HE染色教學(xué)講解課件

常規(guī)標(biāo)本的制作和HE染色薛輝吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院常規(guī)標(biāo)本的制作和HE染色薛輝切片的一般程序封固石蠟切片取材固定(24-48h)脫水(70,80%4h;90,95%2h,100%1h(2))透明(二甲苯10min(2))浸蠟(30min(3))包埋切片染色切片的一般程序封固石蠟切片取材固定(24-48h)脫水(70顯微標(biāo)本制作技術(shù)從保存時(shí)間長短分，有臨時(shí)玻片標(biāo)本和永久玻片標(biāo)本。從制作的方法來分，有涂片、壓片、裝片(也叫整裝法)、磨片和切片等。切片法徒手切片法石蠟切片法火棉膠切片法冰凍切片法顯微標(biāo)本制作技術(shù)從保存時(shí)間長短分，有臨時(shí)玻片標(biāo)本和永久玻片標(biāo)材料和夾持物切取的標(biāo)本1.徒手切片法

材料和夾持物切取的標(biāo)本1.徒手切片法滴水放置標(biāo)本加蓋蓋玻片葉的橫切滴水放置標(biāo)本加蓋蓋玻片葉的橫切取材

1.材料新鮮最好是動(dòng)物的心臟還在跳動(dòng)時(shí)取材，立即投入固定液內(nèi)。應(yīng)爭取在死后半小時(shí)內(nèi)處理完畢2.組織塊力求小而薄,以不超過5毫米為在可能范圍內(nèi)也應(yīng)力求短小。以使固定液能迅速而均勻地滲入組織塊內(nèi)部3.勿使組織塊受擠壓。取材時(shí)，組織塊可稍取大一點(diǎn)。4.要熟悉取材的部位要能準(zhǔn)確地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部，脊髓取腰膨大與頸形大5.選好組織塊的切面縱切或橫切往往是顯示組織結(jié)構(gòu)明晰的關(guān)鍵。6.保持材料的清潔組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用生理鹽水沖洗，然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。取材1.材料新鮮最好是動(dòng)物的心空腔性器官注意橫斷面和縱斷面保護(hù)內(nèi)皮和粘膜橫斷：氣管、食管、血管縱斷：胃底、腸、心臟心瓣膜左心室左心房空腔性器官心瓣膜左心室左心房特殊的組織或者器官血液、骨髓：涂片肌肉、神經(jīng)：骨、牙齒：脫鈣切片

酸特殊的組織或者器官酸固定的方法

1.蒸氣固定法比較細(xì)小而薄的標(biāo)本，可用餓酸或甲醛蒸氣固定。主要用于血液或細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織等的固。如血液涂片，則應(yīng)在血片未干燥前就與餓酸蒸氣接觸2注射、灌注固定法.某些組織塊由于體積過大或固定掖極難滲入內(nèi)部或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物進(jìn)行固定。如肺可將固定液從氣管或支氣管注入.全身灌注固定較大動(dòng)物如兔、貓、狗、猴及整個(gè)人體,固定液輸入后，可不必即刻取材。小動(dòng)物，如大、小鼠，也可灌流固定.

3.小塊組織固定法.從人體或動(dòng)物取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進(jìn)行固定，這是應(yīng)用最廣泛最經(jīng)常的方法。固定的方法

1.蒸氣固定法比較細(xì)小固定的目的1.迅速阻止組織、細(xì)胞的死后變化，防止自溶與腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)與結(jié)構(gòu)。2.使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖，酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持其原有狀態(tài)。

3.使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，以便染色后易于鑒別和觀察

4.使組織塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞。5使不同組織成分對(duì)染料有不同的親和力，經(jīng)過染色處理后易于辨認(rèn)。

6.防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。7.使組織塊硬化，便于制作薄片。固定的目的1.迅速阻止組織、細(xì)胞

