蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)示例蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)示例2一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸（相似性）

一級結(jié)構(gòu)：肽鏈（氨基酸序列）

二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲

超二級結(jié)構(gòu)：（αα），（βαβ），（βββ）

結(jié)構(gòu)域：相對獨(dú)立的三維實(shí)體

三級結(jié)構(gòu)：亞基

四級結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)

（自發(fā)的熵驅(qū)動過程）

結(jié)構(gòu)單位間的相互作用肽鍵、氫鍵、范德華力、疏水作用、二硫鍵

一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸（相似性）

3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件4一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件6二級結(jié)構(gòu)分析α-螺旋二級結(jié)構(gòu)分析α-螺旋7α-螺旋結(jié)構(gòu)α-螺旋結(jié)構(gòu)8

9蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件10超二級結(jié)構(gòu)示例（βββ）超二級結(jié)構(gòu)示例（βββ）11三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)12蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件13蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件14蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件15蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件16蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件17二蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，其理化性質(zhì)一部分與氨基酸相似，如兩性電離、等電點(diǎn)、呈色反應(yīng)、成鹽反應(yīng)等，也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、膠體性、變性等。二蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，18（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

1蛋白質(zhì)分子量頗大，介于一萬到百萬之間，故其分子的大小已達(dá)到膠粒1～100nm范圍之內(nèi)。球狀蛋白質(zhì)的表面多親水基團(tuán)，具有強(qiáng)烈地吸引水分子作用，使蛋白質(zhì)分子表面常為多層水分子所包圍，稱水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。

