發(fā)酵液預處理和固液分離

關于發(fā)酵液預處理和固液分離第一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日預處理和固液分離內容固液分離發(fā)酵液胞外上清液/濾液預處理提取生化物質的第一步，分兩部分：胞內富集細胞第二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

一、發(fā)酵液預處理的基本思路

二、預處理的目的

三、發(fā)酵液預處理的方法

第一節(jié)發(fā)酵液過濾特性的改變第三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日發(fā)酵液成分很復雜，包含菌（細胞）體，胞內外代謝產物，及剩余的培養(yǎng)基殘分等；不管人們所需要的產物是胞內還是胞外，都首先要進行培養(yǎng)液的固液分離，才能進行后續(xù)的操作；對于胞外產物，可先將菌體或其他懸浮雜質去除，才能從澄清的濾液中提取代謝產物；對于胞內產物，首先富集菌體，再進行細胞破碎和碎片分離，然后才能提取胞內產物。一、發(fā)酵液預處理的基本思路

第四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日發(fā)酵液的基本特性1、發(fā)酵液成分復雜。2、發(fā)酵產物濃度低，懸浮液中大部分是水。3、懸浮物顆粒小，相對密度與液相差別不大。造成液相粘度很大，不宜過濾。4、菌體、蛋白等固體顆?？蓧嚎s性大。5、產物性質不穩(wěn)定，隨時間易發(fā)生變化，如氧化、污染、蛋白質水解等作用的影響。6、發(fā)酵液中含有色素、毒性物質、熱源物質等，對產品的質量安全及衛(wèi)生標準產生不利影響。這些特性使得發(fā)酵液的過濾與分離相當困難。第五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

固液分離方法主要是過濾和離心。對于細菌及某些放線菌，菌體細小，液體粘度大，不能直接過濾；若用高速離心，能耗很大，設備昂貴；若用膜分離技術（如微濾）易產生膜污染，通量降低。發(fā)酵液中由于菌體自溶，核酸、蛋白質及其它有機粘性物質的存在也會影響固液分離。尋找一種經濟有效的方法來提高固液分離速度顯得十分必要。預處理是生化物質分離純化過程中必不可少的首要步驟第六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日二、預處理的目的

預處理的目的：促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離的效率：（1）改變發(fā)酵液的物理性質，包括增大懸浮液中固體粒子的尺寸，降低液體黏度。（2）相對純化，去除發(fā)酵液中的部分雜質（高價無機離子和雜蛋白質），以利于后續(xù)各步操作。（3）盡可能使產物轉入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）。第七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日生物技術下游加工過程的一般步驟

第八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日三、發(fā)酵液預處理的方法加熱法（Heating）調節(jié)懸浮液的pH值（RegulationofpH）助濾劑和反應劑（FilteraidsandReactant)雜蛋白的去除（Removalofuselessprotein）高價無機離子的去除（Removalofinorganicion）凝聚和絮凝（Coagulationandflocculation）第九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

降低液體的粘度可以有效提高過濾的速率。1、降低液體的粘度常用方法有加水稀釋和加熱處理。流體力學原理過濾速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度可有效提高過濾速率。第十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1）加水稀釋會增加懸浮液的體積，加大后續(xù)過程的處理任務。稀釋后的過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能有效。第十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2）加熱A、加熱降低液體粘度液體黏度是溫度的指數(shù)函數(shù)，升溫是降低黏度的有效措施。B、加熱使蛋白質變性凝固，去除雜蛋白

變性蛋白質的溶解度小。第十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日麥芽汁的黏度-溫度曲線第十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日麥芽汁40℃粘度為12×10-3升高至75℃其粘度可下降一半以上，過濾速率可加倍。鏈霉素在pH3.0，加熱至70℃半小時，粘度下降1/6，過濾速率可增大10-100倍。第十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

加熱時必須嚴格控制溫度和時間：加熱溫度不能影響目的產物的活性及其他性質。避免氧化、分解、變性等。加熱時間不能太長，否則會使細胞溶解，胞內物質大量外溢，增加發(fā)酵液的復雜性，影響目的產物的分離純化。第十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2、調節(jié)pHpH值直接影響發(fā)酵液中某些物質的電離度和電荷性質，適當調節(jié)pH值可改善其過濾特性。細胞(碎片)及某些膠體物質在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。調節(jié)發(fā)酵液的pH到蛋白質的等電點是除去蛋白質的有效方法。大幅度改變pH還能使蛋白質變性凝固。通過調整pH值改變膜過濾中易吸附分子的電荷性質，可減少膜堵塞和污染；影響離子型絮凝劑的電離度。第十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesTheeffectonfiltratevolumeofpH第十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

pH值的調整需要注意：保護目的物活性，一般不宜過酸或過堿。加酸或加堿時要慢慢地邊加邊攪拌，避免局部濃度過高，引起目的產物變性。第十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日采用凝聚與絮凝技術能有效的改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質的分散狀態(tài)，使其聚結成較大的顆粒，便于提高過濾速率。還能有效的除去雜蛋白質和固體雜質，提高濾液的質量，因此絮凝與凝聚是目前工業(yè)上最常用的預處理方法之一。3、凝聚Coagulation第十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日凝聚是指在電解質作用下，由于膠粒之間擴散雙電層電位下降，電排斥作用降低，破壞膠體體系的分散狀態(tài)，使之不穩(wěn)定相互凝集成1mm左右塊狀凝聚體的現(xiàn)象。第二十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質的相對分子質量在5*103-1*106之間，分子直徑約1-30nm，呈膠體性質;蛋白質水化層：蛋白質分子周圍存在與蛋白質分子緊密或疏松結合的水化層。緊密結合的水化層可達到0.35g/g蛋白質，而疏松結合的水化層可達蛋白質分子質量的2倍以上；靜電排斥作用：第二十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日(1)膠體雙電層結構發(fā)酵液中菌體表面帶有負電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其周圍。正離子同時受到使它們均勻分布的熱運動影響，具有離開膠粒表面的趨勢，在界面上形成了雙電層。第二十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：

1）吸附層（緊密層）；2）擴散層。形成了擴散雙電層的結構模型。第二十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

雙電層可分為兩部分：緊密層：距膠核表面約一個離子半徑的stern平面以內，正離子被緊密結合在膠核表面，不流動。分散層：緊密層外圍反離子濃度逐漸降低直至達到主體溶液的平均濃度?；泼妫寒斈z體粒子在溶液中作相對運動時，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大。第二十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日不同界面上形成不同的電位:膠核表面的電位φs是整個雙電層的電位;Stern平面上的電位為φd;滑移面上的電位為ζ,稱ζ電位。第二十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

