液相色譜培訓講義課件

液相色譜培訓講義北京東西分析儀器有限公司液相色譜培訓講義北京東西分析儀器有限公司1主要內(nèi)容高效液相色譜的基礎知識高效液相色譜系統(tǒng)固定相和流動相LC-5500的使用、維護及應用液相色譜分析中的樣品前處理主要內(nèi)容高效液相色譜的基礎知識2高效液相色譜的基礎知識——液相色譜培訓（一）高效液相色譜的基礎知識——液相色譜培訓（一）3色譜色譜法▲又叫色層法、層析法，其本質(zhì)是一種分離分析方法

▲色譜法是利用混合物中各組分在兩相間分布系數(shù)的差異，在兩相相對移動過程中，各物質(zhì)在兩相間反復多次分配，從而使各組分得到分離的方法色譜目前最有效的分離方法色譜色譜法4色譜的分類●按流動相的物態(tài)分:▲氣相色譜(GasChromatography,GC)用氣體作為流動相(又叫載氣)

▲液相色譜(LiquidChromatography,LC)用液體作為流動相(又叫洗脫劑)色譜的分類●按流動相的物態(tài)分:5液相色譜發(fā)展簡史1903年：俄國植物學家Tswett提出了應用吸附學原理分離植物色素的新方法，標志這現(xiàn)代色譜學的開始1931年：Kuhn等以粉碎的碳酸鈣裝填色譜柱，成功地從蛋黃中分離出植物葉黃素，也證實了色譜法可以用于制備分離1941年：Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含乙醇的氯仿為流動相，分離了乙?；被幔@是分配色譜的首次應用20世紀60年代：高效液相色譜得到普及應用1975年：美國DowChemical公司Small等研制成功了采用電導檢測器的高效液相色譜儀，這種方法稱為離子色譜法（IC），擴展了高效液相色譜的領域。近年來：超高壓液相色譜（UPLC）問世，使得液相色譜應用領域更加廣泛液相色譜發(fā)展簡史1903年：俄國植物學家Tswett提出了應6茨維特實驗的原形●1903年Tswett用右邊圖示的實驗裝置，使用液體淋洗的辦法實現(xiàn)了多種物質(zhì)的分離從而確立了色譜分析法。從此這個實驗方法就成為：

經(jīng)典液相色譜法

時至今日這種方法還被廣泛地應用著●隨著科學技術的發(fā)展，科學工作者改進了液相色譜柱的填料，從而就出現(xiàn)了高效液相色譜分析。●幾種英文縮寫的解釋：HPLC－HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC－HighPressureLiquidChromatography茨維特實驗的原形●1903年Tswett用右邊圖示的實驗裝置7高效液相色譜★HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)★以氣相色譜為基礎，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術基礎上建立的一種液相色譜法。是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段：

o高性能色譜柱，高精度輸液泵，高靈敏度檢測器…★廣泛應用于各個領域:

o醫(yī)藥，環(huán)保，石化，生命科學，食品工業(yè)，農(nóng)業(yè)…高效液相色譜★HPLC(HighPerformance8HPLC的分離原理高效液相色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相(stationaryphase)時，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、離子交換、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。HPLC的分離原理高效液相色譜法的分離原理是：溶于流動相(m9流動相色譜分離樣品的過程流動相色譜分離樣品的過程10HPLC的特點“三高”“一快”“一廣”高柱效高靈敏度高選擇性分析速度快應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）HPLC的特點“三高”“一快”“一廣”11HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別分析對象

GC：可分析能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品

HPLC：可分析溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測流動相GC：流動相為氣體HPLC：流動相為液體HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測12HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典LCHPLC色譜柱：柱長10~200cm，內(nèi)徑10~50mm色譜柱：柱長10~25cm，內(nèi)徑2~10mm常壓或減壓高壓，40~50MPa填料顆粒大，75~600m（200~30目）填料顆粒小，2~50m（2500~300目）柱效低，20~50塊/m柱效高，40000~60000塊/m分析速度慢，1~20h分析速度快，0.05~1.0h色譜柱只用一次色譜柱可重復多次使用不能在線檢測能在線檢測HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典LCHPLC色譜柱：柱長10~2013基本概念和術語色譜圖和峰參數(shù)★色譜圖(chromatogram)--樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)?！锘€(baseline)--經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸?！镌胍?noise)--基線信號的波動。★漂移(drift)--基線隨時間的緩緩變化。★色譜峰(peak)--組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。檢測器響應保留時間和峰形檢測器響應保留時間和峰形檢測器響應保留時間和峰形基本概念和術語色譜圖和峰參數(shù)檢測器響應保留時間和峰形檢測器14色譜圖基底基線色譜峰峰面積峰高色譜圖基底基線色譜峰峰面積峰高15★拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)?！吨袊幍洹芬?guī)定T應為0.95～1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰?！锓宓祝€上峰的起點至終點的距離?！锓甯?peakheight，h)-峰的最高點至峰底的距離。★標準偏差（standarddeviation，σ)-正態(tài)分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低?！锓鍖挘╬eakwidth，W)-峰兩側拐點處所作兩條切線與峰底的兩個交點間的距離。W＝4σ★半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ★峰面積(peakarea，A)-峰與峰底所包圍的面積。基本概念和術語★拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色譜16基本概念和術語定性參數(shù)（保留值）★死時間(deadtime，t0)--不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間?！锼荔w積(deadvolume，V0)--由進樣器進樣口到檢測器流通池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流通池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）★保留時間(retentiontime，tR)--從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。

★保留體積(retentionvolume，VR)--從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR基本概念和術語定性參數(shù)（保留值）17柱效參數(shù)★理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)---用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計算理論塔板數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用調(diào)整保留時間(tR’)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效)?！锢碚撍甯叨?theoreticalplateheight，H)---每單位柱長的方差。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算?；靖拍詈托g語柱效參數(shù)基本概念和術語18基本概念和術語相平衡參數(shù)★分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)--在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。即，K=Cs/Cm

分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質(zhì)有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。

在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的?；靖拍詈托g語相平衡參數(shù)19基本概念和術語★容量因子(capacityfactor，k)--化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（tR）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，tR

＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。

容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質(zhì)及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于tR