注意事項(xiàng)及影響固定的因素1.組織塊不宜過大，一般以厚度5毫米，長寬不超過15x15毫米。2.固定液的量一般以組織塊大小的20倍為宜3.必須選擇滲透力強(qiáng)，又不使組織過度收縮或膨脹的試劑做固定劑.注意事項(xiàng)及影響固定的因素1.組織石蠟切片標(biāo)本的固定固定液：10%中性福爾馬林固定時(shí)間：室溫3個(gè)小時(shí)，1個(gè)小時(shí)后修塊。固定方法：容器底部墊上脫脂棉或者濾紙。肺臟：液體表面覆蓋脫脂棉?？涨慌K器：漿膜面平鋪在紙板上用大頭釘固定。膽囊放在單獨(dú)的容器內(nèi)。腦、脊髓、松軟的腫瘤、病變組織：先固定后切開。腦最好懸吊在固定液中。睪丸、囊性組織：向腔內(nèi)注入較高濃度的固定液。骨骼標(biāo)本：剝離軟組織后鋸成小塊固定。垂體等較小組織：擦鏡紙包好滴少量伊紅標(biāo)記后固定。石蠟切片標(biāo)本的固定固定液：10%中性福爾馬林沖洗和保存經(jīng)過長時(shí)間福爾馬林固定和保存的組織要充分水洗，否則影響核的染色。一般置于70~80%酒精中40C保存。當(dāng)酒精混濁時(shí)，更換新的酒精。沖洗和保存固定易出現(xiàn)的問題與主要原因扭曲變形與過度硬脆容器過小；標(biāo)本數(shù)量過多；固定時(shí)間過長。取材過于薄小，尤其疏松結(jié)締組織。表層過度，中間沒有固定透取材過厚過大；固定時(shí)間不足；固定液失效。固定液濃度高、滲透力強(qiáng)，表面快速硬化。局部固定不佳組織與組織重疊；組織與容器接觸；組織露出液面。注意：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?。固定易出現(xiàn)的問題與主要原因扭曲變形與過度硬脆脫水（一）脫水的意義與目的常用的固定劑中含有很多水分，在石蠟或火棉膠包埋前。必須用某些溶劑逐步將組織塊吸收的水分置換出來，再讓石蠟或火棉膠將該溶荊里換，完成包埋步驟。將組織塊內(nèi)水份置換的過程就叫脫水。脫水時(shí)必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑，以防組織過度收縮而變形，或脫水不完全而影響制片效果。脫水劑必須具有下列特性：①脫水劑能與水按比例混合，②高濃度，一般指不含水份，③脫水劑也能與透明劑混合。前二者特性能達(dá)到逐步除去組織塊內(nèi)的水份，使組織塊內(nèi)的水份全部被脫水劑所取代，后二者特性則為透明步驟的透明劑完全取代組織內(nèi)的脫水劑創(chuàng)造條件。脫水（一）脫水的意義與目的

脫水時(shí)間應(yīng)視組織塊的大小及厚度而定，大致處理如下：組織塊為3-5毫米厚者，各級(jí)酒精為3^-6小時(shí)，無水酒精對(duì)組織有脆化作用，浸泡時(shí)間還應(yīng)縮短。實(shí)質(zhì)性器官，如腎、脾和淋巴結(jié)等，在酒情中浸泡時(shí)間太久易于硬脆，脂肪組織與疏松結(jié)締組織在酒精中浸飽的時(shí)間要長，特別是在95％酒精中，以盡量溶去脂肪，并脫凈殘存的水份，有利于包埋劑滲入組織內(nèi)。脫水時(shí)間應(yīng)視組織塊的大小及厚度脫水目的：利于石蠟包埋劑滲入。酒精脫水：70%和80%：可以長期保存90%、95%：2個(gè)小時(shí)。100%I、II：各1小時(shí)。注意：某些檢查，不能經(jīng)過低濃度酒精脫水。如糖原、尿酸結(jié)晶。肝、脾、淋巴結(jié)：適當(dāng)縮短在無水乙醇內(nèi)的時(shí)間。脂肪、疏松結(jié)締組織、腦：適當(dāng)延長脫水時(shí)間。脫水目的：利于石蠟包埋劑滲入。透明二甲苯I和II：各10分鐘左右。透明時(shí)間不宜太長，否則組織收縮硬化。透明透明透明在兩種情況下進(jìn)行。