ζ電位是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征。帶電粒子間的靜電相互作用取決于ζ電位的大小。當雙電層的ζ電位足夠大時，靜電排斥作用抵御分子間的相互吸引作用，使蛋白質溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。第二十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日ζ電位電位的計算

D—

水的介電常數(shù)；q—

膠體的電荷密度，即滑移面上的電荷密度；δ—

擴散層的有效厚度，即為吸附層和擴散層界面處電位

φd降低到其值為1/e處的距離，不能直接測定.ζ電位是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征，并作為研究凝聚機理的重要參數(shù)。第二十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日δ—擴散層的有效厚度式中N一阿伏伽德羅常數(shù)；

T一熱力學溫度;k—波爾茲曼常數(shù)；

e—電子電荷；

Zi—i種反離子的化合價；

Ci—i種離子的摩爾濃度。第二十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日(2)雙電層與凝聚由上述兩式可知，ζ電位與擴散層厚度δ和電動電荷密度q成正比，而擴散層厚度又與溶液中反離子強度和電荷成反比。對帶負電性菌體的發(fā)酵液，高價陽離子的存在，可壓縮擴散層的厚度，促使ζ電位迅速降低，而且化合價越高，這種影響越顯著。第二十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日當雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間范德華引力時，由于熱運動的結果，導致膠粒的相互碰撞而聚集。由此可見，在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質，由于ξ電位的降低和脫除膠粒表面水化膜，就導致了膠粒間的凝聚作用。第三十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

凝聚價或凝聚值：

使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質濃度（mmoL/L)，稱為凝聚價或凝聚值。

電解質的凝聚能力用凝聚價或凝聚值來表示第三十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日Schulze－Hardy法則（叔米-哈第）：反離子的價數(shù)越高，凝聚價越小，即凝聚能力越強。陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力受化合價、水化半徑、離子運動能力的影響，次序為Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+第三十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日常用的凝聚劑電解質有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3第三十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日指在某些高分子絮凝劑的作用下，基于架橋作用，使膠粒交聯(lián)成團、形成10mm大小的較大絮凝團的過程。

采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒是比較細小的，有時還不能有效的進行分離。采用絮凝法則可以形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較容易分離。

4、絮凝flocculation第三十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日絮凝劑是一類易溶于水的高分子聚合物。其分子量可高達數(shù)萬甚至千萬以上，它們具有長鏈線性結構，其鏈節(jié)上含有許多活性功能基團，可以帶有多價電荷，如陰離子-COOH，陽離子-NH2，也可以是不帶電的非離子型基團。1）絮凝劑第三十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日它們通過靜電引力，范德華分子引力或氫鍵作用，強烈的吸附在不同顆粒的表面，當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產生了架橋連接，生成粗大的絮團，這就是絮凝作用。只要膠粒相互間排斥電位不太高，高分子聚合物的鏈節(jié)足夠長，跨越的距離超過了顆粒間的有效排斥距離，就能把多個膠粒拉在一起，導致架橋絮凝。第三十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2）高分子絮凝劑的吸附架橋作用第三十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1）其分子必須含有相當多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結合。2）要求必須具有長鏈的線性結構，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團，但相對分子量不能超過一定限度，以使其有良好的溶解性。3）對絮凝劑的化學結構的要求第三十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日可分為四類：人工合成有機高分子聚合物、天然有機高分子聚合物、無機高分子聚合物、微生物絮凝劑4）工業(yè)上使用的絮凝劑A、目前常用的是人工合成有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚乙烯亞胺衍生物；聚丙烯酸類和聚苯乙烯類衍生物。第三十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

高分子聚合物絮凝劑根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：陰離子型（含有羧基)、陽離子型（含有胺基）、非離子型第四十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點：存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應謹慎。近年來發(fā)展的聚丙烯酰胺陰離子絮凝劑，無毒，可以用于醫(yī)藥和食品上。目前最常見：聚丙烯酰胺類絮凝劑第四十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日B、天然有機高分子絮凝劑

人工合成有機高分子絮凝劑雖然發(fā)展很快，但還存在著殘留單體有毒，生物降解難等問題，所以其應用受到了限制。天然有機高分子絮凝劑具有無毒，易生物降解，原料來源廣等優(yōu)點。天然有機高分子改性絮凝劑根據(jù)原料來源不同可分為淀粉類、纖維素類、植物膠類和聚多糖類。其中淀粉改性絮凝劑的研究開發(fā)最引人注目。第四十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日C、無機高分子聚合物

有聚合鐵系和鋁系兩大類鐵系絮凝劑具有操作簡單、費用低，受溫度影響小，親和力強，能有效地去除懸浮物、表面活性劑、破壞油水乳狀液的能力很強等優(yōu)點，缺點腐蝕性強、穩(wěn)定性差。鋁系是目前應用廣、工藝較成熟的一類無機金屬鹽絮凝劑，絮凝效果好，缺點具毒性等。第四十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日D、微生物絮凝劑微生物絮凝劑是近年來研究和開發(fā)的新型絮凝劑，一類由微生物或其分泌物產生的具有絮凝細胞功能的代謝產物。包括直接利用微生物細胞的絮凝劑、利用微生物細胞壁代謝產物的絮凝劑和克隆技術所獲得的絮凝劑主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質。最大的優(yōu)點：安全，無毒和不污染環(huán)境。第四十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1、微生物絮凝劑的商業(yè)化生產始于20世紀90年代，如紅平紅球菌及由此制成的NOC-1是目前發(fā)現(xiàn)的最佳微生物絮凝劑

2、微生物絮凝劑或將大部分替代普通絮凝劑3、浮游藻類、草分枝桿菌、硅酸鹽芽孢桿菌。第四十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

5）影響絮凝效果的因素絮凝劑分子量和類型絮凝劑用量溶液pH攪拌時間攪拌轉速第四十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日①絮凝劑分子量分子量越大，鏈越長，吸附架橋作用越明顯，但分子量越大，絮凝劑的溶解度越低。第四十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

濃度低時，加大絮凝劑用量有助于架橋提高絮凝效果，但用量過多反而會引起吸附飽和，在膠粒表面形成覆蓋層，而失去與其他膠粒的架橋機會，使膠粒更加穩(wěn)定，降低絮凝效果。②

絮凝劑濃度第四十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日絮凝劑的濃度，最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋。第四十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

