(整理)端粒復(fù)制

精品文檔精品文檔端粒的復(fù)制、雙鏈DNA復(fù)制末端的丟失對(duì)于所遇的生物而言DNA的復(fù)制永遠(yuǎn)是遺傳的關(guān)鍵步驟。而對(duì)于雙鏈DNA而言，其復(fù)制方法是半保留復(fù)制。即復(fù)制所形成的新的DNA分子中，保留了原來親本的DNA雙鏈分子中的一條單鏈。并且合成是有方向的只可以從5,到3,的方向合成。所以在合成中就形成了先導(dǎo)鏈和滯后鏈，而滯后鏈的合成中會(huì)形成崗崎片段，而這些崗崎片段的合成都需要一種特別的RNA聚合酶的作用下先合成一小段RNA“引物”，由此提供一個(gè)3，一0H，端。只有這樣，DNA聚合酶才能夠在“引物”的幫助下延伸復(fù)制。當(dāng)鏈復(fù)制延伸反應(yīng)啟動(dòng)后，這些RNA“引物”將會(huì)被除去，而中間的斷層卻因?yàn)槠?,端方向的DNA片段的末端有3，一0H，端，使DNA聚合酶可以補(bǔ)齊斷層。但是末端的DNA引物的5,端方向沒有DNA片段提供3，一0H，端，這樣就使得在新鏈的最末端留下了一段無法填補(bǔ)的空缺。這樣沒復(fù)制一次DNA的末端就會(huì)愈來愈短，甚至產(chǎn)生遺傳信息的丟失（見圖一）。這就是最早人們所發(fā)現(xiàn)的DNA末端復(fù)制難題，也是人們開始研究末端復(fù)制的開端。|復(fù)制末跳RNA引物圖1染色體復(fù)制的末端隱縮問題但是實(shí)際上，生物在繁衍的過程中并不沒有出現(xiàn)這種遺傳信息不斷丟失的問題，所以人們開始研究生物體是如何來回避這個(gè)問題的。.原核生物的DNA末端復(fù)制的方法首先原核生物的遺傳信息量相對(duì)真核生物來說要小的多，而且其遺傳信息的載體僅僅是一個(gè)DNA環(huán)狀分子。這種DNA的構(gòu)型就決定了原核生物根本不存在DNA末端復(fù)制問題。而且綜合DNA末端丟失的原因和圖一，可以很容易的想象出當(dāng)模板鏈?zhǔn)黔h(huán)狀時(shí)，為什么原核生物的DNA復(fù)制不會(huì)出現(xiàn)末端丟失。.病毒DNA（或RNA）的末端復(fù)制的方法病毒是一種非細(xì)胞形態(tài)的生命體，并且其遺傳物質(zhì)可以是雙鏈的DNA，單鏈的DNA還可以是單鏈或者是雙鏈的RNA這四類，所以其復(fù)制終止的方式也多種多樣⑴。對(duì)具有環(huán)狀DNA分子的病毒而言，其復(fù)制終止的方式與原核生物基本相同。原核病毒,如T4和T7噬菌體等的DNA也是線性分子，其DNA兩端各有一段重復(fù)的數(shù)百個(gè)核甘酸，稱為末端冗余。這意味著兩個(gè)子代分子中的單鏈末端可以互補(bǔ)，多余的部分可以被DNA酶除去。因此，它們采用病毒基因組末端互相融合形成多連體的方法，利用相鄰病毒DNA新鏈的3'—OH’端為引物復(fù)制自身，從而達(dá)到完全復(fù)制的目的。動(dòng)物病毒多數(shù)也是線性分子,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中,它們選擇的末端復(fù)制策略與上述幾類原核生物又不盡相同。細(xì)小病毒在其單股DNA末端有一正向和反向的重復(fù)序列，這一回文片段能在末端形成鬢夾形結(jié)構(gòu),使得合成新鏈折回補(bǔ)齊5’端空缺。腺病毒則利用一種特殊的蛋白質(zhì)與5’端共價(jià)連接。這種特殊蛋白質(zhì)被稱作末端蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)寫為TP。TP以其絲氨酸輕基通過磷酸二醋鍵與5’端的胞嗜陡共價(jià)連接。參與腺病毒DNA復(fù)制起始的是末端蛋白質(zhì)的前體物，簡(jiǎn)寫為pTPopTP不但作為蛋白質(zhì)引物解決了腺病毒DNA的復(fù)制起始問題,而且這種引發(fā)方式避免了線形DNA在復(fù)制結(jié)束時(shí)所面臨的5’末端隱縮問題。除腺病毒外,枯草桿菌噬菌體①29和脊髓灰質(zhì)炎病毒（一種RNA病毒），也采用這種借助蛋白質(zhì)介入的方法。痘病毒和疤疹病毒則和T4,T7噬菌體一樣,都是以多連體的形式達(dá)到完全復(fù)制的。.真核生物的DNA末端復(fù)制的方法在真核生物中，端粒的丟失在每次復(fù)制中是不可以避免的，因此在真核生物中，就有了一套自己的體系去處理這個(gè)問題，那就是在端粒酶的作用下進(jìn)行端粒的復(fù)制。下面我們將更詳細(xì)的去解釋這個(gè)問題。二.