、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應用更廣泛。★選擇性因子(selectivityfactor，α)--相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。

要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異?；靖拍詈托g語★容量因子(capacityfactor，k20基本概念和術語分離參數(shù)★分離度(resolution，R)--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。當W1＝W2時，R＝1。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離。

中國藥典規(guī)定R應大于1.5。

提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動相的組成及pH值；b.改變柱溫；c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k趨于0時，R也趨于0；k增大，R也增大。但k不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k在1～10范圍內(nèi)，最好為2～5，窄徑柱可更小些。R=1R=1.5基本概念和術語分離參數(shù)R=1R=1.521色譜分離的理論色譜理論有平衡色譜理論；塔板理論；速率理論等理論。下面對塔板理論和速率理論作簡單的介紹。色譜分離的理論色譜理論有平衡色譜理論；22塔板理論(TowerplankTheories)●塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：

※色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達到分配平衡?！鶚悠芳釉诘?號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略?！鲃酉嘣谏V柱內(nèi)間歇式流動，每次進入一個塔板體積?！谒兴迳戏峙湎禂?shù)相等，與組分的量無關。●雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態(tài)過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。塔板理論(TowerplankTheories)●塔板理23理論塔板數(shù)色譜柱效能

描述當溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時譜帶展寬速率理論塔板等效高度有效理論塔板數(shù)塔板理論(TowerplankTheories)理論塔板數(shù)色譜柱效能理論塔板等效高度有效理論塔板數(shù)塔24速率理論(VelocityTheories)1956年荷蘭學者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響速率理論(VelocityTheories)1956年荷蘭25速率理論(VelocityTheories)H=A+B/u+Cgu+CluHuB/uCuAu最佳A－渦流擴散項B－分子擴散項Cg－固定相傳質(zhì)阻抗Cl－流動相傳質(zhì)阻抗速率理論(VelocityTheories)H=A+26高效液相色譜的分類●按色譜過程的分離機制，可將高效液相色譜分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、離子對色譜和體積排阻色譜等類別●根據(jù)流動相與固定相極性的差別，可分為正相色譜和反相色譜兩種模式。固定相極性大于流動相極性時，稱為正相色譜（NP）；反之，稱為反相色譜（RP）高效液相色譜的分類●按色譜過程的分離機制，可將高效液相色譜分27正相高效液相色譜以極性的親水性填料作固定相（如羥基柱、氨基柱、氰基柱），以非極性的疏水性溶劑或混合物作流動相（如己烷）的高效液相色譜正相高效液相色譜的流動相：常用己烷，環(huán)己烷作基礎溶劑，加二氯甲烷、短鏈醇、四氫呋喃調(diào)節(jié)極性應用于分離中等極性和極性較強的化合物，如甾醇類、類脂化合物、磷脂化合物、脂肪酸及其它有機物正相高效液相色譜以極性的親水性填料作固定相（如羥基柱、氨基柱28反相高效液相色譜以強疏水性的填料作固定相（如硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相），以可以和水混溶的有機溶劑做流動相（如甲醇、乙腈）的高效液相色譜反相高效液相色譜的流動相：高純度的水，甲醇，乙腈，一定pH值的緩沖液應用十分廣泛，占高效液相色譜的70%~80%，從一般小分子有機物到藥物、農(nóng)藥、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量不大的蛋白質(zhì)（50kD）的分析均可應用反相高效液相色譜以強疏水性的填料作固定相（如硅膠上鍵合C1829高效液相色譜流程圖高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱儲液瓶高效液相色譜流程圖高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱儲液瓶30色譜分離樣品的過程色譜柱檢測器色譜圖時刻A時刻B時刻C時刻D時刻E時刻F進樣色譜分離樣品的過程色譜柱檢測器色譜圖時刻A時刻B時刻31色譜圖的作用◆說明樣品中的組分數(shù)◆根據(jù)保留時間值定性◆根據(jù)峰面積（峰高）定量◆評價柱效及分離情況色譜圖的作用◆說明樣品中的組分數(shù)32定性和定量方法●死時間t0，保留時間tR●峰高h，峰面積A基線峰底色譜峰峰高峰面積定性和定量方法●死時間t0，保留時間tR●峰高h，峰面積A基33利用保留值定性在液相色譜中，組分的保留行為不僅與固定相有關，還與流動相的種類、組成有關在液相色譜中主要是用與已知物對照的方法定性，改變條件進一步判斷利用文獻數(shù)據(jù)只能作為參考利用三維圖譜進行定性，可靠性大大增加利用保留值定性在液相色譜中，組分的保留行為不僅與固定相有關，34用保留時間定性的譜圖對比三聚氰胺標樣蛋白粉樣品用保留時間定性的譜圖對比三聚氰胺標樣蛋白粉樣品35定量方法※峰高和峰面積法定量，主要有四種定量方法歸一化法內(nèi)標法外標法-標準曲線法內(nèi)加法定量方法※峰高和峰面積法定量，主要有四種定量方法36外標法－液相最常用的定量方法外標法－液相最常用的定量方法37峰高法和峰面積法的選擇主要決定于檢測器的線性范圍、峰高和峰面積測量的準確性和重復性。歸一化法最好用峰面積法，其余方法峰高和峰面積都可使用分離度較好，色譜峰形較好，峰面積可以準確測量時，用峰面積定量為好，特別是HPLC使用多元梯度時，最好用峰面積定量分離度不好、色譜峰形不好時，用峰高法為好保留時間短的用峰高法，長的用峰面積法峰高法和峰面積法的選擇主要決定于檢測器的線性范圍、峰高和峰面38高效液相色譜系統(tǒng)——液相色譜培訓（二）高效液相色譜系統(tǒng)——液相色譜培訓（二）39高效液相色譜流程圖高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱儲液瓶高效液相色譜流程圖高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱儲液瓶40一個存放流動相的容器。其結構材料必須對流動相是化學惰性的，常用的溶劑儲液瓶的材料應耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料、特種塑料聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯襯里不銹鋼容器等，貯液罐容積一般為0.5～2L儲液瓶一個存放流動相的容器。其結構材料必須對流動相是化學惰性的，41輸液系統(tǒng)功能：溶劑輸送目標：穩(wěn)定準確重要指標：耐壓能力壓力脈動流量精密度流量準確性高壓輸液泵柱雙柱塞往復式并聯(lián)泵柱雙柱塞往復式串聯(lián)泵輸液系統(tǒng)功能：目標：重要指標：高壓輸液泵柱雙柱塞往復式并聯(lián)泵42進樣器自動進樣器和手動進樣器原理：六通閥進樣器自動進樣器和手動進樣器43手動進樣器－六通閥一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好，操作方便手動進樣器－六通閥一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rh44分離系統(tǒng)功能：組分分離目標：分辨力強效率高色譜柱液相色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，是分析好壞、成敗的關鍵分離系統(tǒng)功能：目標：色譜柱液相色譜柱是高效液相色譜儀的核心部45鍵合相色譜柱鍵合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;苯基柱<5%,正相:20%;硅膠、-NH2、-CN、-OH其它(手性柱,離子交換柱):10%反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18和C8在反相色譜中應用得最為廣泛。鍵合相色譜柱鍵合相:46檢測器功能：檢測組分濃度目標：準確檢出限低重要指標：噪聲、漂移、線性、檢出限紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）熒光檢測器示差折光檢測器電導檢測器蒸發(fā)光散射檢測器檢測器功能：目標：重要指標：紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器47原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎：朗伯-比耳定律，A＝εCL優(yōu)點：1）靈敏度高2）對溫度和流速不敏感3）可用于梯度洗提缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)紫外檢測器原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收紫外檢測器48

樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處得到一吸光度值二極管陣列檢測器樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處49二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器501）采集三維譜圖2）峰純度檢驗3）光譜庫檢索4）可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰二極管陣列檢測器的優(yōu)點1）采集三維譜圖二極管陣列檢測器的優(yōu)點51大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，所以紫外-可見檢測器可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器

--多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外-可見檢測器，25%是PDA）紫外-可見檢測器大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，所以紫外-可見檢測器可以52原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測優(yōu)點：1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測器之一2）選擇性好3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對稱共軛體系）熒光檢測器原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測熒光檢測器53原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。優(yōu)點：通用型檢測器，缺點：1）對溫度變化敏感2）對溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測3）屬于中等靈敏度的檢測器示差折光檢測器原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。示差54原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導變化來測定電離物質(zhì)含量。廣泛應用于離子色譜法優(yōu)點：對流動相流速和壓力的改變不敏感，可用于梯度洗脫缺點：對溫度變化敏感（每升高1度，電導率增加2%-2.5%)主要用于離子色譜檢測水溶性無機和有機離子電導檢測器原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導變化來測定電離物55蒸發(fā)激光光散射檢測器（ELSD）通用型檢測器（適合于揮發(fā)性比流動相低的任何組分）；響應值與組分質(zhì)量有關；可用于梯度洗脫HPLC柱噴霧氣體蒸發(fā)漂移管激光光源樣品液滴光二極管檢測器散射室蒸發(fā)激光光散射檢測器（ELSD）通用型檢測器（適合于揮發(fā)性比56工作站數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)功能：采集處理數(shù)據(jù)目標：使用便捷功能完善工作站數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)目標：57梯度洗脫●HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數(shù)目多、性質(zhì)差異較大的復雜樣品梯度洗脫●HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gr58比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱高壓輸液泵低壓梯度阻尼器混合器高壓輸液泵檢測器進樣器色譜柱梯度混合器高壓輸液泵高壓梯度梯度洗脫比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱高壓輸?shù)蛪禾荻茸枘崞鞲邏狠敊z59梯度洗脫的特點優(yōu)點縮短分析時間增加分離能力提高檢測靈敏度缺點儀器設備要求高不適合某些檢測方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復性較低梯度洗脫的特點優(yōu)點60高效液相色譜的配件管路與連接件脫氣裝置：在線脫氣機或超聲波清洗器過濾器：溶劑過濾器和針筒式過濾器進樣器：平頭進樣器高效液相色譜的配件管路與連接件61不同材質(zhì)的管路不銹鋼管：耐腐蝕性好，有精密的同軸度，一般用于高壓部分聚合物管：用在液相色譜系統(tǒng)中從儲液瓶到泵、檢測器出口以后和進樣器排液口等低壓部分PEEK（聚醚醚酮）管：是一種耐高溫、高性能的工程塑料，具有良好的惰性，適宜于生物樣品的分離分析不同材質(zhì)的管路不銹鋼管：耐腐蝕性好，有精密的同軸度，一般用于62液路連接件連接件也稱接頭一般可分為兩種：高壓接頭和低壓接頭高壓接頭采用不銹鋼材質(zhì)低壓接頭采用高聚物材質(zhì)連接件主要有卡套和空心螺釘液路連接件連接件也稱接頭63液路連接密封示意圖液路連接密封示意圖64液路連接裝配不合適的示意圖液路連接裝配不合適的示意圖65脫氣裝置超聲波清洗器通過超聲波作用使流動相中的氣泡排除，超聲脫氣效率只有20％～30％左右在線脫氣機脫氣效果好，脫氣效率大于70％，在線脫氣機使用方便、省事，尤其是在作梯度洗脫時最好用在線脫氣機。脫氣裝置超聲波清洗器66過濾裝置溶劑過濾器為了除去流動相中的雜質(zhì)，對流動相進行過濾溶劑過濾器要配濾膜（有機系和水系，規(guī)格0.45μm或更小孔徑的濾膜）針筒式過濾器樣品溶液在進入色譜系統(tǒng)前必須經(jīng)過針筒式過濾器針筒式過濾器也分為有機系和水系，規(guī)格0.45μm或更小孔徑的過濾裝置溶劑過濾器67進樣器液相色譜的進樣器必須是平頭進樣器常配的進樣器規(guī)格為10、25、50、100μL最常使用的為50μL的進樣器進樣器液相色譜的進樣器必須是平頭進樣器68LC-5500和LC-5510