溶液pH的變化會影響絮凝劑功能團的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，鏈節(jié)上相鄰離子基團間的電排斥作用，使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範顟B(tài)，架橋能力提高。③溶液pH第五十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

剛加入時攪拌速度加快能使絮凝劑迅速分散，發(fā)揮作用，但絮凝劑形成以后，過度攪拌會打碎絮凝團。④攪拌速度第五十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日定義：包括了凝聚和絮凝機理的過程稱為混凝。對于帶負電荷的菌體或蛋白質來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和吸附橋架的雙重機理，所以可單獨使用。5、混凝第五十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過分子之間引力和氫鍵作用產生吸附橋架，所以它常與無機電解質凝聚劑搭配使用。首先加入電解質使懸浮粒子間的雙電層電位降低、脫穩(wěn)、凝聚成微粒，然后再加入絮凝劑絮凝成較大的顆粒。無機電解質的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而大大提高了絮凝的效果。第五十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日6、加入助濾劑（filteraids）

一種不可壓縮的多孔微粒，在發(fā)酵液中加入固體助濾劑，則菌體可吸附于助濾劑微粒上，助濾劑就作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，降低了濾餅的可壓縮性，減小了過濾阻力。目前生物工業(yè)中常用的助濾劑是硅藻土，其次是珍珠巖粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纖維素、白土等。第五十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日一種是在過濾介質表面預涂助濾劑；另一種是在發(fā)酵液中直接加入。此法要有一個攪拌槽，充分攪拌，以防沉淀。也可以兩種方法同時使用。

1）助濾劑使用方法第五十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日A、根據(jù)目的產物選擇目的產物為液相時，注意產物是否會被助濾劑吸附，注意pH。目的產物為固相時，一般使用淀粉、纖維素等不影響產物質量的助濾劑。2）助濾劑的選擇和使用第五十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

B、根據(jù)過濾介質和過濾情況選擇當使用粗目的濾網時，易漏。采用石棉粉、纖維素、淀粉做助濾劑；當使用細目濾布時，采用細硅藻土，如采用粗硅藻土，料液中的細顆粒仍通過助濾劑將到達濾布表面，從而使過濾阻力增大；當使用燒結或粘結材料時，宜使用纖維素；可使濾渣易剝離，并防止堵塞毛細孔。第五十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

C、粒度選擇

助濾劑粒度及粒度分布對過濾速率和濾液的澄清度影響很大，要粒度適宜。當粒度一定時，過濾速率與澄清度成反比，過濾速率越大，澄清度差；過濾速率小，澄清度好。助濾劑的粒度必須與懸浮液中固體粒子的尺寸相適應，一般應通過試驗來確定選用何種粒度的助濾劑。第五十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

D、使用量

助濾劑使用量要合適，涂層厚度一般在2mm，直接加入時加量與料液中固形物含量相等。使用硅藻土時細粒用量為500g/m3，中粒用量為700g/m3，粗粒用量為700-1000g/m3。第五十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日GradeDensity(kg/m3)pHWaterAdsorption(%)RelativeFlowRateDryWetDiatomaceousEarthsStandardSuper–Cel1302807.0260200512HyfloSuper–Cel14028010.025050053519028010.0250140056031032010.02207500PerlitesTerracel30011026027.5-300Terracel5001302407.5-900TypicalpropertiesofFilterAids第六十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日7.加入反應劑

加入某些不影響目標產物的反應劑，可消除發(fā)酵液中的一些雜質對過濾的影響，從而提高過濾速度。

1）加入反應劑與某些可溶性鹽類發(fā)生反應生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構，又能使蛋白質凝固，過濾性能上升，沉淀本身可作為助濾劑。如在新生霉素發(fā)酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。第六十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2）發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質時，用酶將其轉化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。第六十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)發(fā)酵液的相對純化一、高價無機離子的除去二、雜蛋白的去除方法第六十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日發(fā)酵液中雜質很多，其中有些雜質不僅影響產品的質量和收率，同時對后繼提取和純化有很大影響。動植物或微生物細胞在合適的培養(yǎng)基及一定條件下生長、繁殖，并積累一定的代謝產物，其培養(yǎng)液預處理富含兩大類雜質。第六十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）雜蛋白常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質堵塞，影響過濾效率。采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，有機溶劑法或雙水相萃取時，易產生乳化，使兩相分離不清。因此，在預處理時，應盡量除去這些物質。

在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質的交換容量。第六十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1、離子交換法指用陽離子交換樹脂除去發(fā)酵液中的陽離子。一、高價無機離子的除去如四環(huán)素和土霉素的發(fā)酵液，鐵離子含量很高，對成品質量與提取影響很大，尤其影響離子交換的吸附容量。一般采用122樹脂預先除去。第六十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

Ca2+的去除一般加草酸，生成不溶性的草酸鈣，還能使蛋白質絮凝凝固，提高濾液（也稱為原液）質量。但草酸價格較高，且草酸溶解度較小，故用量大時，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。應注意回收草酸。如四環(huán)類抗生素廢液中，加入硫酸鉛，在60℃下反應生成草酸鉛。后者在90-95℃下用硫酸分解，經過濾、冷卻、結晶后可以回收草酸。2、沉淀法第六十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日Mg2+的去除

加入三聚磷酸鈉Na5P3O10，它和鎂離子形成可溶性絡合物后，即可消除對樹脂的影響。

Na5P3O10+Mg2+MgNa3P3O10+2Na+第六十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日Fe3+的去除

可加黃血鹽使其形成普魯士蘭沉淀而除去。

4Fe3++3K4Fe(CN)6=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+第六十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日二、雜蛋白的去除方法沉淀法變性法吸附法第七十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1.雜蛋白去除-沉淀法

precipitationA.等電點沉淀法（isoelectricprecipitation

）蛋白質的等電點大都在酸性范圍內(pH4.0～5.5)，調節(jié)發(fā)酵液的pH到蛋白質的等電點是除去蛋白質的有效方法。B.酸堿調節(jié)，使蛋白質與離子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白質與一些陰離子形成沉淀，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽等；在堿性溶液中，蛋白質與一些陽離子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。第七十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2.雜蛋白去除-變性

Denaturation

蛋白質從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結構的過程稱為變性。變性蛋白質溶解度較小。加熱，大幅度調節(jié)pH值，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處：加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產物；極端pH值也會導致某些目的產物失活，且要消耗大量酸堿；有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。

第七十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日鏈霉素生產中，采用調pH至酸性（pH3.0），加熱至70℃，維持半個小時的方法來使蛋白變性，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。檸檬酸發(fā)酵液，采用加熱至80℃以上，使蛋白質變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，從而大大提高了過濾速度。第七十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日3.雜蛋白去除-