真核生物DNA端粒的復(fù)制工作研究的發(fā)展過程20世紀(jì)30年代，遺傳學(xué)家McClintock和Muller分別在玉米和果蠅中發(fā)現(xiàn)損傷斷裂后的染色體末端之間極易發(fā)生連接，從而形成各種類型的染色體畸變，如末端融合形成環(huán)狀體或形成雙著絲點(diǎn)染色體．但染色體的天然末端似乎從來不與染色體斷裂產(chǎn)生的那種末端連接，天然末端之間也不結(jié)合，就像有一頂“帽子”那樣維持著染色體末端的穩(wěn)定.于是Muller提出位于染色體兩端的片段在細(xì)胞里具有重要的作用，并命名它為端粒（Telomere）⑵，這是由希臘語(yǔ)“末端”（Telos）及“部分”（Meros）組成的.20世紀(jì)70年代，Blackburn利用四膜蟲（Tetrahymena）進(jìn)一步揭示了端粒的初步結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它是由幾個(gè)核苷酸（富含G）組成的DNA重復(fù)片斷，重復(fù)的次數(shù)由幾十到數(shù)千不等.1972年，Watson發(fā)現(xiàn)了這樣一個(gè)問題，即DNA多聚酶是不能夠復(fù)制線性染色質(zhì)的全部的，由于在末端缺少5?端的引物，DNA多聚酶將不能完成最后的復(fù)制工作，而留下一個(gè)單鏈的間隙.如果這一間隙不能被填充的話，染色體DNA將失去這一DNA片斷，這樣的話，每經(jīng)過一次復(fù)制、分裂，染色體就將丟失一部分的端粒結(jié)構(gòu)，直至影響到與端粒相鄰的一些重要基因.因此科學(xué)家們考慮是否存在著一種不同于DNA多聚酶的酶來完成這一工作.

1984年，Greider和Blackburn發(fā)現(xiàn)將一段單鏈的末端寡聚核苷酸加至四膜蟲的提取物中后，端粒的長(zhǎng)度延長(zhǎng)了，這說明確實(shí)有這樣一種酶存在，將它命名為“端粒酶”（Telomerase）⑶.進(jìn)一步的研究揭示了端粒與端粒酶在細(xì)胞的生長(zhǎng)及腫瘤預(yù)防和防治中有非常重要的意義.下圖圖二為四膜蟲DNA端粒合稱示意圖。?…GGGGTTGGGGTTG3'?5，人蛋白催化亞基循環(huán)反復(fù)新合成的端粒DNA循環(huán)反復(fù)新合成的端粒DNA圖二四膜蟲端粒酶對(duì)端粒DNA的復(fù)制三..端粒及端粒酶.端粒的概念端粒是真核細(xì)胞染色體線形DNA分子末端具特殊結(jié)構(gòu)的序列。它是一段十分簡(jiǎn)單、多次重復(fù)的DNA序列和端粒結(jié)合蛋白組成。序列的主要特征是富含G和T,如人和其他脊椎動(dòng)物的端粒重復(fù)單位為人6661「四膜蟲的重復(fù)單位為6666丁丁和GGGGTTTT等，它們多次重復(fù)長(zhǎng)度可達(dá)幾百到幾千堿基對(duì)。端粒DNA的序列具有一定的取向特征，即在雙鏈DNA末端，富含G的一股鏈總是由5‘向3’末端延伸，并比互補(bǔ)的富含C鏈長(zhǎng)12至16個(gè)核苷酸⑷。真核生物染色體末端的端粒結(jié)構(gòu)，由于富含G,且在3’末端形成一段單鏈突出序列，因此在正常生理?xiàng)l件下，可通過G—G間非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，在突出的3′端形成分子內(nèi)G一四聯(lián)體（四股螺旋結(jié)構(gòu)），也可以由兩個(gè)DNA分子或染色體彼此連接成一個(gè)局部的分子間四聯(lián)體⑸（圖3）。圖3G四聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)(a)分子內(nèi)四聯(lián)體螺旋(b)雙分子間四聯(lián)體螺旋(c)兩個(gè)DNA分子或染色體末端連接起來而形成局部四螺旋結(jié)構(gòu)。.端粒酶的概念端粒酶是一種能將真核生物染色體末端DNA端粒DNA加以延伸的酶.它是一種核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物.目前認(rèn)為端粒酶是由端粒酶RNA組分(tekmeraseRNA,TR),端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶催化亞基(telomerasereversetranscriptase,TERT)三部分組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物(6，7).端粒酶結(jié)構(gòu)中的核酸部分為RNA,又分為模板區(qū)與非模板區(qū).