（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1蛋白質(zhì)分子量頗大，介192蛋白質(zhì)是一類大分子的膠體物質(zhì)，分子量很大，可以達(dá)到數(shù)百萬，甚至千萬以上，少數(shù)蛋白質(zhì)己能制成晶態(tài)。多數(shù)可溶于水，生成膠體溶液。三氯醋酸、鞣酸、醋酸鉛、鎢酸鈉、苦味酸以及多數(shù)重金屬鹽等的水溶液，均能使蛋白質(zhì)由水溶液中沉淀析出．實(shí)驗(yàn)室中往往能利用這些沉淀試劑，尤其常用三氯醋酸由中草藥的水浸液中，以制取純潔的蛋白質(zhì)．蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件20（二）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸分子中具有不同的基團(tuán)以及肽鍵，蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生一些顏色反應(yīng)，供檢識用。（二）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)211．蛋白黃反應(yīng)蛋白質(zhì)以濃硝酸處理或共熱即顯黃色加堿堿化后轉(zhuǎn)為橙黃色，是由于苯環(huán)的硝基化反應(yīng)生成硝基苯衍生物所致．蛋白質(zhì)的組成中，如果包含苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸均能呈現(xiàn)蛋白黃反應(yīng)。2．Millon反應(yīng)蛋白質(zhì)遇Millon試劑(金屬汞溶于發(fā)煙硝酸中加水稀釋所成，是亞硝酸汞、硝酸汞，亞硝酸及硝酸的混合溶液．)或共熱能呈紅色，證明蛋白質(zhì)分子中有酪氨酸的組成部分．因?yàn)榉宇惢衔锾貏e是對位取代的酚類，遇到含有硝酸汞的亞硝酸溶液，不論在冷或微熱的情況下，可產(chǎn)生紅色或黃色沉淀，此沉淀能溶于硝酸中生成紅色溶液．1．蛋白黃反應(yīng)223．雙縮脲反應(yīng)由于蛋白質(zhì)分子中的許多肽鍵即酰氨基，當(dāng)其在堿性水溶液中遇少量硫酸銅溶液時，即顯紫色或紫紅色．4．Hopkins—Cole反應(yīng)將含有微量乙醛酸的濃硫酸滴人蛋白質(zhì)溶液中，能呈顯紫色，或者于蛋白質(zhì)和乙醛酸的混合溶液中，徐徐加入濃硫酸使層集于混液的下面，在二層交界面有紫色環(huán)出現(xiàn)．此當(dāng)由于吲喋衍生物與乙醛酸縮合所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)．蛋白質(zhì)分子中包含有色氨酸時，能給予正反應(yīng)3．雙縮脲反應(yīng)235；苯駢戊三酮(ninhydrin)反應(yīng)將蛋白質(zhì)的中性落液與苯駢戊三酮水溶液(1:400)1—2滴混合并加熱放冷后，即產(chǎn)生藍(lán)色，說明蛋白質(zhì)分子中有α-位氨基存在，參見30頁，6．重氮化反應(yīng)于蛋白質(zhì)水溶液中加入少量稀碳酸鈉溶液使呈堿性反應(yīng)，再滴加重氮化苯磺酸試劑數(shù)滴，如果混液呈顯櫻紅色，說明蛋白質(zhì)分子中有酪氨酸或色氨酸為其組成部分，生成了偶氮衍生物致能顯色5；苯駢戊三酮(ninhydrin)反應(yīng)247.亞硝酸反應(yīng)于蛋白質(zhì)水溶液中加入30%氫氧化鈉溶液I毫升及1.25%甲醛溶液1滴和濃鹽酸10毫升，10分鐘后，再加0.05%亞硝酸鈉溶液5—7滴，如果溶液變?yōu)樽霞t色，說明蛋白質(zhì)分子中有色氨酸存在．8．硫的反應(yīng)如果蛋白質(zhì)分子中含有半胱氨酸或蛋氨酸等含硫氨基酸的組成部分，當(dāng)與堿及醋酸鉛共熱時，則由于分子中的硫鍵被分解生成疏離子，遇鉛鹽即產(chǎn)生黑色硫化鉛沉淀．7.亞硝酸反應(yīng)259．Sakaguchi反應(yīng)于中性或微堿性的蛋白質(zhì)水溶液中加α—萘酚的稀氫氧化鈉溶液(0.1克α—萘酚溶解于0.5%NaOH水溶液100毫升中)，混勻后滴加1％次亞氯酸鈉溶液數(shù)滴(避免過量)，如果出現(xiàn)紅色反應(yīng)，說明蛋白質(zhì)分子中含有精氨酸的組成部分．10．丹?；磻?yīng)(Dansylreaction)蛋白質(zhì)或肽類分子中末端氨基酸部分中的氨基在有碳酸氫鈉溶液存在的情況下，易與1—二甲氨基萘5—磺酰氯反應(yīng)生成相應(yīng)的磺酰胺衍生物，而具有強(qiáng)烈的黃色螢光(在紫外光燈下觀察)，雖蛋白質(zhì)含量少至0.1一0.001mμM時，螢光也易于檢識。9．Sakaguchi反應(yīng)26（三）蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。

（三）蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，27■環(huán)境影響分子的帶電性質(zhì)■環(huán)境影響分子的帶電性質(zhì)28等

電

點(diǎn)pI=5pH=4pH=6環(huán)境-+--++環(huán)境000凝聚■

等電點(diǎn)與環(huán)境

pH的關(guān)係：

等電點(diǎn)pI=5pH=4pH=6環(huán)-+--++29（四）蛋白質(zhì)的變性

天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，如酶失去催化活力，激素喪失活性稱之為蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)。變性蛋白質(zhì)只有空間構(gòu)象的破壞，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級鍵，二硫鍵的破壞，并不涉及一級結(jié)構(gòu)的變化。

（四）蛋白質(zhì)的變性天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因30蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件31變性蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)最明顯的區(qū)別是溶解度降低，同時蛋白質(zhì)的粘度增加，結(jié)晶性破壞，生物學(xué)活性喪失，易被蛋白酶分解。變性并非是不可逆的變化，當(dāng)變性程度較輕時，如去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為復(fù)性。許多蛋白質(zhì)變性時被破壞嚴(yán)重，不能恢復(fù)，稱為不可逆性變性。變性蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)最明顯的區(qū)別是溶解度降低，同時蛋白質(zhì)的32引起蛋白質(zhì)變性的原因物理和化學(xué)因素物理因素可以是加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波的作用等；化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。在臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用于消毒及滅菌。反之，注意防止蛋白質(zhì)變性就能有效地保存蛋白質(zhì)制劑。