吸附法adsorption加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質而除去。四環(huán)類抗生素生產中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3[Fe(CN)5]2的膠狀沉淀來吸附蛋白質，利用此法除蛋白質已取得很好的效果。在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。第七十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

第三節(jié)固液分離及設備一、影響發(fā)酵液固液分離的因素二、常見的固液分離的方法第七十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日大部分工業(yè)生物分離的第一步往往是將不溶物質從發(fā)酵液中除去，即固液分離。固液分離是生物產品生產中經常遇到的重要單元操作。培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產品和半成品等都需要進行固液分離。其中發(fā)酵液由于種類多，黏度大，和成分復雜，其固液分離最為困難。第七十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日一、影響發(fā)酵液固液分離的因素1）發(fā)酵液中懸浮離子的大小第七十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日這些不溶性固體的濃度和顆粒大小的變化范圍很寬。濃度可高達每單位體積含60%的不溶性固體，又可低至每單位體積僅含0.1%。粒徑的變化可以從直徑約為1um的微生物，到直徑為1mm的不溶性物質。第七十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2）發(fā)酵液的黏度

固液分離速度通常與粘度成反比，粘度越大，固液分離越困難。影響粘度的因素：菌體的種類和濃度（重要因素）：通常絲狀菌、動物或植物細胞懸浮液粘度較大，濃度增大，粘度也提高。培養(yǎng)液中蛋白質、核酸大量存在：通常細胞破碎或細胞自溶后粘度增大。因此細胞破碎的程度應控制，發(fā)酵放罐時間要適宜。第七十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基成分：如用黃豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都會升高。某些染菌發(fā)酵液，如染細菌，則粘度會增大。發(fā)酵過程的不正常處理，如大量過剩的培養(yǎng)基和消沫油加入，都會使粘度增大。第八十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日收集胞內產物的細胞或菌體，分離除去液相;收集含生化物質的液相，分離除去固體懸浮物（細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質的沉淀物和它們的絮凝體等）。固液分離的目的第八十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日二、常見的固液分離方法過濾(Filtration)離心(Centrifugation)全發(fā)酵液提取(Fermentationextraction)第八十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日不同性狀的發(fā)酵液應選擇不同的固液分離方法和設備。如霉菌和放線菌為絲狀菌，體形大，發(fā)酵液都采用過濾方法；而細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，外形尺寸在1-10um范圍。一般采用高速離心機分離，但若對其發(fā)酵液采用適當?shù)姆椒ń涱A處理后，也可采用過濾方法。第八十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日（一）過濾filtration過濾操作是借助于過濾介質，在一定的壓力差ΔP作用下，使懸浮液中的液體通過介質的孔道，而固體顆粒被截留在介質上，從而實現(xiàn)固液分離的單元操作。過濾介質filtermedium

:過濾采用的多孔物質；濾漿filterpulp

:所處理的懸浮液；濾液filtrate

:通過多孔通道的液體；濾餅或濾渣filtercake:被截留的固體物質。第八十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日所用過濾的介質為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等，填充于過濾器內構成過濾層，當懸浮液通過過濾層時，固體顆粒被阻攔式吸附在濾層的顆粒上，使濾液澄清。過濾介質起著主要的過濾作用。此種方法適用于固體含量少于0.1g/100mL，顆粒直徑在5~100μm的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。1、澄清過濾第八十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第八十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2、濾餅過濾過濾介質為濾布，當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。在濾餅過濾中，當濾餅至一定厚度時即起主要的過濾作用。適合于固體含量大于0.1%的懸浮液的過濾分離。第八十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第八十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日A、過濾推動力

懸浮液自身壓強差、重力；懸浮液的—外加壓力；過濾介質的—抽真空；離心力。第八十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日B、過濾阻力介質阻力：一般過濾初較明顯濾餅阻力

濾餅厚度：隨過濾進行而增加濾餅特性：顆粒形狀、大小

大多情況下，過濾阻力主要取決于濾餅阻力?？蓧嚎s濾餅：形成的濾餅剛性不足，其內部空隙結構隨著濾餅的增厚或壓差的增大而變形，空隙率減小。不可壓縮性濾餅第九十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日C、濾餅的質量比阻衡量過濾特性的主要指標是濾餅的質量比阻rB，它表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，決定過濾的流速。與濾餅的結構特性有關。對于可壓縮性濾餅，rB是操作壓力差的函數(shù)：

rB＝r(ΔP)mr-不可壓縮濾渣的比阻，對于一定的料液為常數(shù)；

m-壓縮性指數(shù)，一般取，對不可壓縮性濾餅m為0。對于不可壓縮性濾餅，rB為常數(shù)，第九十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日濾餅的質量比阻與過濾關系濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。開始過濾時應注意不能很快提高壓差，通常靠液柱的自然壓差進料，并應緩慢地，逐步地升高壓力，一般在相當長的時間內，壓力差不要超過0.05MPa，最后的壓差也不超過0.3－0.4MPa。若操作壓力控制過高，由于比阻值的急劇增加，會使過濾速度很快下降，以至達到不能繼續(xù)過濾的程度。第九十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日D、恒壓下的過濾方程恒壓下，可壓縮性濾餅的比阻應為常數(shù)。如過濾介質的阻力相對較小可以忽略不計，

q—

到時間τ時通過單位過濾面積的濾液量，m3；

ΔP—

壓力差，Pa；

μ—

濾液粘度，Pa·s；

rB—

濾餅的質量比阻，m/kg；

XB

—

通過單位體積濾液所形成的濾渣重量(干重),kg／m3；

τ—

過濾時間，s第九十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

E.質量比阻的計算質量比阻可根據(jù)上式，利用圖解法求得。以τ/q為縱軸，以q為橫軸所得的直線斜率為M，則rB可按下式計算：

根據(jù)濾餅的質量比阻值，可衡量各種不同發(fā)酵液過濾的難易程度。第九十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

真菌的菌絲比較粗大，如青霉素的重量比阻為(0.15一0.20)xl012m/kg左右，發(fā)酵液容易過濾。放線菌發(fā)酵液菌絲細而分枝，交織成網絡狀，如鏈霉素重量比阻為2000x1012m/kg左右，過濾較困難，一般需經預處理。細菌發(fā)酵液的菌體更細小，質量比阻值更大，直接過濾十分困難，如果不用絮凝等方法預處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過濾設備完成過濾操作。第九十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第九十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日F、過濾速度的強化降低濾餅比阻力rB