第一，透明是在組織脫水后浸蠟前進(jìn)行，其目的不在于為了顯微鏡觀察，而是作為從脫水劑進(jìn)入包埋劑的橋梁。因此，透明劑必須既能與酒精混合，又能與石蠟融合無間，二甲苯即具此性質(zhì)，故被選為常用的透明劑。

第二，透明是在片子脫水與封藏之間進(jìn)行。其目的除了作為從脫水劑進(jìn)入封藏劑的橋梁外，尚有使標(biāo)本透明而便于觀察的作用。

透明透明在兩種情況下進(jìn)行。

第一，透明是在組織脫水后浸蠟前浸蠟透蠟是指將材料中的透明劑逐步清除，以至完全由石蠟充分滲透。浸蠟透蠟是指將材料中的透明劑逐步清除，以至完全由石浸蠟石蠟熔點(diǎn)選擇54~580C，浸蠟溫度較熔點(diǎn)高2~30C。較硬的致密組織，例如骨、軟骨、肌腱、皮膚、子宮肌選用熔點(diǎn)較高的石蠟。疏松及脆嫩組織，例如腦、脊髓、小動(dòng)物肝脾選用熔點(diǎn)較低的石蠟。石蠟I：10~20分鐘。石蠟II：20~30分鐘。石蠟III：30~40分鐘。浸蠟石蠟熔點(diǎn)選擇54~580C，浸蠟溫度較熔點(diǎn)高2~3包埋是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的容器內(nèi)，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蠟塊，以備切片。包埋是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的包埋新蠟反復(fù)熔化、冷凝，改善密度，提高韌性，質(zhì)地均勻。包埋溫度65~700C.準(zhǔn)備工作熔蠟備用；預(yù)熱包埋用具注蠟、取放組織切面向下擺正壓平保留適當(dāng)距離附貼標(biāo)記移置冷凝修整蠟塊粘貼標(biāo)記包埋新蠟反復(fù)熔化、冷凝，改善密度，提高韌性，質(zhì)地均勻。包埋修塊

石蠟Ⅲ石蠟Ⅲ注意事項(xiàng)實(shí)質(zhì)性器官：最大切面向下。空腔性器官：管壁切面向下相同性質(zhì)的小塊組織可以包埋在一個(gè)蠟塊中。難切的組織單獨(dú)包埋。操作要迅速，組織不能在空氣中停留太久。注意事項(xiàng)石蠟切片準(zhǔn)備工作切片通常4~6微米展片550C附貼蛋白甘油標(biāo)記連續(xù)切片標(biāo)記順序烤片600C石蠟全部融化石蠟切片準(zhǔn)備工作切片5~6μm,展片與粘片水內(nèi)撈片法：40℃酒精撈片法：50~70%酒精，30~40℃烤片

60℃烤箱烤干HE染色封固

干封濕封切片冰凍切片取材脫水10%蔗糖20%蔗糖30%蔗糖OCT包埋浸泡20~30分鐘-700C冷凝液氮液面上10~20秒-700C保存冷凍切片-200C保存1個(gè)月干燥室溫10分鐘固定冷丙酮5~10分鐘染色冰凍切片取材常規(guī)標(biāo)本的制作和HE染色薛輝吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院常規(guī)標(biāo)本的制作和HE染色薛輝切片的一般程序封固石蠟切片取材固定(24-48h)脫水(70,80%4h;90,95%2h,100%1h(2))透明(二甲苯10min(2))浸蠟(30min(3))包埋切片染色切片的一般程序封固石蠟切片取材固定(24-48h)脫水(70顯微標(biāo)本制作技術(shù)從保存時(shí)間長短分，有臨時(shí)玻片標(biāo)本和永久玻片標(biāo)本。從制作的方法來分，有涂片、壓片、裝片(也叫整裝法)、磨片和切片等。切片法徒手切片法石蠟切片法火棉膠切片法冰凍切片法顯微標(biāo)本制作技術(shù)從保存時(shí)間長短分，有臨時(shí)玻片標(biāo)本和永久玻片標(biāo)材料和夾持物切取的標(biāo)本1.徒手切片法