模板區(qū)決定所合成端粒的特異性，非模板區(qū)具有酶與底物的結(jié)合位點(diǎn).模板區(qū)的長(zhǎng)度一般為端粒重復(fù)序列長(zhǎng)度的1~1.5倍.不同物種端粒酶RNA部分的核苷酸組成存在差異.如最早研究的四膜蟲端粒酶RNA為159nt的小RNA,其中46,47和48位的核苷酸被修飾過，而這一位置有CAACCCCAA結(jié)構(gòu)，可與四膜蟲端粒的重復(fù)序列TTGGGG互補(bǔ).又如Eupktes(游仆蟲)端粒酶RNA有191個(gè)核苷酸，模板區(qū)為5'CAAAACCCCAAA,小鼠端粒酶RNA有430個(gè)核苷酸，模板區(qū)為5'CCUAACCCUGAG,大鼠端粒酶RNA模板區(qū)為5'UCUAACCCUAUU,中國(guó)倉(cāng)鼠端粒酶RNA模板區(qū)為5'UCUAACCCUGAA.1995年，F(xiàn)eng等⑻克隆了人類端粒酶RNA基因(hTR基因，位于3p6.3),在長(zhǎng)約450個(gè)堿基的人端粒酶RNA序列中,有一段長(zhǎng)11個(gè)核苷酸的區(qū)域(5'-CUAACCCUAAC-3')與人端粒序列(TTAGGG)n互補(bǔ)，發(fā)生在該模板區(qū)域的hTR突變將導(dǎo)致端粒酶功能的改變.對(duì)已研究的不同物種的端粒酶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，它們之間的RNA鏈同源性較低，將脊椎動(dòng)物的TR二級(jí)結(jié)構(gòu)與四膜蟲的比較發(fā)現(xiàn)，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，有4處發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成4個(gè)小的和一個(gè)大的環(huán)形單鏈區(qū)，端粒DNA的模板RNA即位于此區(qū)內(nèi).端粒的延長(zhǎng)即通過該區(qū)與端粒DNA結(jié)合后進(jìn)一步完成⑹.1995年，Greider等在四膜蟲中分離出兩種端粒酶蛋白亞單位p80和p95,并且克隆出它們的基因.1997年在人、小鼠、大鼠中也克隆了四膜蟲p80的同源物，在人與小鼠中稱為TP1,在大鼠中稱為TLP1.TP1和TLP1有一與p80同源的結(jié)構(gòu)域，位于氨基末端，這正是與TR特異性結(jié)合的部位.對(duì)TP1和TLP1的mRNA的表達(dá)并不限于有端粒酶活性的組織和細(xì)胞系，各組織間的水平差異與端粒酶活性無關(guān).因此，端粒酶活性的表達(dá)并不是由這一部分決定的⑹.端粒酶的TERT組分最先在游仆蟲中被鑒定出，隨后在包括人、老鼠、裂殖酵母、芽殖酵母等有機(jī)體內(nèi)都檢測(cè)到了端粒酶催化亞基活性的存在并克隆出了它們的TERT基因.端粒酶的催化亞基從游仆蟲到酵母到人結(jié)構(gòu)都非常保守，它們都含有端粒酶特有基元T和7個(gè)保守的反轉(zhuǎn)錄酶基元.端粒酶催化亞基中氨基酸的保守性對(duì)端粒酶發(fā)揮其正常的功能起重要作用.1999年研究清楚了人類hTERT(Humantelomerasereversetranscriptase)的基因結(jié)構(gòu)⑼.它超過37kD,并且由16個(gè)外顯子組成，制造127kD的hTERT和一個(gè)新的斷裂變異體.轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)在hTERT的cDNA首位核苷酸上游19bp處.啟動(dòng)子區(qū)域不包含TATA和CAAT盒，結(jié)構(gòu)是富含GC的CpG島，并包括由ATG起始密碼上游的1100bp,其核心啟動(dòng)子有181bp,包括一個(gè)c-myc結(jié)合點(diǎn)，E—盒(CACGTG)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄子Sp1.體外轉(zhuǎn)化研究證實(shí)hTERT在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是一個(gè)直接的途徑.與P123(游仆蟲)、Est2P(芽殖酵母)和Tri1P(裂殖酵母)端粒酶的催化亞基進(jìn)行序列分析和比較，hTERT在保守區(qū)域和它們具有廣泛的序列一致性(46%~49%).