一切能夠降低rB的方法：如添加電解質、絮凝劑、凝固劑、助濾劑等。降低濾液黏度μ

黏度愈低，過濾阻力愈小。加熱、去雜蛋白、絮凝、調pH、選擇合適的放罐時間。第九十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

降低懸浮液中懸浮固體的濃度過濾速度與獲得濾餅體積成反比。因此應盡可能降低培養(yǎng)基配料濃度（如玉米粉、豆餅粉的濃度）。如在鏈霉素發(fā)酵液的培養(yǎng)基中，如以黃豆粉代替玉米漿，則質量比阻增大倍。對發(fā)酵液進行預處理，改善濾液性質第九十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日G、過濾介質選擇過濾介質起過濾作用，還是濾餅的支撐物。應具有足夠的機械強度和盡可能小的流動阻力。合理選擇過濾介質：過濾介質所能截留的固體粒子大?。和ǔＲ赃^濾介質的孔徑表示。常用的過濾介質中，纖維濾布所能截留的最小粒子約10μm，硅藻土為lμm，超濾膜可小于0.5μm。過濾介質的透過性：是指在一定的壓力差下，單位時間單位過濾面積上通過濾液的體積量，它取決于過濾介質上毛細孔徑的大小及數(shù)目。第九十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日（1）過濾介質-織物介質又稱濾布，應用最廣泛，包括由棉、麻等天然纖維濾布和合成纖維濾布。其過濾性能受許多因素的影響，其中最重要的是纖維的特性、編織紋法和線型。

最高溫度℃密度(kg／m3)吸水率％耐磨棉尼綸滌綸92105—12014515511413816-226.5-8.30.04-0.08良優(yōu)優(yōu)第一百頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

濾

液澄清度阻力濾餅中含

水濾餅脫落壽命堵孔傾向平紋斜紋緞紋依次降依次降依次減依次易中長短依次易第一百零一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日（2）過濾介質-粒狀介質有硅藻土、珍珠巖粉、細砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是優(yōu)良的過濾介質：①一般不與酸堿反應，化學性能穩(wěn)定；②形狀不規(guī)則，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；③無毒且不可壓縮，形成的過濾層阻力不隨操作壓力變化。第一百零二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

硅藻土過濾介質通常有三種用法：（1）作為深層過濾介質。硅藻土過濾層具有曲折的毛細孔道，借篩分、吸附和深層效應作用除去懸浮液中的固體粒子，截留效果可達到1μm。（2）作為預涂層。在支持介質的表面上預先形成一層較薄的硅藻土預涂層，用以保護支持介質的毛細孔道不被濾餅層中的固體粒子堵塞。（3）用作助濾劑第一百零三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日（3）過濾介質-多孔固體介質如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板狀或管狀，孔隙很小且耐腐蝕，常用于過濾含有少量微粒的懸浮液。第一百零四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日典型過濾設備：按操作方式分類：間歇過濾機、連續(xù)過濾機按操作壓強差分類：壓濾、吸濾和離心過濾實驗室用抽濾裝置板框壓濾機（間歇操作）轉筒真空過濾機（連續(xù)操作）過濾式離心機3、固液分離過濾設備第一百零五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1）實驗室用抽濾裝置第一百零六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2）板框壓濾機

plateandframefilter

板框壓濾機的過濾推動力來自泵產生的液壓或進料貯槽中的氣壓。廣泛應用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。第一百零七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日板框壓濾機包括板和框，多做成正方形，角端均開有小孔，裝合壓緊后即構成供濾漿或洗水流通的孔道。框的兩側覆以濾布，空框與濾布圍成了容納濾漿及濾餅的空間，濾板用以支撐濾布并提供濾液流出的通道。第一百零八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日板框式壓濾機在過濾時，懸浮液由離心泵或齒輪泵經濾漿通道打入框內，濾液穿過濾框兩側濾布，沿相鄰濾板溝槽流至濾液出口，固體則被截留于框內形成濾餅。濾餅充滿濾框后停止過濾?？虬宓谝话倭憔彭摚惨话倬攀隧?，2022年，8月28日第一百一十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第一百一十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日板框壓濾機優(yōu)點過濾面積大，結構簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應性強。它最重要的特征是通過過濾介質時產生的壓力降可以超過0.1MPa,這是真空過濾器無法達到的，可以用以過濾細小顆?；蛞后w粘度高的物料。國內廣泛采用。缺點不能連續(xù)操作，設備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時間較長（解框、卸餅、洗濾餅、濾布，重新壓緊板框等）。第一百一十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日自動板框式壓濾機自動板框壓濾機在板框壓緊；卸餅、清洗等操作中可自動完成，勞動強度小，輔助操作時間短。自動壓濾機結構復雜，價格昂貴，在一定程度上限制了它的應用和發(fā)展。第一百一十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日3）真空轉鼓過濾機（rotary-drumvacuumfilter）真空過濾設備以大氣與真空之間的壓力差作為過濾操作的推動力。生物工業(yè)中，用得較多的是轉筒式真空過濾機和帶式真空過濾機。第一百一十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日轉筒真空過濾機是一種連續(xù)操作的過濾設備，設備的主體是一個由篩板組成能轉動的水平圓筒，表面有一層金屬絲網，網上覆蓋濾布,圓筒內沿徑向被筋板分隔成若干個空間。第一百一十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日轉筒真空過濾機結構：轉筒，扇形格(18格)；

濾室；分配頭；動盤(18個孔，分別與扇形格的18個通道相連)；定盤(三個凹槽：濾液真空凹槽、洗水真空凹槽、壓縮空氣凹槽，分別將動盤的18個孔道分成三個通道)；

濾漿槽。第一百一十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第一百一十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日轉筒下部浸入濾漿槽中，浸沒角約900-1300，圓筒緩慢旋轉時(轉速約0.5-2r／min)，筒內每一空間相繼與分配頭中的3個室相通，可順序進行過濾、洗滌、吸干、吹松、卸餅等項操作。即整個圓筒分為過濾區(qū)、洗滌及脫水區(qū)，卸渣及再生區(qū)3個區(qū)域。第一百一十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日轉筒真空過濾機優(yōu)點：轉筒真空過濾機可吸濾、洗滌、卸餅、再生連續(xù)化操作，生產能力大，勞動強度小。缺點：輔助設備多，投資大，且由于真空過濾，推動力?。ú怀^8×104Pa），濾餅濕度大（20％～30％）。主要適用霉菌發(fā)酵液，對菌體細小、黏度大鋪助濾劑。對于濾餅阻力較大的物料適應能力較差。第一百一十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第一百二十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日過濾機外涂有厚厚的一層硅藻土，水和酶可以滲透過去，而培養(yǎng)基和微生物卻被黏著在硅藻土表面上。轉鼓過濾機旋轉的過程中，發(fā)酵液噴散開來。水和酶被吸進過濾機的中央，培養(yǎng)基和微生物則留在硅藻土表面，稍后用巨型刀片將硅藻土及附著其上的培養(yǎng)基及微生物一同去除。第一百二十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第一百二十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日3）帶式真空過濾機帶式真空過濾機（是自動連續(xù)運轉、并能按工藝要求進行無級調速以及操作方便和動力消耗低的一種新型高效的脫水設備。第一百二十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日帶式真空過濾機流程1、進料→過濾→濾餅洗滌→吸干→卸料→濾布清洗連續(xù)進行，配有PLC控制，自動化程度高。

