端如:SmaⅠ7五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大腸桿菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改變限制酶的識別特性3.溫度4.分子結(jié)構(gòu)5.限制酶的緩沖液星號活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素8第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、DNA連接酶

DNA連接酶（Ligase）是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復(fù)，不能連接單鏈DNA或裂口.溫度二、DNA分子的體外連接第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、9二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點的磷酸化2．平末端DNA片段的連接（1）T4DNA連接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化學(xué)合成的銜接物連接DNA分子二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點10第三節(jié)

其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆轉(zhuǎn)錄酶五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、堿性磷酸酶十一、

甲基化酶第三節(jié)

其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ11命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血桿菌屬in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：該菌株中第三個被分離到的限制酶命名HindⅢ12同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGGBglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4連接酶AGATCC

（連接后的切點均不能被上述兩種酶切）TCTAGG同尾酶BamHI和BglII13一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.三種活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP時）（2）3’外切酶活性（無dNTP時大亞基活性）（3）5’外切核酸酶活性（無dNTP時小亞基活性）2.在基因工程中的應(yīng)用：缺口平移標(biāo)記技術(shù)。一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.三種活性14二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亞基，保留大亞基）2.3’外切酶活性（無dNTP時）3.在基因工程中的應(yīng)用（1）標(biāo)記粘性末端.-32P—dNTP

標(biāo)記平末端-32P—dNTP（2）將5’端伸出的末端填平（3）可用來反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。（4）補平粘性末端。

二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）15三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反應(yīng)三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切16四、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，又稱依賴RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA為模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA雜合鏈中的RNA降解。應(yīng)用：1.RT-PCR使mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.制備探針。四、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)17五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脫氧核糖核苷酸。常用于同種堿基多聚體接尾反應(yīng)核素標(biāo)記DNA片段的3’端五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接18六、核酸酶S1可以降解單鏈DNA和RNA(1)將DNA切成平末端。有些限制性內(nèi)切核酸酶可以將DNA切成粘性末端，經(jīng)過核酸酶S1降解可切除DNA末端的單鏈。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中單鏈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA，可能形成單鏈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，為了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成無發(fā)夾結(jié)構(gòu)的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA雜交分子的結(jié)構(gòu)。六、核酸酶S1可以降解單鏈DNA和RNA19十、堿性磷酸酶該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質(zhì)，將DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，產(chǎn)生5’-OH。應(yīng)用：(1)用該酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記5’端。(2)用于避免單酶切后質(zhì)粒自我環(huán)化。十、堿性磷酸酶該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質(zhì)20十一、

甲基化酶常見的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相應(yīng)堿基甲基化。dam可在限制酶識別的5′GATC3′或5′GAAT3′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制識別的5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位點中的堿基甲基化而避免降解，保護酶切位點。十一、

甲基化酶常見的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶21核酸酶BAL31

從線形DNA分子兩端（粘端/平端）以漸進方式切去單核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有類似于SI酶單鏈特異降解活性，可除去粘性末端或單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。外切核酸酶Ⅲ能從線性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去單核苷酸，制造3′端缺失，制備DNA模板或特異DNA探針。T4多聚核苷酸激酶能將ATP上的γ位磷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA或RNA的5′-OH上，可將γ-32P-ATP中的32P連接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素標(biāo)記。核酸酶BAL3122基因工程中常用的工具酶課件23基因工程中常用的工具酶課件24基因工程中常用的工具酶課件25基因工程中常用的工具酶課件26基因工程中常用的工具酶課件27基因工程中常用的工具酶課件28基因工程中常用的工具酶課件29基因工程中常用的工具酶課件30基因工程中常用的工具酶課件31基因工程中常用的工具酶課件32基因工程中常用的工具酶課件33基因工程中常用的工具酶課件34基因工程中常用的工具酶課件35基因工程中常用的工具酶課件36基因工程中常用的工具酶課件37基因工程中常用的工具酶課件38基因工程中常用的工具酶課件39基因工程中常用的工具酶課件40基因工程中常用的工具酶課件41八、外切核酸酶Ⅲ