高效液相色譜儀介紹LC-5500和LC-5510

高效液相色譜儀介紹69LC-5500高效液相色譜儀LC-5500高效液相色譜儀70LC-5500高壓輸液泵P-101型高壓液相平流泵由泵體、過濾器、緩沖器、步進電機、步進電機驅動器、控制電路板、鍵盤以及液晶顯示器等部件構成LC-5500高壓輸液泵P-101型高壓液相平流泵由泵體、過71LC-5500高壓輸液泵技術指標工作壓力：0～40MPa流量范圍：0.01～5.0mL/min流量穩(wěn)定性：≤1％壓力脈動：≤1％LC-5500高壓輸液泵技術指標72LC-5500高壓輸液泵主要特點采用雙柱塞交替輸液吸液，特殊設計的非圓凸輪運動曲線，保證輸出液體流速穩(wěn)定精密電機及電路設計，實現(xiàn)流量控制和流速的穩(wěn)定性壓力傳感器避免了過壓對色譜柱和泵的意外損害性能良好的阻尼器有效消除了輸液脈沖采用LCD帶背光的顯示屏來顯示泵的設置參數(shù)和運行參數(shù)。梯度洗脫流量程序智能化，流量準確LC-5500高壓輸液泵主要特點73LC-5500高效液相色譜儀主機主機包括兩部分：柱溫箱紫外-可見光檢測器LC-5500高效液相色譜儀主機主機包括兩部分：74LC-5500柱溫箱技術指標：溫度控制范圍：室溫＋10～80℃溫度控制精度：±1℃功能特點：控溫精度準確更換色譜柱方便分析結果重現(xiàn)性好保證檢測穩(wěn)定性LC-5500柱溫箱技術指標：75LC-5500紫外-可見光檢測器技術指標：波長范圍：190～650nm波長精度:±2nm波長重復性:優(yōu)于2nm基線噪聲：±1×10-4AU基線漂移：±5×10-4AU/h光譜帶寬：8nm流通池體積：5ul最小檢測濃度：＜4×10-8g/mL(萘的甲醇溶液)LC-5500紫外-可見光檢測器技術指標：76LC-5500紫外-可見光檢測器功能特點：使用波長范圍寬波長精度準確能夠實現(xiàn)多波長測定LC-5500紫外-可見光檢測器功能特點：77LC-5500工作站功能特點：具有儀器控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；可進行波長程序控制可設定柱溫可對兩臺泵進行程序控制，進行梯度洗脫LC-5500工作站功能特點：78LC-5510高效液相色譜儀LC-5510高效液相色譜儀79LC-5510在線脫氣機在線脫氣機主要由真空泵、脫氣膜管、傳感器、控制電路、真空腔等組成在線脫氣機的主要目的是脫除流動相中的氣泡LC-5510在線脫氣機在線脫氣機主要由真空泵、脫氣膜管、80LC-5510高壓輸液泵技術指標工作壓力：0～42MPa流量范圍：0.01～5.0mL/min流量穩(wěn)定性：≤1％壓力脈動：≤1％LC-5510高壓輸液泵技術指標81LC-5100高壓輸液泵主要特點采用雙柱塞交替輸液吸液，特殊設計的非圓凸輪運動曲線，保證輸出液體流速穩(wěn)定精密電機及電路設計，實現(xiàn)流量控制和流速的穩(wěn)定性壓力傳感器避免了過壓對色譜柱和泵的意外損害性能良好的阻尼器有效消除了輸液脈沖采用LCD帶背光的顯示屏來顯示泵的設置參數(shù)和運行參數(shù)。梯度洗脫流量程序智能化，流量準確LC-5100高壓輸液泵主要特點82LC-5510柱溫箱技術指標：溫度控制范圍：5～80℃溫度控制精度：±0.2℃溫度設定值誤差：±0.5℃LC-5510柱溫箱技術指標：83LC-5510柱溫箱功能特點：控溫精度準確分析結果重現(xiàn)性好保證檢測穩(wěn)定性采用LCD帶背光的顯示屏來顯示柱溫的設置和運行溫度既可升溫也可降溫，能滿足一些特殊用戶的需求LC-5510柱溫箱功能特點：84LC-5510紫外-可見光檢測器技術指標：波長范圍：190～650nm波長精度:±0.2nm波長重復性:優(yōu)于0.2nm基線噪聲：±6×10-5AU（動態(tài)，254nm）基線漂移：±2.5×10-4AU/h（動態(tài)，254nm）光譜帶寬：8nm流通池體積：5ul最小檢測濃度：＜1×10-8g/mL(萘的甲醇溶液)LC-5510紫外-可見光檢測器技術指標：85LC-5510紫外-可見光檢測器功能特點：使用波長范圍寬波長精度高噪聲低漂移小可用汞燈自動校正波長采用LCD帶背光的顯示屏來顯示波長的設置參數(shù)和運行參數(shù)LC-5510紫外-可見光檢測器功能特點：86LC-5510工作站功能特點：具有色譜儀控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；可進行波長程序控制可對兩臺泵進行程序控制，進行梯度洗脫功能健全，操作便捷LC-5510工作站功能特點：87固定相和流動相——液相色譜培訓（三）固定相和流動相——液相色譜培訓（三）88色譜柱色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，要求分離度高，柱容量大，分析速度快。高性能的色譜柱與固定相本身性能、柱結構、填裝和使用技術等有關。液相色譜柱是分析好壞、成敗的關鍵，整個液相分析過程中，其作用的重要性猶如人的心臟色譜柱色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，要求分離度高，柱容量89色譜柱的分類按填料表面改性與否分為吸附型和化學鍵合型按照分離模式分為正相、反相、離子交換、疏水作用、體積排組、親和、手性等類型按照分離規(guī)模及色譜柱的幾何尺寸，可分為制備柱、分析柱、微型柱等類型色譜柱的分類按填料表面改性與否分為吸附型和化學鍵合型90色譜柱結構色譜柱結構91色譜柱的基質(zhì)填料硅膠基質(zhì)填料聚合物基質(zhì)填料色譜柱的基質(zhì)填料92硅膠基質(zhì)填料目前應用最為廣泛的基質(zhì)填料高機械強度和高的比表面積可利用直接的廣泛的表面鍵合反應來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求重現(xiàn)性好pH適用范圍為pH2－8具有容易導致強堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基硅膠基質(zhì)填料目前應用最為廣泛的基質(zhì)填料93聚合物基質(zhì)填料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH穩(wěn)定性好：pH1－13可以在很寬的范圍內(nèi)進行表面化學處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求在中等pH條件下對強堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮分離效率相對硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好聚合物基質(zhì)填料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。94化學鍵合固定相將各種不同的有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，而生成化學鍵合固定相化學鍵合固定相對各種極性溶劑都有良好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性由化學鍵合固定相制備的色譜柱柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，幾乎對各種類型的有機化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作化學鍵合固定相將各種不同的有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅95