2、真空過濾盤分段設計，可滿足不同物料過濾、洗滌、吸干的工藝要求，濾帶運行速度采用變頻無級調速，對不同物料有廣泛的適應性。3、在同一設備上可采用多次逆流洗滌得到高濃度的濾液，也可采用并流洗滌或順流洗滌獲得高純度的濾餅。第一百二十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日水平帶式真空過濾器簡圖第一百二十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日第一百二十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

水平圓盤過濾器1—分配頭2—螺旋輸送器3—過濾盤水平回轉翻盤式真空過濾器第一百二十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

優(yōu)點：處理量大，濾餅厚度可達200mm，并可根據(jù)對物質的洗凈要求進行濾餅洗滌，洗滌效果良好，操作靈活。缺點：占地面積大，有效過濾面積小，投資高。第一百二十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日結構：轉鼓濾餅濾布濾網離心過濾機工作原理圖轉鼓(上有小孔，亦稱懸框)；濾網；濾布；機架。原理：

由于離心力作用，液體產生徑向壓差，通過濾餅、濾網及濾筐而流出。4）離心過濾機（centrifugalfilter）第一百二十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日設備主要結構過程特點適用性板框壓濾機濾板/濾框/夾緊機構/機架裝合過濾洗滌卸渣整理加壓過濾，推動力較大結構簡單，造價低；過濾面積大，能耗少；間歇操作；洗滌時間長，生產效率低。應用廣泛。對原料的適應性強轉鼓真空過濾機轉筒(濾網、濾布)/分配頭、濾漿槽過濾洗滌吹干卸渣連續(xù)化生產，自動化程度高真空過濾，推動力較?。?，濾餅濕度大，設備投資高適于粒度中等，粘度不太大的物料離心過濾機轉鼓(濾網、濾布)/機架過濾洗滌卸渣離心過濾，推動力最大；濾液濕度小，設備成本高，應用廣泛，過濾面積小。幾種過濾設備的比較第一百三十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日5）硅藻土過濾機diatomitefilter硅藻土中的硅藻有許多不同的形狀，由于硅藻土具有細膩、松散、質輕、多孔、吸水和滲透性強的特性，所以它是一種性能優(yōu)良的工業(yè)濾劑。硅藻土過濾是以硅藻土作為過濾介質，它是一種預涂型過濾器，預涂、過濾、反沖洗是硅藻土過濾的一般工藝過程。在釀造、飲料、酒類和水處理等方面得到廣泛應用。目前，國內主要用于酒類和飲料過濾。

第一百三十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日硅藻土過濾機第一百三十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日硅藻第一百三十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日硅藻土過濾機第一百三十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日又稱切向流過濾（Cross-FlowFiltration）傳統(tǒng)過濾時過濾液體垂直于過濾介質，過濾阻力主要來之濾餅。錯流過濾打破了傳統(tǒng)過濾的機制，即液體的流向和濾膜相切。在壓力推動下，懸浮液以高速在管狀濾膜的內壁作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質表面的固體（濾餅）移走，而附著在濾膜上的濾餅很薄，因而能在長時間內保持穩(wěn)定不變的過濾速度。６）錯流過濾第一百三十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日微濾過程示意圖,料液快速經過薄膜,以減少形成濾餅錯流過濾第一百三十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日朗極化工公司膜澄清過濾和膜濃縮的“錯流過濾系統(tǒng)”

陶瓷膜錯流過濾第一百三十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日錯流過濾特點收率高（97-98%）質量好減少處理步聚染菌罐也能進行處理介質阻力大不能得到干濾餅需要大的膜面積目前適用于小分子的分離第一百三十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日（二）離心分離

離心和過濾一樣，也是固液分離的一種單元操作。對于一些濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，我們可以采用過濾方法分離。而對于一些固體顆粒小、溶液粘度大的生物體系，過濾實際上是很難進行的，必須采用離心技術方能達到目的。第一百三十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。與過濾設備相比，離心設備的價格昂貴。但當固體顆粒細小而難以過濾時，離心操作往顯得十分有效。1、離心分離的概念

第一百四十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日離心沉降是科學研究與生產實際中最為廣泛使用的非均相分離手段，不僅適用于菌體和細胞的回收或除去，而且可用于血球、胞內細胞器、病毒以及蛋白質的分離，也廣泛應用于液-液分離。對大多數(shù)生物發(fā)酵液可以離心但不能有效地過濾分離，所以離心往往是很有效的方法。第一百四十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日優(yōu)點

分離速度快；分離效率高；液相澄清度好。缺點

與過濾設備相比，設備投資高；能耗大；離心產生的固體濃縮物和過濾產生的濃縮不同,通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體，而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。2、離心分離的特點

第一百四十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日3、離心分離顆粒沉降速度d－顆粒直徑；ρp

－顆粒密度；ρm

－液體介質密度；η－液體介質粘度；ω－旋轉角速度；r－轉軸中心到顆粒中心距離。

與顆粒直徑有關，大顆粒容易沉降。與顆粒密度和介質密度之差(ρp-ρm)成正比。與介質粘度成反比，隨介質粘度增大而減小。增大離心力（ω2r）可提高沉降速度。對沉降速度小的顆粒，提高轉速是有效的方法。離心力Fc=ω2r第一百四十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