材料和夾持物切取的標(biāo)本1.徒手切片法滴水放置標(biāo)本加蓋蓋玻片葉的橫切滴水放置標(biāo)本加蓋蓋玻片葉的橫切取材

1.材料新鮮最好是動(dòng)物的心臟還在跳動(dòng)時(shí)取材，立即投入固定液內(nèi)。應(yīng)爭取在死后半小時(shí)內(nèi)處理完畢2.組織塊力求小而薄,以不超過5毫米為在可能范圍內(nèi)也應(yīng)力求短小。以使固定液能迅速而均勻地滲入組織塊內(nèi)部3.勿使組織塊受擠壓。取材時(shí)，組織塊可稍取大一點(diǎn)。4.要熟悉取材的部位要能準(zhǔn)確地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部，脊髓取腰膨大與頸形大5.選好組織塊的切面縱切或橫切往往是顯示組織結(jié)構(gòu)明晰的關(guān)鍵。6.保持材料的清潔組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用生理鹽水沖洗，然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。取材1.材料新鮮最好是動(dòng)物的心空腔性器官注意橫斷面和縱斷面保護(hù)內(nèi)皮和粘膜橫斷：氣管、食管、血管縱斷：胃底、腸、心臟心瓣膜左心室左心房空腔性器官心瓣膜左心室左心房特殊的組織或者器官血液、骨髓：涂片肌肉、神經(jīng)：骨、牙齒：脫鈣切片

酸特殊的組織或者器官酸固定的方法

1.蒸氣固定法比較細(xì)小而薄的標(biāo)本，可用餓酸或甲醛蒸氣固定。主要用于血液或細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織等的固。如血液涂片，則應(yīng)在血片未干燥前就與餓酸蒸氣接觸2注射、灌注固定法.某些組織塊由于體積過大或固定掖極難滲入內(nèi)部或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物進(jìn)行固定。如肺可將固定液從氣管或支氣管注入.全身灌注固定較大動(dòng)物如兔、貓、狗、猴及整個(gè)人體,固定液輸入后，可不必即刻取材。小動(dòng)物，如大、小鼠，也可灌流固定.

3.小塊組織固定法.從人體或動(dòng)物取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進(jìn)行固定，這是應(yīng)用最廣泛最經(jīng)常的方法。固定的方法

1.蒸氣固定法比較細(xì)小固定的目的1.迅速阻止組織、細(xì)胞的死后變化，防止自溶與腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)與結(jié)構(gòu)。2.使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖，酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持其原有狀態(tài)。

3.使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，以便染色后易于鑒別和觀察

4.使組織塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞。5使不同組織成分對(duì)染料有不同的親和力，經(jīng)過染色處理后易于辨認(rèn)。

6.防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。7.使組織塊硬化，便于制作薄片。固定的目的1.迅速阻止組織、細(xì)胞