類型性質(zhì)色譜分離方式應用范圍烷基非極性反相、離子對中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質(zhì)、甾族化合物（類固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等苯基非極性反相、離子對非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類（鄰苯二甲酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類固醇）、PTH衍生花氨基酸酚基弱極性反相中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對多環(huán)芳烴、極性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性醚基弱極性反相或正相醚基具有斥電子基團，適用于分離酚類、芳硝基化合物，其保留行為比C18更強（k’增大）

二醇基弱極性正相或反相二醇基團比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤濕，適于分離有機酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質(zhì)的凝膠過濾色譜固定相芳硝基弱極性正相或反相分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴

腈基極性正相（反相）正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質(zhì)保留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性胺基極性正相（反相、陰離子交換正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類，甾類化合物，氯代農(nóng)藥；反相分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機羧酸和核苷酸二甲胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有機酸

二胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機酸

化學鍵合固定相的類型及其應用范圍類型性質(zhì)色譜分離方式應用范圍烷基非極性反相、離子對中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質(zhì)、甾族化合物（類固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等苯基非極性反相、離子對非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類（鄰苯二甲酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類固醇）、PTH衍生化氨基酸酚基弱極性反相中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對多環(huán)芳烴、極性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性醚基弱極性反相或正相醚基具有斥電子基團，適用于分離酚類、芳硝基化合物，其保留行為比C18更強（k’增大）

二醇基弱極性正相或反相二醇基團比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤濕，適于分離有機酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質(zhì)的凝膠過濾色譜固定相芳硝基弱極性正相或反相分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴

腈基極性正相（反相）正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質(zhì)保留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性胺基極性正相（反相、陰離子交換正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類，甾類化合物，氯代農(nóng)藥；反相分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機羧酸和核苷酸二甲胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有機酸

二胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機酸

類型性質(zhì)色譜分離方式應96

使用鍵合固定相應注意的問題（1）硅膠鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的使用壽命取決于鍵合的有機官能團在硅膠表面的覆蓋程度，覆蓋量大或呈多分子覆蓋層時會增加其穩(wěn)定性。通常正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相反相烷基鍵合相的穩(wěn)定性與使用流動相的pH值有關，通常水溶液的pH應保持在2～8之間，pH＞8.5會引起基體硅膠的溶解。（2）鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性使用鍵合相時經(jīng)常會遇到，同一類型的鍵合相，因生產(chǎn)廠家不同，或生產(chǎn)批號不同，而表現(xiàn)出不同的色譜分離特性，為此應在實驗室中準備一定數(shù)量相同批號的鍵合固定相（或色譜柱），以保證分析結果有良好的重現(xiàn)性。（3）鍵合相色譜分離的選擇性在反相色譜分析中，使用同一種ODS固定相，并用兩種極性參數(shù)值相近，但由不同溶劑組成的流動相時，會由于“溶劑誘導選擇性的變化”而獲得不同的結果。（4）鍵合相的再生使用鍵合相色譜柱時，由于大量極性或非極性樣品的連續(xù)注入，會引起固定相對樣品的吸附、締合等不良效應，而使柱分離性能變差，引起峰形變寬或拖尾等現(xiàn)像此時應及時對色譜柱進行再生處理。對正相鍵合相柱可用1∶1甲醇－氯仿流動相來進行再生；對反相鍵合相柱可用甲醇流動相再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基酰胺或約0.01mol/L無機酸水溶液進行再生。使用鍵合固定相應注意的問題（1）硅膠鍵合相的穩(wěn)97正相色譜固定相最常用的正相色譜固定相——硅膠最常用的極性鍵合固定相——氰基（－CN）、氨基（－NH2）等正相色譜固定相最常用的正相色譜固定相——硅膠98反相色譜固定相大多數(shù)是各種烴基硅烷的鍵合硅膠：如C2、C4、C6、C8、C16、C18和C22等最常用的是C18，又稱ODS，即十八烷基硅烷鍵合硅膠反相色譜固定相大多數(shù)是各種烴基硅烷的鍵合硅膠：如C2、C4、99測柱效-良好的色譜實驗習慣測柱效-良好的色譜實驗習慣100評價色譜柱好壞的標準1）理論塔板數(shù)N2）拖尾因子Tf3）色譜柱背壓4）pH值的適用范圍5）使用壽命評價色譜柱好壞的標準1）理論塔板數(shù)N101理論塔板數(shù)N粒徑(μm)柱長(cm)塔板數(shù)N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,000理論塔板數(shù)N粒徑(μm)柱長(cm)塔板數(shù)N10102拖尾因子TfAs=1.0-1.05很好As=1.2一般As=2差As=4很差不對稱因子和拖尾因子的關系As(at10%)Tf(at5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不對稱因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高拖尾因子TfAs=1.0-1.05As=1.2As103色譜柱背壓粒徑均一會使色譜柱的背壓相對較低。色譜柱兩端的壓力降不應超過公式計算所得的30％。硅膠粒徑對色譜柱的壓力具有很大的影響；硅膠粒子越小，色譜柱的背壓越大。色譜柱的背壓還與流動相的粘度有關。P=3000Lηt0dp2P是色譜柱背壓(psi)，L是色譜柱的長度(cm),η流動相的粘度(cP)，t0是色譜柱死時間,dp是粒子的直徑(μm)色譜柱背壓粒徑均一會使色譜柱的背壓相對較低。P=104常用色譜柱的典型流速常用色譜柱的典型流速105色譜柱的保護柱柱心柱套色譜柱的保護柱柱心柱套106在使用新柱之前，最好用強溶劑在低流量下(0.2-0.3ml/min)沖洗30min，長時間未用的分析柱也要同樣處理定期使用強溶劑沖洗柱子3、使用緩沖鹽時，要先用含低濃度有機溶劑的水溶液沖洗，再用有機溶劑沖洗4、凈化樣品5、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干枯6、使用預柱7、避免流動相組成及極性的劇烈變化8、避免壓力脈沖的劇烈變化分析柱的維護在使用新柱之前，最好用強溶劑在低流量下(0.2-0.3m107色譜柱常見毛病柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復性差不出峰，回收率低色譜柱常見毛病柱壓過高108柱壓過高

