蛋白質(zhì)含量測定、蔗糖酶活力測定及純化方案的評價(jià)

專業(yè)： 園藝 泊卡實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名： 泊卡實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào)： 3140100506日期：2015年10月26日地點(diǎn)： 生物實(shí)驗(yàn)中心課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲） 指導(dǎo)老師：方祥年成績:實(shí)驗(yàn)名稱： 蛋白質(zhì)含量測定、蔗糖酶活力測定及純化方案的評價(jià)實(shí)驗(yàn)類型：二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得同組學(xué)生姓名：沈杭寧、董文婷、蔣天佑二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┤?、?shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法2、掌握分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確測定未知樣品的蛋白質(zhì)含量3、掌握分光光度計(jì)的使用方法4、掌握酶活力測定的基本原理和方法5、學(xué)習(xí)酶的比活力的計(jì)算二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量Folin-酚測定法是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，F(xiàn)olin-酚試劑是由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、澳等組成，在堿性條件下，銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基（酚基）和色氨酸還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（乙試劑）產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物），其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比?？捎?00nm波長比色測定，適于測定蛋白質(zhì)含量0.05?0.5g/L.蛋白幀（肽鍵）OH-甲試劑《酒石酸鉀鈉銅鹽）生成紫紅色絡(luò)合物蛋白質(zhì)中的酹氨酸和色氨酸紫紅華結(jié)合物0H"乙忒劑產(chǎn)生深藍(lán)色（華藍(lán)和鈣藍(lán)的混合物）2、3,5-二硝基水楊酸比色法蔗糖酶（B-D-呋喃型果糖甘-果糖水解酶EC3.2.1.26）,是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2—糖昔鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，例如：納爾遜―索模吉（Nelson-Smogyi）試劑比色法，斐林試劑法等。本實(shí)驗(yàn)采用3.5—二硝基水楊酸法測定還原糖的含量。其原理是3.5—二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此可利用分光光度計(jì)在520nm進(jìn)行比色測定，求得樣品中的含糖量。蔗糖酶活力單位(u)：蔗糖酶在室溫(25℃),pH4.5的條件下，每分鐘水解產(chǎn)生lumol葡萄糖所需的酶量(ml)。蔗糖酶比活力的計(jì)算：酶的比活力一一為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位mg蛋白質(zhì)表示(比活力=活力單位/mg蛋白)。酶的比活力在酶學(xué)研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。注：*葡萄糖(分子量：180.1572)和果糖(分子量：180.16)為同分異構(gòu)體。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料蔗糖酶提取的各步分離純化樣品i、n、m、w?？筛鶕?jù)樣品溶液的蛋白質(zhì)含量高低作適當(dāng)?shù)南♂尅?、實(shí)驗(yàn)試劑⑴Folin-酚測定法：①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.5g/L牛血清白蛋白②Folin-酚試劑(甲試劑、乙試劑)(2)3,5-二硝基水楊酸比色法：①1g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(葡萄糖相對分子量198.17)②5%蔗糖溶液③0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5④3,5一二硝基水楊酸試劑(DNS)四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器(1)恒溫水浴(50℃、100℃)(2)可見光分光光度計(jì)、1cm玻璃比色皿(3)試管、試管架(4)移液管(5)微量移液器：200ul、1000ul五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟Folin-酚測定法：1)制備Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支試管，編號(hào)1—6,按表1順序依次加入各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm處測定光吸收值(A500n值)。表1試管號(hào)L23436Q. 標(biāo)潴蛋白質(zhì)溶液CidJ)00.20.40.6o.8L蒸幗水 <ml)10.80.6a4d20Foliii的試劑卬 full)55555混勻,在室溫七，min「口1in一酚試刑乙 <diJ>(hs0.5。.565d5O-.5混勻.在室溫「靜置八5。02