注意事項(xiàng)及影響固定的因素1.組織塊不宜過大，一般以厚度5毫米，長寬不超過15x15毫米。2.固定液的量一般以組織塊大小的20倍為宜3.必須選擇滲透力強(qiáng)，又不使組織過度收縮或膨脹的試劑做固定劑.注意事項(xiàng)及影響固定的因素1.組織石蠟切片標(biāo)本的固定固定液：10%中性福爾馬林固定時(shí)間：室溫3個(gè)小時(shí)，1個(gè)小時(shí)后修塊。固定方法：容器底部墊上脫脂棉或者濾紙。肺臟：液體表面覆蓋脫脂棉?？涨慌K器：漿膜面平鋪在紙板上用大頭釘固定。膽囊放在單獨(dú)的容器內(nèi)。腦、脊髓、松軟的腫瘤、病變組織：先固定后切開。腦最好懸吊在固定液中。睪丸、囊性組織：向腔內(nèi)注入較高濃度的固定液。骨骼標(biāo)本：剝離軟組織后鋸成小塊固定。垂體等較小組織：擦鏡紙包好滴少量伊紅標(biāo)記后固定。石蠟切片標(biāo)本的固定固定液：10%中性福爾馬林沖洗和保存經(jīng)過長時(shí)間福爾馬林固定和保存的組織要充分水洗，否則影響核的染色。一般置于70~80%酒精中40C保存。當(dāng)酒精混濁時(shí)，更換新的酒精。沖洗和保存固定易出現(xiàn)的問題與主要原因扭曲變形與過度硬脆容器過??；標(biāo)本數(shù)量過多；固定時(shí)間過長。取材過于薄小，尤其疏松結(jié)締組織。表層過度，中間沒有固定透取材過厚過大；固定時(shí)間不足；固定液失效。固定液濃度高、滲透力強(qiáng)，表面快速硬化。局部固定不佳組織與組織重疊；組織與容器接觸；組織露出液面。注意：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ骸９潭ㄒ壮霈F(xiàn)的問題與主要原因扭曲變形與過度硬脆脫水（一）脫水的意義與目的常用的固定劑中含有很多水分，在石蠟或火棉膠包埋前。必須用某些溶劑逐步將組織塊吸收的水分置換出來，再讓石蠟或火棉膠將該溶荊里換，完成包埋步驟。將組織塊內(nèi)水份置換的過程就叫脫水。脫水時(shí)必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑，以防組織過度收縮而變形，或脫水不完全而影響制片效果。脫水劑必須具有下列特性：①脫水劑能與水按比例混合，②高濃度，一般指不含水份，③脫水劑也能與透明劑混合。前二者特性能達(dá)到逐步除去組織塊內(nèi)的水份，使組織塊內(nèi)的水份全部被脫水劑所取代，后二者特性則為透明步驟的透明劑完全取代組織內(nèi)的脫水劑創(chuàng)造條件。脫水（一）脫水的意義與目的

脫水時(shí)間應(yīng)視組織塊的大小及厚度而定，大致處理如下：組織塊為3-5毫米厚者，各級(jí)酒精為3^-6小時(shí)，無水酒精對(duì)組織有脆化作用，浸泡時(shí)間還應(yīng)縮短。實(shí)質(zhì)性器官，如腎、脾和淋巴結(jié)等，在酒情中浸泡時(shí)間太久易于硬脆，脂肪組織與疏松結(jié)締組織在酒精中浸飽的時(shí)間要長，特別是在95％酒精中，以盡量溶去脂肪，并脫凈殘存的水份，有利于包埋劑滲入組織內(nèi)。脫水時(shí)間應(yīng)視組織塊的大小及厚度脫水目的：利于石蠟包埋劑滲入。酒精脫水：70%和80%：可以長期保存90%、95%：2個(gè)小時(shí)。100%I、II：各1小時(shí)。注意：某些檢查，不能經(jīng)過低濃度酒精脫水。如糖原、尿酸結(jié)晶。肝、脾、淋巴結(jié)：適當(dāng)縮短在無水乙醇內(nèi)的時(shí)間。脂肪、疏松結(jié)締組織、腦：適當(dāng)延長脫水時(shí)間。脫水目的：利于石蠟包埋劑滲入。透明二甲苯I和II：各10分鐘左右。透明時(shí)間不宜太長，否則組織收縮硬化。透明透明透明在兩種情況下進(jìn)行。

第一，透明是在組織脫水后浸蠟前進(jìn)行，其目的不在于為了顯微鏡觀察，而是作為從脫水劑進(jìn)入包埋劑的橋梁。因此，透明劑必須既能與酒精混合，又能與石蠟融合無間，二甲苯即具此性質(zhì)，故被選為常用的透明劑。

第二，透明是在片子脫水與封藏之間進(jìn)行。其目的除了作為從脫水劑進(jìn)入封藏劑的橋梁外，尚有使標(biāo)本透明而便于觀察的作用。

透