為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細菌生長柱壓過高為什么柱壓會過高109柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯柱效低為什么柱效低110重復性差、回收率低實驗的重復性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強或流動相過弱非特異性吸附重復性差、回收率低實驗的重復性差111流動相選擇的一般要求化學穩(wěn)定性好，不與固定相和樣品組分發(fā)生化學反應與所用檢測器相匹配，不影響檢測器的正常工作對分析樣品要有足夠的溶解能力，以利于提高檢測器的靈敏度流動相的黏度要小，以保證合適的柱壓降無毒或低毒，易于操作易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境流動相選擇的一般要求化學穩(wěn)定性好，不與固定相和樣品組分發(fā)生化112正相色譜流動相常用流動相為烷烴：戊烷、己烷等◆通過填加二氯甲烷、短鏈醇、四氫呋喃等極性較大的溶劑來調(diào)節(jié)流動相的極性正相色譜最常用的流動相洗脫強度：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇正相色譜流動相常用流動相為烷烴：戊烷、己烷等113反相色譜流動相通常以水作為基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等反相色譜溶劑洗脫強度的強弱順序為：

水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（其中二氯甲烷無法與水混溶，常用來清洗被強保留樣品污染的色譜柱）在分離極性和離子型化合物時常采用緩沖溶液作為流動相反相色譜流動相通常以水作為基礎溶劑，再加入一定量的能與水互114水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率水的等級波長(nm)純化水去離子水因為不純物的存115溶劑等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45um的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2um的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫溶劑等級都經(jīng)過蒸餾和0.45um的過濾(除纖維毛116甲醇乙睛正己烷------為HPLC級溶劑；——為分析純級溶劑幾種常用溶劑的吸光度比較圖甲醇117溶劑截止波長

溶劑截止波長 118流動相的脫氣易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作氣泡會影響色譜柱的分離效率氣泡會影響檢測器的靈敏度、基線的穩(wěn)定性溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相發(fā)生反應流動相必須脫氣流動相的脫氣易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作流動相必須脫氣119常用的脫氣方法氦氣脫氣法加熱回流法抽真空脫氣法超聲脫氣法在線真空脫氣法常用的脫氣方法氦氣脫氣法120流動相的過濾流動相用前均應過濾，尤其是配置的流動相所用濾膜為0.45μm的孔徑或者更小孔徑的用濾膜過濾時，特別注意分清有機相濾膜和水相濾膜過濾的目的是除去微小顆粒，防止堵塞色譜柱和液路流動相的過濾流動相用前均應過濾，尤其是配置的流動相121流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中貯存溶劑一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，同時防止空氣中的氧和二氧化碳溶于流動相中緩沖溶液極易長霉，應盡量現(xiàn)用現(xiàn)配貯存容器應經(jīng)常清洗，尤其是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，122流動相的貯存有機溶劑流動相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動相:當日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過3天防止長菌有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相:低溫密封保存防止有機相的揮發(fā)流動相的貯存有機溶劑流動相:123溶劑使用注意事項避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應的酸溶液。高濃度的無機酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機溶劑中的有機酸溶液。含有強絡合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。溶劑使用注意事項避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑：124LC-5500的使用、維護及應用——液相色譜培訓（四）LC-5500的使用、維護及應用——液相色譜培訓（四）125LC-5500高效液相色譜的使用與維護LC-5500高效液相色譜的使用與維護126高液相色譜儀——開機前的準備工作

●流動相和樣品的前處理★過濾★脫氣

高液相色譜儀127流動相的前處理：過濾設備和材料：溶劑過濾器、真空泵、0.45μm或更細的水性濾膜和有機濾膜過濾的方法：用加了濾膜的溶劑過濾器和真空泵抽濾過濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱和液路，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液流動相的前處理：過濾設備和材料：溶劑過濾器、真空泵、128儲液瓶一個存放流動相的容器儲液瓶的材料應耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料，一般常用有機溶劑的原裝瓶作為儲液瓶用棕色玻璃瓶作為儲液瓶，可避免藻類的生長為保持流動相的純凈，應經(jīng)常清洗或更換儲液瓶儲液瓶一個存放流動相的容器129流動相的前處理：脫氣脫氣的目的：使色譜泵的輸液準確

輸液均勻準確，且脈動減小。保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高

提高檢測的性能

防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低

保護色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動相的前處理：脫氣脫氣的目的：使色譜泵的輸液準確130常用的脫氣方法氦氣脫氣法加熱回流法抽真空脫氣法超聲脫氣法在線真空脫氣法常用的脫氣方法氦氣脫氣法131脫氣機超聲波清洗器脫氣機超聲波清洗器132樣品的前處理◆使用流動相溶解樣品--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時由為重要--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀◆

樣品需要過濾◆如果樣品中有氣泡，也要超聲脫氣樣品的前處理◆使用流動相溶解樣品133LC-5500液相色譜儀組成簡圖LC-5500液相色譜儀組成簡圖134P101泵鍵盤P101泵鍵盤135單向閥結構拋光面透明塑料墊片寶石球單向閥原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進口單向閥泵頭泵工作原理單向閥結構拋光面透明塑料墊片寶石球單向閥原理吸液沖程排液沖程136泵使用注意事項泵不能在沒有溶劑時空轉，否則活塞與泵缸的密封之間磨損會造成泄漏泵不能用具有腐蝕性的物質(zhì)，pH使用范圍為2～8.5含鹽流動相使用后不能長期存放在泵中，隨著液體的蒸發(fā)，留下的少量鹽的晶體會磨損高壓密封圈和泵塞，所以在應用含鹽流動相后，一定要用純水徹底清洗泵絕對不允許在大于最大允許壓力限定值（40MPa）下操作泵使用注意事項泵不能在沒有溶劑時空轉，否則活塞與泵缸的密封之137LC-5500主機進樣閥檢測器電源柱箱電源調(diào)零旋鈕柱溫箱液晶顯示屏LC-5500主機進樣閥檢測器電源柱箱電源調(diào)零旋鈕柱溫箱液晶138進樣方法1.在INJECT（進樣）狀態(tài)下清洗閥口2.在LOAD（裝填）狀態(tài)下插入微量注射器3.注入樣品4.切到INJECT（進樣）狀態(tài)進樣方法1.在INJECT（進樣）狀態(tài)下清洗閥139進樣注意事項●用注射器吸取樣品后，一定要排除氣泡后方可進樣●將注射器針頭插入進樣口，直到針頭頂住進樣閥體平面為止，且不可用力過大，以免損傷閥體密封面●緩慢推進注射針，使定量管完全充滿樣液●旋轉手柄時一定要快，否則對泵和柱子都會產(chǎn)生不良影響進樣注意事項●用注射器吸取樣品后，一定要排除氣泡后方可進樣140進樣量和檢測器響應的關系示意圖進樣體積檢測器響應值定量環(huán)體積的一半2倍定量環(huán)體積全量注入部分注入進樣量和檢測器響應的關系示意圖進樣體積檢測器響應值定量環(huán)體141進樣閥的沖洗進完樣后一定要及時沖洗進樣閥，特別是用含鹽緩沖液作流動相，由于這些溶液會形成結晶從而磨損墊圈將進樣閥轉至INJECT（進樣）位置，利用液相泵輸送純水沖洗定量環(huán)及溝槽，利用注射器沖洗進樣閥的閥口經(jīng)常用濕潤的軟布清潔進樣閥，特別是進樣口周圍進樣閥的沖洗進完樣后一定要及時沖洗進樣閥，特別是用含鹽緩沖液142進樣閥使用注意事項閥應該保持在LOAD或INJECT中的一個位置。如果閥處在兩者中間的位置，系統(tǒng)內(nèi)的高壓可能會破壞其密封表面

只允許用平端的沖洗注射器和樣品注射器，絕對禁止用尖端（GC）注射器，以防劃傷閥的密封面。進樣閥使用注意事項閥應該保持在LOAD或INJECT中的一個143柱溫箱結構圖柱箱門保護柱色譜柱接檢測器柱溫箱結構圖柱箱門保護柱色譜柱接檢測器144柱溫箱的使用注意事項打開柱溫箱電源開關，通過工作站軟件設定柱箱溫度使用柱恒溫箱時，應先輸入流動相然后再升溫；關機時則相反，即先關閉升溫電源，待色譜柱溫度降至室溫后方可停泵在常溫下操作時，則不必打開柱溫箱電源柱溫箱的使用注意事項打開柱溫箱電源開關，通過工作站軟件設定145色譜柱日常使用注意事項過濾所有的溶劑和樣品使用保護柱不要把柱接頭上得太緊，損壞接頭螺紋易滲液開機時，流速和柱壓要逐漸增加注意色譜柱的pH值使用范圍不要高壓沖洗柱子不能讓緩沖鹽溶液留存在色譜柱中，關機前要先用含低濃度有機溶劑的水溶液沖洗，然后再用純有機溶劑來保存柱子色譜柱日常使用注意事項過濾所有的溶劑和樣品146色譜柱的更換對于反相色譜柱的更換：拆卸色譜柱時，必須先關斷柱箱電源。待色譜柱柱溫降到室溫后，繼續(xù)用溶劑如甲醇沖洗色譜柱約20min；先卸下色譜柱出口端接頭，待有甲醇流出后再擰上螺帽；然后擰下色譜柱進口端接頭，繼續(xù)使甲醇滴入色譜柱，當柱進口端有甲醇溢出，且沒有氣泡時，表明色譜柱已被甲醇充滿，此時可再擰上保護性螺帽。換新色譜柱的程序相反。色譜柱的更換對于反相色譜柱的更換：147色譜柱更換、保存注意事項沖洗或活化色譜柱時，流出液應放入廢液瓶中，千萬不可接到檢測器上，以免污染流通池按柱子進出口方向接入系統(tǒng)，不可更改色譜柱內(nèi)應充滿溶劑，絕不可干燥放置。正相柱用正己烷或乙腈，反相柱用甲醇。用原配的柱端堵頭封緊柱兩端色譜柱存放時防止震動，以免損壞柱床色譜柱更換、保存注意事項沖洗或活化色譜柱時，流出液應放入廢液148檢測器的使用注意檢測器的波長通過工作站的軟件設定氘燈通電后在一分鐘內(nèi)起輝，然后進入工作狀態(tài)，一般氘燈穩(wěn)定需要0.5~1h，穩(wěn)定后就可以進樣分析，所以要等儀器達到穩(wěn)定狀態(tài)，也即基線走穩(wěn)后方可進行樣品分析注意液晶顯示屏所顯示的數(shù)字要為正，通過調(diào)零旋鈕調(diào)節(jié)基線與零點的位置，使基線在零點的上方。檢測器的使用注意檢測器的波長通過工作站的軟件設定149工作站界面工作站界面150整套液相色譜儀的維護1、在使用過含鹽緩沖液后，用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）沖洗整個系統(tǒng)，時間為30min，流量1mL/min。本步驟主要是沖洗干凈系統(tǒng)內(nèi)含鹽緩沖液。2、用純的強溶劑（甲醇或乙腈）沖洗整個系統(tǒng)，時間為30min以上，流量為1mL/min。本步驟主要是保護色譜柱。3、如果未使用緩沖液，上面步驟1可免去，直接用純的強溶劑沖洗整個系統(tǒng)，時間為30min以上，流量為1mL/min每次用過儀器后必須做!整套液相色譜儀的維護1、在使用過含鹽緩沖液后，用甲醇-水溶液151注意事項流動相的選擇：對樣品易溶，且溶解度盡可能大化學性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收黏度低，流動性好無毒或低毒，易于操作易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境注意事項流動相的選擇：152注意事項緩沖液的使用：使用前必須過濾使用后一定要進行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min易受到細菌和霉菌的影響，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配