它的功能是將帶有3’-OH末端的雙鏈DNA從3’到5’端方向切除，產(chǎn)生5’單核苷酸八、外切核酸酶Ⅲ

它的功能是將帶有3’-OH末端的雙鏈DN42二、基因工程的基本程序載體質(zhì)粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞選出含有重組DNA的細(xì)胞擴增表達(dá)abbAAb二、基因工程的基本程序載體質(zhì)粒外源DNA片段外源DNA插入剪43第二章

基因工程中常用的工具酶

第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節(jié)

其他工具酶第二章

基因工程中常用的工具酶

第一節(jié)

44第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體切割限制性核酸內(nèi)切酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。一、寄主控制的限制與修飾作用如圖2-1，圖2-2二、限制性核酸內(nèi)切酶的制備方法三、限制性核酸內(nèi)切酶分類和命名四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體切割45分類：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：識別和切割位點不固定，隨機性。Ⅲ：核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是不分開的。Ⅱ：能在識別位點處切割DNA，切割位點固定。核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的。常用。分類：ⅠⅡⅢ46四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別序列：1.4~7個核苷酸組成的特定核苷酸序列2.回文結(jié)構(gòu)：兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別序列：1.4~7個核47經(jīng)限制酶切割后的位點,DNA斷裂類型1.粘性末端(1)3’-OH單鏈延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P單鏈延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’經(jīng)限制酶切割后的位點,DNA斷裂類型482.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’兩種特殊的限制酶(1)同尾酶

識別位點不同，酶切后產(chǎn)生同樣的粘性末段的兩種酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶識別序列相同，對甲基化切點敏感性不同的兩種酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同識別序列GATC，但對GmeATC切點,前者不能切，后者能切。2.平末端如:SmaⅠ49五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大腸桿菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改變限制酶的識別特性3.溫度4.分子結(jié)構(gòu)5.限制酶的緩沖液星號活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素50第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、DNA連接酶

DNA連接酶（Ligase）是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復(fù)，不能連接單鏈DNA或裂口.溫度二、DNA分子的體外連接第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、51二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點的磷酸化2．平末端DNA片段的連接（1）T4DNA連接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化學(xué)合成的銜接物連接DNA分子二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點52第三節(jié)

其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆轉(zhuǎn)錄酶五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、堿性磷酸酶十一、

甲基化酶第三節(jié)

其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ53命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血桿菌屬in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：該菌株中第三個被分離到的限制酶命名HindⅢ54同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGGBglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4連接酶AGATCC

（連接后的切點均不能被上述兩種酶切）TCTAGG同尾酶BamHI和BglII55一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.三種活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP時）（2）3’外切酶活性（無dNTP時大亞基活性）（3）5’外切核酸酶活性（無dNTP時小亞基活性）2.在基因工程中的應(yīng)用：缺口平移標(biāo)記技術(shù)。一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.三種活性56二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亞基，保留大亞基）2.3’外切酶活性（無dNTP時）3.在基因工程中的應(yīng)用（1）標(biāo)記粘性末端.-32P—dNTP

標(biāo)記平末端-32P—dNTP（2）將5’端伸出的末端填平（3）可用來反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。（4）補平粘性末端。

二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）57三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反應(yīng)三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切58四、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，又稱依賴RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA為模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA雜合鏈中的RNA降解。應(yīng)用：1.RT-PCR使mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.制備探針。四、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)59五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脫氧核糖核苷酸。常用于同種堿基多聚體接尾反應(yīng)核素標(biāo)記DNA片段的3’端五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接60六、核酸酶S1可以降解單鏈DNA和RNA(1)將DNA切成平末端。有些限制性內(nèi)切核酸酶可以將DNA切成粘性末端，經(jīng)過核酸酶S1降解可切除DNA末端的單鏈。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中單鏈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA，可能形成單鏈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，為了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成無發(fā)夾結(jié)構(gòu)的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA雜交分子的結(jié)構(gòu)。六、核酸酶S1可以降解單鏈DNA和RNA61十、堿性磷酸酶該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質(zhì)，將DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，產(chǎn)生5’-OH。應(yīng)用：(1)用該酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記5’端