實驗九細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)反應(yīng)觀察部分

關(guān)于實驗九細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)反應(yīng)觀察部分第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)的測定方法；通過不同細(xì)菌對不同含碳、含氮化合物的分解利用情況，了解細(xì)菌碳、氮代謝類型的多樣性；了解細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的不同生長現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義；第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗儀器,材料和用具實驗儀器37℃恒溫培養(yǎng)箱、20℃恒溫培養(yǎng)箱（室溫代替）。微生物材料大腸桿菌、枯草桿菌這二種菌種的斜面各1支。試劑甲基紅試劑、V．P試劑、吲哚試劑、格里斯試劑(硝酸鹽利用試驗)、盧戈氏碘液(淀粉水解試驗)第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗儀器,材料和用具實驗用具試管：每份每個試驗2支試驗，7個試驗共14支。無菌平皿：每份2個杜氏小管：每份4個。接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號筆。第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗儀器,材料和用具培養(yǎng)基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基甲基紅(葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基)V.P試驗(葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基)檸檬酸鹽利用試驗（檸檬酸鹽利用試驗）吲哚試驗(蛋白水培養(yǎng)基)淀粉培養(yǎng)基第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗原理－－細(xì)菌生化試驗糖(醇)類發(fā)酵試驗不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖(醇)的酶，因而發(fā)酵糖(醇)的能力各不相同。其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同，如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判定。在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)一6.8(紫色)]，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明。第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗步驟糖(醇)類發(fā)酵試驗編號在各試管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號，下同。接種取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基2支，按編號1支接種大腸桿菌，另1支接種枯草桿菌。同樣取2支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌。在接種后，輕輕搖動試管，使其均勻，防止導(dǎo)致的德漢氏/杜氏小管進(jìn)入氣泡。將已接種好的培養(yǎng)基置37℃溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果：被檢細(xì)菌若能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖時，則使培養(yǎng)基的pH降低，這時培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)(為黃色)，若發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基不僅顯酸色反應(yīng)，并且在培養(yǎng)基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有氣體。氣體占整個倒置小玻管的10％以上。若被檢細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的糖，則培養(yǎng)基不發(fā)生變化。第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗結(jié)果糖發(fā)酵實驗Carbohydratefermentation第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日IMViC試驗吲哚試驗甲基紅試驗伏-普（V.P）試驗檸檬酸鹽利用試驗

(Indoltest)(Methylredtest)(Voges-Prokauertest)(Ciratetest）第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日甲基紅(Methylred)試驗(簡稱MR試驗)很多細(xì)菌，如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下，這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4(紅色)～pH6.2(黃色)。若某些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但很快將丙酮酸脫羧，轉(zhuǎn)化成醇等物，則培養(yǎng)基的pH仍在6.2以上，故此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。實驗步驟第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗步驟甲基紅試驗(MR試驗)將大腸桿菌和枯草桿菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，加甲基紅指示劑2滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日MethylRedTest第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日V.P試驗測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，該物質(zhì)在堿性條件下被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸中的胍基作用生成紅色化合物。第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗步驟伏-普二氏試驗(V.P試驗)

將被檢菌接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，取出，倒掉一半培養(yǎng)液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入（總體積）等量的5％-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃水浴鍋中保溫15～30min，以加快反應(yīng)速度。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏－普反應(yīng)陽性。第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日Voges-ProskauerTest第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗原理－－有機酸鹽及氨鹽利用試驗檸檬酸鹽利用試驗檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源。而磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑（PH＜6.0時呈黃色，PH在6.0~7.0時為綠色，PH＞7.6時呈藍(lán)色）由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌，在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗步驟檸檬酸鹽利用試驗取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變深藍(lán)色者為陽性。培養(yǎng)基不變色，則繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基仍不變色者為陰性。第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日CitrateTest第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗原理靛基質(zhì)(吲哚)試驗?zāi)承┘?xì)菌，如大腸桿菌，能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)(吲哚)，靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰色靛基質(zhì)(紅色化合物)。第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗步驟靛基質(zhì)(吲哚)試驗將被檢菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h～48h后，加入10-20滴乙醚，振蕩數(shù)次，靜置1－3分鐘，沿試管壁滴加2滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色者為陽性，出現(xiàn)黃色者為陰性。第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日IndoleTest第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗原理－－大分子物質(zhì)代謝實驗

淀粉水解試驗細(xì)菌對大分子的淀粉不能直接利用，須靠產(chǎn)生的胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進(jìn)一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)，再被細(xì)菌吸收利用，細(xì)菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即用碘測定不再產(chǎn)生藍(lán)色。第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日實驗步驟淀粉水解試驗將配制好的淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取少許枯草桿菌劃線接種在平板的一邊，再取少許大腸桿菌劃線接種在平板的另一邊。置37℃溫箱培養(yǎng)24h。滴加少量盧戈氏碘液于平板上，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的大小。第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日3號管--甲基紅試驗:加甲基紅指示劑2滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。4號管--伏-普二氏試驗:倒掉一半培養(yǎng)液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入（總體積）等量的5％-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃水浴鍋中保溫15～30min。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏－普反應(yīng)陽性。6號管--吲哚試驗:加入10-20滴乙醚，振蕩數(shù)次，靜置1－3分鐘，沿試管壁滴加2滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，出現(xiàn)紅色者為陽性，出現(xiàn)黃色者為陰性。平板--淀粉水解試驗:滴加少量盧戈氏碘液于平板上，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍有無色透明圈出