分離因數(shù)Fr（離心力強度）：離心力與重力的比值，表示粒子在離心機中產生的離心加速度與自由下降的加速度之比;分離因數(shù)Fr是離心分離設備的一重要技術指標，是衡量離心程度的參數(shù)。在轉鼓直徑相同的情況下，離心分離因數(shù)越大，則轉速越高，離心力也越強，反之離心分離因數(shù)越小，則轉速較低，離心力也小。第一百四十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日離心力與轉速rpm/minRCF徑向距離（cm）第一百四十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日在科技文獻中，說到離心條件時，有時用轉速表示，如12000rpm；有時用離心力表示，如1000g離心力。離心力為1000g，即Fr=1000。此時的轉速可由下式推導得出：

r×ω2=r×4π2N2=1000g

轉速N=[1000g/（r×4π2）]1/2第一百四十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日4、沉降系數(shù)S是離心技術中一個最基本的物理量，稱為沉降系數(shù)。沉降系數(shù)S：指物質在單位離心場的沉降速度，是關于蛋白質等生物大分子的一個重要參數(shù)，一般用斯維德貝格（Svedberg）單位表示，1S=10-13s。第一百四十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

通過υg=dr／dt=Srω2的積分式，可得到溶質完全沉淀所需要的時間：在生物化學研究中，沉降系數(shù)S有兩個重要用途：1）預計沉降時間R1、R2分別表示旋轉軸心到樣品表面和離心管底部的垂直距離。R2R1第一百四十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

蛋白質的相對分子質量越大，沉降系數(shù)越大。因此，若已知S，就可以計算溶質的離心沉降速度。2）測定物質分子質量M：該分子不含水的相對分子重量；R：氣體常數(shù)；T：絕對溫度；S：分子的沉降系數(shù)；ν：分子的微分比容（當一克溶質加到一個大體積的溶液中所占有的體積）；ρ：溶劑的密度。第一百四十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日按速度和離心力：1、常速離心機最大轉速8000rpm(r/min),相對離心力(RCF)104g以下,用于細胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機

1×104-2.5×104rpm，相對離心力104-105g,用于細胞碎片、較大細胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機轉速2.5-8×104rpm，相對離心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白質、細胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。5、離心機的種類與用途對于常速和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和時間，就能達到分離效果。第一百五十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日按離心機的作用方式：斜角式平拋式管式蝶式螺旋式多室第一百五十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1）斜角式離心機是一類結構最簡單的實驗室常用離心機，指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉子；角度越大，沉降越結實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側會出現(xiàn)顆粒沉積。第一百五十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日1）斜角式離心機結構穩(wěn)定，可裝載較多的樣品使用較高的轉速。加速或減速時，對樣品有攪動。有些梯度離心要求用角轉頭，否則形成的梯度不均一，線性很差。第一百五十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日2）平拋式離心機平拋式離心機一類結構簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉速一般在3000-6000rpm。轉子活動管套內的離心管，靜止時垂直掛在轉頭上，旋轉時隨著轉子轉動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，但轉頭結構復雜，最高轉速相對要低容量也小一些。

第一百五十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日平拋式離心機轉子第一百五十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日３）管式離心機

（tubular-bowlcentrifuge）管式離心機具有一個細長而高速旋轉的轉鼓，轉鼓內裝有縱向平板，其下部有進料口。上部兩側有重液相和輕液相出口。第一百五十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左右）下由進料管經底部空心軸進入鼓內，靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉鼓相同的角速度。轉鼓帶動物料高速旋轉，在離心力下，懸浮液沿轉鼓內壁向上流動的，料液在離心力場的作用下因其密度差的存在而分離。澄清后的液相流動到轉鼓上部的排液口排出。比重大的固體微粒逐漸沉積在轉鼓內壁形成沉渣層，達到一定數(shù)量后，停機人工清除。第一百五十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

第一百五十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日管式離心機特點：結構簡單，可提供較大離心力，轉速高，分離因數(shù)高達15000-65000。管狀離心機可以冷卻，有利蛋白質分離間歇操作，須定時拆卸、清洗適用于于分離乳濁液及含細顆粒的稀懸浮液，適用于固含量低于1%，顆粒度小于5微米，黏度大的懸浮液澄清或固液兩相密度差較小的分離。第一百五十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日4）碟片式離心機disk-bowlcentrifuge是在管式離心機的基礎上發(fā)展起來的，在轉鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。

是生物工業(yè)中應用最為廣泛的一種離心機

有一個密封的轉鼓，內裝十至上百個錐頂角為60~100゜錐形碟片。碟片間的距離一般為0.5-2.5mm,第一百六十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日碟片式離心機工作原理當懸浮液在動壓頭的作用下，經中心管流入高速旋轉的碟片之間的間隙時，便產生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運動，而后在離心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向轉子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動下沿著碟片的隙道向轉子中心流動，然后沿中心軸上升，從套管中排出，達到分離的目的

第一百六十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機碟片上不開孔，只有一個清液排出口。沉積在轉鼓內壁上的沉渣，間歇排出。只適用于固體顆粒含量很少的懸浮液。噴嘴排渣的碟片離心機當固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。在有特殊形狀內壁的轉鼓壁上開設若干噴嘴

活門（活塞）排渣的碟片離心機這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%，故可使分離因素達15000左右，可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產中分離物的澄清。第一百六十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日碟片式離心機第一百六十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日5）螺旋式離心機scroll-typecentrifuge連續(xù)操作的沉降設備。轉鼓內有可旋轉的螺旋輸送器，其轉數(shù)比轉鼓的轉數(shù)稍低。有立式和臥式兩種，臥螺機是一種全速旋轉，連續(xù)進料、分離和卸料的離心機，最大離心力可達6000，操作溫度可達300℃用于分離含固量較多的懸浮液，生產能力較大。第一百六十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日螺旋式離心機工作原理轉鼓與螺旋以一定差速同向高速旋轉，懸浮液通過螺旋輸送器的空心軸進入機內中部，由進料管連續(xù)引入螺旋內筒，加速后進入轉鼓。在離心力場作用下，固相物沉積在轉鼓壁上形成沉渣層。輸料螺旋將沉積的固相物連續(xù)不斷定推至轉鼓錐端，經排渣口排出機外，較輕的液相物則形成內層液環(huán)，由轉鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉鼓，經排液口排出機外。第一百六十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日6）多室式multichambercentrifuge

多室式離心機的轉鼓內有若干同心圓筒組成的環(huán)狀分離室加長了被分離液體的流程，使液層減薄，增加了沉降面積，減少了沉降距離。同時還有粒度篩分的作用，懸浮液中的粗顆粒沉降到靠近內部的分離室壁上，細顆粒則沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分離液經溢流排出。常用于抗菌素液－液萃取分離，果汁和酒類飲料的澄清等。第一百六十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日①冷凍離心機使用前先降溫。②離心前一定注意平衡。③離心時蓋子一定要蓋好④低轉速時液體不要加得太滿，避免甩出腐蝕性液體傷害離心機。⑤離心設備一般價格不菲，其關鍵部位為軸，使用特殊的材料制成，既有剛性又有韌性，應注意保護。