（2）各步分離純化的蔗糖酶蛋白測定由于蔗糖酶提取、分離純化的各個(gè)樣品的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量較高，因此在測蔗糖酶提取分離純化樣品i、n、m、w的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量以前，可根據(jù)各樣品溶液的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量高低不同作適當(dāng)?shù)南♂?，以測定蔗糖酶蛋白質(zhì)含量a500nm值在蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以內(nèi)為宜。取13支試管，編號(hào)1?13,按表2依次加入各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm處測定光吸收值（A500nm值）。憚品空白Nf號(hào)12345E7391。111213悻品液V（ml）0.0口加50.502Q.5d工Q.50050.20,5木工El）1.00.95as0.50.5d.511950.80.5Folin■艇印賦劑(ml)5.0SO5.05g寫。5,。5.05.05,05.0混初三r京溫（25X＞教M1。分神Fedin-尚乙試劑(ml)0565Q.50.5Q.S050.5Q.50.505Q-5V-50.S混勾后,宜溫（25"C＞做MZ0舒錚Q（3）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以光吸收值（A500nm）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg/L）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。 1m計(jì)算：蔗糖酶提取分離純化的樣品i、n、mi、w稀釋溶液的光吸收值（a500nm）,查蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進(jìn)行樣品i、n、mi、w溶液的最終蔗糖酶蛋白含量的計(jì)算。3,5-二硝基水楊酸比色法：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表31234567葡萄糖含量 （umol）01.01.52.02.53.03.51g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.20.30.40.50.60.7H2O (ml)21.81.71.61.51.41.33.5一二硝基水楊酸（ml）1.01.01.01.01.01.01.0將各管溶液混勻后，在100℃恒溫水浴加熱5min,取出立即用冷水冷卻至室溫蒸餾水（ml）7777777將各管溶液混勻A520nm按照表3加樣，以葡萄糖含量（umol）為橫坐標(biāo)，A520值為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖濃度一吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)蔗糖酶的酶活力測定表4樣品空白1(200倍稀釋)II(200倍稀釋)m(200倍稀釋)W(100倍稀釋)編號(hào)123456789101112130.2mol/L乙酸緩沖液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5蒸餾水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55%蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保溫時(shí)間立即混勻后，50℃保溫10min3.5一二硝基水楊酸試劑(ml)1111111111111在100°。恒溫水浴中加熱5min蒸餾水7777777777777混勻A入520根據(jù)測得的光吸收值(a52d，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶活力，再進(jìn)行樣品i、n、m、w溶液的最終蔗糖酶活力的計(jì)算。六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1.Folin-酚測定法：(1) 制備Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線表5Folin-g分法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)記錄試管號(hào)123456ACS00nm00.1650.2700.4190.5130.639Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2)各步分離純化的樣品蛋白含量測定表6各步分離純化的蔗糖酶蛋白測定樣品空白1(1:20稀釋)11（1:10稀釋）111（1:5稀釋）IV(1:1稀釋)編號(hào)12345678910111213A500nm00.1100.2740.6240.2650.4280.9130.1820.66610390.3010.7631492蔗糖酶蛋白含it(mg)00.07110.20190.48110.19470.32470.71160.12850.5146 0.22340.5919 每ml稀釋液蛋白含量(mg)01.42201.00950.96223.89401.62351.42322.57002.5730 4.46802.9595 每ml稀釋液蛋白含量平均值(mg)01.13102.31362.57153.71382.3,5-二硝基水楊酸比色法:(1)制備3,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線表7 3,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)記錄試管號(hào)1234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.5A520nm00.2450.3990.5180.8771.095數(shù)值過大舍去3,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2) 蔗糖酶的酶活力測定表8蔗糖酶酶活力測定數(shù)據(jù)記錄樣品空白1(200倍稀釋)n(200倍稀釋)0(200倍稀釋)W(100倍稀釋)編號(hào)12345678910111213A520nm00.318YACL1.4951.6680.236133916840.376156217300.64317091793葡萄糖含量(umol)01.1080 0.8838 1.2665 1.9964 蔗糖酶活力單位(u)00.1108 0.0884 0.1267 0.1996 稀釋液中蔗糖酶活力(u/ml)02.216 1.768 2.534 3.992 稀釋液中蔗糖酶活力平均值(u/ml)02.2161.7682.5343.992七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析結(jié)果：表9蔗糖酶各步純化樣品的純度與酶活力比較體積(ml)蛋白濃度(mg/ml)總蛋白(mg)活力(u/ml)總活力u比活力u/mg樣品I20.022.620452.400443.28864.019.6樣品n16.523.136381.744353.65834.415.3樣品n9.512.858122.151506.84814.639.4樣品w16.13.713859.792399.26427.12107.5分析：1、由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，隨著逐漸的分離提純，樣品I到樣品W的蛋白濃度降低，總蛋白含量也在降低，總活力也有所降低，而比活力則在逐步提高，表明蔗糖酶濃度在逐步提高，基本達(dá)到將蔗糖酶粗提純的目的。2、樣品n的數(shù)據(jù)不是很符合上述結(jié)論，猜測與以下因素有關(guān)：每次實(shí)驗(yàn)間隔時(shí)間較長，酶活性及蛋白質(zhì)有所損失，致使樣品n的數(shù)據(jù)存在問題。3、樣品w的比活力較高，表明蔗糖酶純度較高，可能與做離子分析柱層析分離純化蔗糖酶這一步時(shí)，