不能直接用有機溶劑沖洗注意事項緩沖液的使用：不能直接用有機溶劑沖洗153液相色譜常見問題及其對策液相色譜常見問題及其對策154液相色譜常見問題類型A.壓力異常（偏高、波動）B.漏液C.保留時間漂移D.基線問題（漂移、噪聲）E.峰形異常液相色譜常見問題類型155現(xiàn)象：無壓力，流動相不流動可能原因：1、柱塞桿折斷2、泵頭內(nèi)有空氣或流動相不足3、單向閥堵塞4、漏液5、壓力傳感器損壞(流動相流動正常，但無壓力)壓力異?，F(xiàn)象：無壓力，流動相不流動壓力異常156現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升可能原因：1、流速設定過高2、保護柱或柱子篩板堵塞3、流動相使用不當或有緩沖鹽析出4、色譜柱選擇不當5、進樣閥損壞壓力異常現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升壓力異常157現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低可能原因：

1、流速設定過低2、色譜柱選擇不當3、柱溫過高4、系統(tǒng)漏液壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低壓力異常158壓力異?，F(xiàn)象：壓力波動可能原因：1、泵頭中有氣泡2、單向閥損壞3、柱塞密封圈損壞4、脫氣不充分5、系統(tǒng)漏液6、使用了梯度洗脫壓力異?，F(xiàn)象：壓力波動159漏液接頭處漏液

可能原因：1、接頭處松動2、接頭磨損3、接頭被污染4、部件不匹配

漏液接頭處漏液160漏液泵漏液

可能原因：1、單向閥松動2、泵密封圈損壞3、接頭松動（不要擰的太緊）漏液泵漏液161進樣閥漏液

可能原因：1、轉子密封損壞2、定量環(huán)堵塞3、進樣口密封松動4、進樣針尺寸不合適5、廢液管產(chǎn)生虹吸6、廢液管堵塞漏液進樣閥漏液漏液162檢測器漏液

可能原因：1、流通池墊片損壞2、流通池透鏡破碎3、廢液管堵塞4、流通池堵塞漏液檢測器漏液漏液163保留時間漂移

可能原因：1、柱溫變化2、流動相組分變化3、色譜柱沒有平衡好4、流速變化5、泵中有氣泡6、流動相選擇不當7、鍵合相流失保留時間漂移保留時間漂移保留時間漂移164基線漂移

可能原因：1、溫度波動2、流動相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑)3、流通池被污染或有氣泡4、流通池窗口破裂5、流動相配比不當或流速變化6、色譜柱沒有平衡7、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成8、樣品中有強保留的物質(zhì)以饅頭樣峰被洗出9、檢測器沒有設定在最大吸收波長處基線問題基線漂移基線問題165基線噪聲（規(guī)則的）

可能原因：1、流動相、泵、檢測器中有氣泡2、有地方漏液3、流動相混和不均勻4、溫度影響（檢測器和柱溫差別太大）5、其他電子設備的影響

基線問題基線噪聲（規(guī)則的）基線問題166基線噪聲（不規(guī)則的）

可能原因：1、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成2、有地方漏液3、流動相各溶劑不相溶或混和不均勻4、流通池污染5、檢測池能量不足6、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡基線問題基線噪聲（不規(guī)則的）基線問題167前沿峰、拖尾峰

可能原因：1、柱塞板堵塞2、色譜柱塌陷3、柱外效應4、干擾峰5、化學或次級保留（硅羥基效應）6、重金屬污染7、樣品溶劑選擇不當8、樣品過載9、柱溫過低峰形異常前沿峰、拖尾峰峰形異常168分叉峰

可能原因：1、保護柱或分析柱污染2、樣品溶劑不溶于流動相峰形異常分叉峰峰形異常169峰展寬可能原因：1、進樣體積過大2、流動相粘度過高3、保留時間過長4、柱外體積過大5、樣品過載峰形異常峰展寬峰形異常170峰變形

可能原因：1、樣品過載2、樣品溶劑選擇不當峰形異常峰變形峰形異常171峰形異常鬼峰可能原因：1、進樣閥殘余峰2、樣品中未知物3、柱未平衡4、水污染5、三氟乙酸氧化峰形異常鬼峰172高效液相色譜的應用高效液相色譜的應用173在食品分析中的應用食品營養(yǎng)成分分析：氨基酸、色素、維生素、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）等食品添加劑分析：甜味劑（安塞蜜、糖精鈉）、防腐劑（山梨酸、苯甲酸）、合成著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍等）、抗氧化劑等食品中控制使用或禁止使用添加物的分析：過氧化苯甲酰、蘇丹紅、三聚氰胺在食品分析中的應用食品營養(yǎng)成分分析：氨基酸、色素、維生素、174食品中苯甲酸、山梨酸的測定

—GB/T5009.29-2003色譜條件：色譜柱：C18柱，4.6mm×250mm，10μm不銹鋼柱或性能相當者流動相：甲醇：0.02mol/L乙酸銨溶液＝5：95流速：1mL/min進樣量：20μL柱溫：室溫檢測波長：230nm食品中苯甲酸、山梨酸的測定

—GB/T5009.29-20175苯甲酸、山梨酸和糖精鈉色譜圖苯甲酸、山梨酸和糖精鈉色譜圖176食品中合成著色劑的測定

－GB/T5009.35-2003色譜條件：色譜柱：C18柱，4.6mm×250mm，10μm不銹鋼柱或性能相當者流動相：A：甲醇；B：0.02mol/L乙酸銨溶液梯度洗脫：甲醇：20％～35％，3％/min；35％～98％，9％/min；98％繼續(xù)6min流速：1mL/min進樣量：20μL柱溫：室溫檢測波長：254nm食品中合成著色劑的測定

－GB/T5009.35-2003177檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和亮藍色譜圖檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和亮藍色譜圖178小麥粉中過氧化苯甲酰的測定

高效液相色譜法

－GB/T22325-2008色譜條件：色譜柱：C18反相柱（4.6mm×250mm，5μm）或性能相當者流動相：甲醇：0.02mol/L乙酸銨溶液＝10：90流速：1mL/min進樣量：20μL柱溫：室溫檢測波長：230nm小麥粉中過氧化苯甲酰的測定

高效液相色譜法

－GB/T22179過氧化苯甲酰色譜圖過氧化苯甲酰色譜圖180食品中蘇丹紅染料的檢測方法

高效液相色譜法

－GB/T19681-2005色譜條件：