使用中應注意的問題第一百六十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日6、超離心法利用物質的沉降系數(shù)、質量和形狀不同，應用強大的離心力（相對離心力5*105g），將混合物中各組分分離，濃縮、提純的方法，稱為超離心法。運用超離心法已經成功分離制備各種亞細胞物質，如線粒體、微粒體、溶酶體、DNA和各種RNA。如用5*105g的強大離心力，長時間離心（17h以上），可獲得具有生物活性的DNA、m-RNA、t-RNA等，為遺傳工程提供了必需基礎，是現(xiàn)代生物技術領域研究中不可缺少的實驗室分析制備手段。第一百六十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日A、超離心的原理粒子在沉降場沉降的基本公式：如果粒子在離心場中作勻速直線運動，則Uw=dr/dt結合兩式積分，得適用范圍：不適用于非球形粒子；只適用于牛頓流體的稀溶液即在某種介質中，使一種球形粒子從液體的彎月面沉降到離心管某部（如底部）所需的時間。第一百六十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

在某一轉速時，沉降一組均勻的球形顆粒所需要的時間與它們的直徑的平方以及它們的密度和懸浮介質的密度之差成反比，與介質的黏度成正比。當粒子直徑d和密度ρs不同時，移動同樣距離所需的時間不同，在同樣的沉降時間，其沉降的位置也不同。這是超離心技術的基礎。第一百七十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日B、超離心技術的分類①粒子差速離心定義：采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降粒子，在不同離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。目的：以菌體細胞的收集或除去為目的，是分級離心操作的一種特殊情況，稱為一級分級分離。一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的粒子。第一百七十一頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

172細胞破碎液離心600g，10min[沉降層]細胞核(4-6μm)[上清液]細胞膜碎片線粒體(1μm)溶酶體(0.25-0.5μm)核糖體(18nm)水溶性物質離心10000g，10min[沉降層]細胞碎片線粒體溶酶體[上清液]核糖體水溶性物質離心100000g，3h[沉降層]核糖體[上清液]水溶性物質細胞破碎液的差速離心分級第一百七十二頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

缺點：每次沉降粒子不是均一的，在某離心力下除了大粒子都沉淀以外，部分中粒子及少部分小也可能沉淀下來；且數(shù)目隨離心時間的延長而增加，不容易得到粒度均勻的粒子，需要將沉淀重新懸浮，洗滌，再次離心，反復數(shù)次，才有較好的效果。第一百七十三頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日②一般密度梯度離心、分級區(qū)帶離心離心時把混合樣品鋪放在一個連續(xù)的液體梯度上，然后進行離心，由于不同組份顆粒在梯度液體里沉降速率的差別，而在離心的某一時刻，使得粒子在完全沉降之前，形成了數(shù)個含單一組分顆粒的區(qū)帶。利用生物組份在尺寸上的差異而形成的沉降速率不同，選擇在某一特定時刻，當各個純樣品區(qū)帶之間的距離拉得最遠時停止離心，即可達到分離的目的。僅用于有一定沉降系數(shù)差的粒子，與粒子密度無關，因此大小相同，密度不同的粒子（如線粒體、溶酶體和過氧化物酶）不能用此法分離。用于RNA-DNA混合物及其他細胞成分的分離。第一百七十四頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日③等密度梯度離心定義：當不同粒子存在密度差時，在離心力場作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）并形成區(qū)帶。其結果是依樣品物質密度的不同在梯度溶劑中形成一個個區(qū)帶。位于等密度點上的粒子沒有運動，區(qū)帶的形狀和位置都不受離心時間的影響，體系處于動態(tài)平衡。分離效率僅取決于粒子的密度差，與粒子的大小、形狀無關。密度差越大，分離效果越好。分類：預形成梯度；自形成梯度（平衡等密度梯度）。第一百七十五頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日A、預形成密度離心需要預先制備密度梯度，常用的梯度介質主要是非離子型化合物（如蔗糖、甘油等）。離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續(xù)梯度溶液，也可以通過一個梯度混合器產生連續(xù)梯度密度，這個密度包括了所有需要研究的密度范圍。離心時把樣品鋪放在梯度介質的液面上，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等時，粒子才發(fā)生沉降，交排列成不同的區(qū)帶。預形成密度離心的密度梯度中最大密度小于待分離的目標產物的密度。第一百七十六頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

方法：1、事先調配好的不同濃度的蔗糖溶液，依濃度由大到小逐層加入離心管中即可形成密度梯度。2、如果要制成連續(xù)的蔗糖密度梯度，則將一定濃度的蔗糖溶液高速離心一段時間即可。3、除蔗糖外，如CsCl（可用于核酸的分離）和NaBr（可用于脂蛋白的分離）等，在離心力的作用下可以自動形成密度梯度。4、等密度離心法一般適用于蛋白質、核酸等生物大分子的分離純化。5、缺點是處理量小，僅限于實驗室規(guī)模。第一百七十七頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日B、自形成梯度的等密度離心（平衡等密度離心）在這種離心法中，介質的梯度不是預先配制，而是在離心過程中，由于離心力的作用而逐漸形成的。常用的梯度介質有粒子型鹽類如：銫鹽或銣鹽和三碘化苯衍生物等。離心時把密度均一的介質溶液和樣品混合后裝入離心管中，通過離心自形成梯度，讓粒子在梯度中形成再分配離心達到平衡后，不同密度的粒子在樣度中各自分配到其等密度點的特定位置上，形成不同的區(qū)帶。樣品物質的密度應介于介質梯度中最大和最小密度之間，否則，樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。第一百七十八頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日

第一百七十九頁，共一百九十八頁，2022年，8月28日（1）差速離心分離法差速離心是生化工業(yè)中常用的離心分離方法，在生產和科研試驗中都是最常用的。以前所學離心為一次離心，是以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心式分級離心操作的一種特殊情況，為一級分級分離。但是由于料液中菌體和細胞、各種細胞器以及其他的顆粒，其大小密度不同，離心時其沉降速度不同，所以在工業(yè)中應根據(jù)實際物料的特點、分離的目的及所分離的程度選擇適當?shù)牟僮鳁l件。5.4離心分離類型第一百八十頁，共一百九十八頁，2022年，8月28