所有這些端粒酶催化亞基都具有逆轉(zhuǎn)錄酶的共同結(jié)構(gòu)即7個(gè)蛋白質(zhì)域⑽以及端粒酶催化亞基獨(dú)特的保守區(qū)域，稱為T模體，位于多肽的中間和7個(gè)保守的逆轉(zhuǎn)錄模板(RT)的上游，去除T模體(560FFYVTE565)或單個(gè)氨基酸變異(如F561A)會(huì)顯著降低端粒酶活性以及與TR的結(jié)合能力⑹.另外，在延長(zhǎng)的N末端區(qū)，還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)端粒酶特異性結(jié)構(gòu)T2模體，對(duì)T2模體的單個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行選擇性變異，同樣也會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性喪失(11).最近發(fā)現(xiàn)存在hTERT-mRNA的不同剪接體?.HTERTa剪接體在逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域A內(nèi)丟失12個(gè)氨基酸，hTERTdeta剪接體在逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域B上游丟失182個(gè)堿基，造成下游的移碼突變.另外一剪接體編碼變異竣基.重組實(shí)驗(yàn)表明只有完整的hTERT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物才表達(dá)端粒酶活性.在人組織器官發(fā)育過程中，這些剪接體可能替代全長(zhǎng)hTERT,改變端粒酶活性.不同的hTERT蛋白也有可能組成一系列端粒酶全酶，在細(xì)胞分化不同階段發(fā)揮不同的生理功能.在大多數(shù)情況下，hTERT的表達(dá)是端粒酶活性表達(dá)的限速步驟.四.端粒的復(fù)制通過對(duì)四膜蟲DNA端粒合成的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA端粒復(fù)制時(shí)，端粒酶催化逆向轉(zhuǎn)錄作用，以酶中的RNA為模板，端粒的單鏈3,—OH為引物，不斷進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成，延伸3,-OH端單鏈。在合成一個(gè)拷貝的重復(fù)序列后，新合成的TG鏈回折并借非標(biāo)準(zhǔn)堿基配

對(duì)(G—G)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而調(diào)整了端粒酶的位置，使逆轉(zhuǎn)錄能繼續(xù)下去。當(dāng)3'一OH單鏈延伸到一定長(zhǎng)度，3’一OH端作180#回轉(zhuǎn)，這時(shí)3′一OH單鏈又作為DNA聚合酶的引物,再以DNA中富含G、T鏈為模板，合成互補(bǔ)的富含C、A的DNA片段，以填補(bǔ)在DNA末端復(fù)制時(shí)，因RNA引物被水解后留下的空隙?。最后在新合成的DNA5端切去12口16個(gè)核苷酸，形成完整的DNA末端結(jié)構(gòu)(圖四)圖四、端粒合稱的一種模式此處還附有端粒復(fù)制的視頻連接Telomere_Replication.f4V六.端粒結(jié)合蛋白與調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度的機(jī)制在端粒DNA的重復(fù)序列上結(jié)合著多種蛋白質(zhì)，它們具有保護(hù)端粒的結(jié)構(gòu)，影響端粒附近的基因表達(dá)以及參與調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度等功能。通過研究發(fā)現(xiàn)人和某些酵母細(xì)胞都含有參與調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度的端粒結(jié)合蛋白。在人細(xì)胞中，有一種特殊的端粒結(jié)合蛋白TRF1(telomericrepeatbindingfactorl)參與調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度。它是一種60kD的雙鏈端粒DNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞分裂間期結(jié)合的端粒DNA上，而在分裂中期結(jié)合在染色體的末端。在含有端粒酶活性的細(xì)胞中,TRF1過度表達(dá)使端粒的長(zhǎng)度縮短。