引起蛋白質(zhì)變性的原因物理和化學(xué)因素33（五）蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)，變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。（五）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋34

1引起蛋白質(zhì)沉淀的主要方法(一)鹽析(SaltingOut)

(二)重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)

(三)生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)(四)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)(五)加熱凝固（六）等電點(diǎn)

1引起蛋白質(zhì)沉淀的主要方法(一)鹽析(Salt35蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件36總結(jié)點(diǎn)擊顯示生物化學(xué)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)總結(jié)37蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次38蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)示例蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)示例39一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸（相似性）

一級結(jié)構(gòu)：肽鏈（氨基酸序列）

二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲

超二級結(jié)構(gòu)：（αα），（βαβ），（βββ）

結(jié)構(gòu)域：相對獨(dú)立的三維實(shí)體

三級結(jié)構(gòu)：亞基

四級結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)

（自發(fā)的熵驅(qū)動過程）

結(jié)構(gòu)單位間的相互作用肽鍵、氫鍵、范德華力、疏水作用、二硫鍵

一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸（相似性）

40蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件41一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)42蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件43二級結(jié)構(gòu)分析α-螺旋二級結(jié)構(gòu)分析α-螺旋44α-螺旋結(jié)構(gòu)α-螺旋結(jié)構(gòu)45

46蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件47超二級結(jié)構(gòu)示例（βββ）超二級結(jié)構(gòu)示例（βββ）48三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)49蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件50蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件51蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件52蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件53蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件54二蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，其理化性質(zhì)一部分與氨基酸相似，如兩性電離、等電點(diǎn)、呈色反應(yīng)、成鹽反應(yīng)等，也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、膠體性、變性等。二蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，55（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

1蛋白質(zhì)分子量頗大，介于一萬到百萬之間，故其分子的大小已達(dá)到膠粒1～100nm范圍之內(nèi)。球狀蛋白質(zhì)的表面多親水基團(tuán)，具有強(qiáng)烈地吸引水分子作用，使蛋白質(zhì)分子表面常為多層水分子所包圍，稱水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。