抑制TRF1的表達(dá)，使端粒DNA上結(jié)合的TRF1的數(shù)目下降能延長(zhǎng)端粒的長(zhǎng)度。TRF1不能控制端粒酶的表達(dá)，而是通過抑制端粒酶的活性調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度，故TRF1是端粒酶延長(zhǎng)端粒的負(fù)調(diào)控子。人的纖維肉瘤細(xì)胞HT1080含有端粒酶活性，而且端粒的長(zhǎng)度穩(wěn)定。Lange等用這種細(xì)胞構(gòu)建了TRF1的表達(dá)系統(tǒng),通過誘導(dǎo)使HT1080細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的過度表達(dá)TRF1,在其端粒上結(jié)合有更多的TRF1,結(jié)果引起該細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度逐漸縮短。如果誘導(dǎo)負(fù)顯性突變的TRF1,抑制內(nèi)源性TRF1與端粒序列結(jié)合,就能延長(zhǎng)端粒的長(zhǎng)度。在芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)中有一種端粒結(jié)合蛋白R(shí)aplp,其端粒的長(zhǎng)度與端粒結(jié)合的這種蛋白質(zhì)分子數(shù)目的多少有關(guān)。Raplp突變或改變其表達(dá)的水平均能引起端粒長(zhǎng)度的變化。這種蛋白質(zhì)也是端粒酶活性的負(fù)調(diào)控子。在裂殖酵母(Schizoblastosporionpombe)中的端粒結(jié)合蛋白Tazlp抑制端粒酶的活性并且能調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度，tazl+基因的缺失或破壞都能使端粒序列延長(zhǎng)。由上述看出，三種端粒結(jié)合蛋白TRF1、Raplp及Tazlp都能調(diào)節(jié)端粒酶的活性與端粒的長(zhǎng)度。通過免疫螢光標(biāo)記研究證明，與端粒結(jié)合的TRF1是沿TTAGGG重復(fù)序列依次排列的。人們通過分析總結(jié)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提出了端粒長(zhǎng)度調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)計(jì)數(shù)模型——即雙鏈端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)目調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度的反饋抑制機(jī)制。TRF1等調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度的端粒結(jié)合蛋白沿著端粒DNA鏈重復(fù)排列，當(dāng)端粒上結(jié)合的TRF1達(dá)到一個(gè)臨界數(shù)目時(shí)，就產(chǎn)生抑制端粒酶活性的信號(hào)并終止延長(zhǎng)端粒的過程；如果因染色體DNA不完全復(fù)制，核酸外切酶降解或者發(fā)生重組，引起端粒的長(zhǎng)度縮短，與端粒結(jié)合的TRF1也相應(yīng)減少。當(dāng)結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)目少于端粒結(jié)合蛋白質(zhì)的臨界數(shù)目時(shí),就重新激活端粒酶的活性,使端粒再次延長(zhǎng)到特定長(zhǎng)度。當(dāng)端粒DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)目又重新達(dá)到臨界數(shù)目時(shí)，再次抑制端粒酶的活性。如此循環(huán)下去，從而使癌細(xì)胞等具有端粒酶活性的細(xì)胞維持穩(wěn)定的端粒長(zhǎng)度。?參考文獻(xiàn)：⑴李學(xué)紅，李冬玲，宋雨青，苑金香“DNA的末端終止”生物學(xué)教學(xué)2000年(25卷)第一期⑵馬永紅，喬軍.端粒生物學(xué)與細(xì)胞衰老J].生物技術(shù)通報(bào)，2000,16(4)：54-56.⑶GreiderC，BlackburnE．Identificationofaspecifictelomerete