（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1蛋白質(zhì)分子量頗大，介562蛋白質(zhì)是一類大分子的膠體物質(zhì)，分子量很大，可以達(dá)到數(shù)百萬，甚至千萬以上，少數(shù)蛋白質(zhì)己能制成晶態(tài)。多數(shù)可溶于水，生成膠體溶液。三氯醋酸、鞣酸、醋酸鉛、鎢酸鈉、苦味酸以及多數(shù)重金屬鹽等的水溶液，均能使蛋白質(zhì)由水溶液中沉淀析出．實(shí)驗(yàn)室中往往能利用這些沉淀試劑，尤其常用三氯醋酸由中草藥的水浸液中，以制取純潔的蛋白質(zhì)．蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及檢測課件57（二）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸分子中具有不同的基團(tuán)以及肽鍵，蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生一些顏色反應(yīng)，供檢識用。（二）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)581．蛋白黃反應(yīng)蛋白質(zhì)以濃硝酸處理或共熱即顯黃色加堿堿化后轉(zhuǎn)為橙黃色，是由于苯環(huán)的硝基化反應(yīng)生成硝基苯衍生物所致．蛋白質(zhì)的組成中，如果包含苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸均能呈現(xiàn)蛋白黃反應(yīng)。2．Millon反應(yīng)蛋白質(zhì)遇Millon試劑(金屬汞溶于發(fā)煙硝酸中加水稀釋所成，是亞硝酸汞、硝酸汞，亞硝酸及硝酸的混合溶液．)或共熱能呈紅色，證明蛋白質(zhì)分子中有酪氨酸的組成部分．因?yàn)榉宇惢衔锾貏e是對位取代的酚類，遇到含有硝酸汞的亞硝酸溶液，不論在冷或微熱的情況下，可產(chǎn)生紅色或黃色沉淀，此沉淀能溶于硝酸中生成紅色溶液．1．蛋白黃反應(yīng)593．雙縮脲反應(yīng)由于蛋白質(zhì)分子中的許多肽鍵即酰氨基，當(dāng)其在堿性水溶液中遇少量硫酸銅溶液時，即顯紫色或紫紅色．4．Hopkins—Cole反應(yīng)將含有微量乙醛酸的濃硫酸滴人蛋白質(zhì)溶液中，能呈顯紫色，或者于蛋白質(zhì)和乙醛酸的混合溶液中，徐徐加入濃硫酸使層集于混液的下面，在二層交界面有紫色環(huán)出現(xiàn)．此當(dāng)由于吲喋衍生物與乙醛酸縮合所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)．蛋白質(zhì)分子中包含有色氨酸時，能給予正反應(yīng)3．雙縮脲反應(yīng)605；苯駢戊三酮(ninhydrin)反應(yīng)將蛋白質(zhì)的中性落液與苯駢戊三酮水溶液(1:400)1—2滴混合并加熱放冷后，即產(chǎn)生藍(lán)色，說明蛋白質(zhì)分子中有α-位氨基存在，參見30頁，6．重氮化反應(yīng)于蛋白質(zhì)水溶液中加入少量稀碳酸鈉溶液使呈堿性反應(yīng)，再滴加重氮化苯磺酸試劑數(shù)滴，如果混液呈顯櫻紅色，說明蛋白質(zhì)分子中有酪氨酸或色氨酸為其組成部分，生成了偶氮衍生物致能顯色5；苯駢戊三酮(ninhydrin)反應(yīng)617.亞硝酸反應(yīng)于蛋白質(zhì)水溶液中加入30%氫氧化鈉溶液I毫升及1.25%甲醛溶液1滴和濃鹽酸10毫升，10分鐘后，再加0.05%亞硝酸鈉溶液5—7滴，如果溶液變?yōu)樽霞t色，說明蛋白質(zhì)分子中有色氨酸存在．8．硫的反應(yīng)如果蛋白質(zhì)分子中含有半胱氨酸或蛋氨酸等含硫氨基酸的組成部分，當(dāng)與堿及醋酸鉛共熱時，則由于分子中的硫鍵被分解生成疏離子，遇鉛鹽即產(chǎn)生黑色硫化鉛沉淀．7.亞硝酸反應(yīng)629．Sakaguchi反應(yīng)于中性或微堿性的蛋白質(zhì)水溶液中加α—萘酚的稀氫氧化鈉溶液(0.1克α—萘酚溶解于0.5%NaOH水溶液100毫升中)，混勻后滴加1％次亞氯酸鈉溶液數(shù)滴(避免過量)，如果出現(xiàn)紅色反應(yīng)，說明蛋白質(zhì)分子中含有精氨酸的組成部分．10．丹?；磻?yīng)(Dansylreaction)蛋白質(zhì)或肽類分子中末端氨基酸部分中的氨基在有碳酸氫鈉溶液存在的情況下，易與1—二甲氨基萘5—磺酰氯反應(yīng)生成相應(yīng)的磺酰胺衍生物，而具有強(qiáng)烈的黃色螢光(在紫外光燈下觀察)，雖蛋白質(zhì)含量少至0.1一0.001mμM時，螢光也易于檢識。9．Sakaguchi反應(yīng)63（三）蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。

（三）蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，64■環(huán)境影響分子的帶電性質(zhì)■環(huán)境影響分子的帶電性質(zhì)65等

電

點(diǎn)pI=5pH=4pH=6環(huán)境-+--++環(huán)境000凝聚■

等電點(diǎn)與環(huán)境

pH的關(guān)係：

等電點(diǎn)pI=5pH=4pH=6環(huán)-+--++66（四）蛋白質(zhì)的變性

天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，如酶失去催化活力，激素喪失活性稱之為蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)。變性蛋白質(zhì)只有空間構(gòu)象的破壞，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級鍵，二