液體乳中三聚氰胺的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法

————附件7液體乳中三聚氰胺的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法（征求意見(jiàn)稿）范圍本方法規(guī)定了液體乳中三聚氰胺的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。本方法適用于巴氏殺菌乳、滅菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速測(cè)定。原理本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的三聚氰胺與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測(cè)卡中檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過(guò)檢測(cè)線與控制線（C線）顏色深淺比較，對(duì)樣品中三聚氰胺進(jìn)行定性判定。試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。試劑3.1.1甲醇。3.1.2三羥甲基氨基甲烷（Tris）。3.1.31mol/L鹽酸：移取79.36mL濃鹽酸，加水100mL水中，定容至1L。3.1.4甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用。3.1.5稀釋液：準(zhǔn)確稱取6.05gTris（3.1.2）和8.5g1mol/L鹽酸（3.1.3），加水定容至1L，混勻后備用。參考物質(zhì)參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見(jiàn)表1，純度≥99%。表1三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量三聚氰胺Melamine108-78-1C3H6N6126.12注：或等同可溯源物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL）：精密稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）適量，置于10mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1mg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；或可直接購(gòu)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4℃避光保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月。材料三聚氰胺膠體金免疫層析試劑盒：適用基質(zhì)為液體乳。金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。試紙條或檢測(cè)卡。儀器和設(shè)備移液器：200μL、1000μL和5mL。渦旋混合器。電子天平：感量為0.01g。環(huán)境條件：溫度15—35℃，濕度≤80%。分析步驟試樣制備取適量有代表性樣品充分混勻。試樣提取準(zhǔn)確稱取樣品0.5g于離心管中，加入5mL稀釋液（3.1.5），渦旋混勻提取5min，即得待測(cè)液。測(cè)定步驟試紙條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟吸取150—200μL樣品待測(cè)液于金標(biāo)微孔（3.4.1）中，抽吸5~10次使混合均勻，不要有氣泡，40℃溫育3min，將檢測(cè)試紙條（3.4.2）樣品端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，40℃溫育5min，從微孔中取出試紙條，進(jìn)行結(jié)果判定。檢測(cè)卡測(cè)定步驟吸取150—200μL樣品待測(cè)液于檢測(cè)卡加樣孔（3.4.2）中，室溫反應(yīng)3~5min，進(jìn)行結(jié)果判定。質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)?？瞻自囼?yàn)稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取空白試樣100g（精確至0.01g）置于100mL玻璃溶液瓶中，加入250μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1?mg/mL）（3.3.1），使試樣中三聚氰胺濃度為2.5mg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。結(jié)果判定要求通過(guò)對(duì)比控制線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀如圖1。無(wú)效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測(cè)卡無(wú)效。陽(yáng)性結(jié)果消線法檢測(cè)線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性。比色法檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺或幾乎不顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性。陰性結(jié)果消線法檢測(cè)線（T線）、控制線（C線）均顯色，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測(cè)限，判定為陰性。比色法檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測(cè)線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測(cè)限，判定為陰性。圖1試紙條/檢測(cè)卡目視判定示意圖質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。結(jié)論三聚氰胺與滅蠅胺有交叉反應(yīng)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。性能指標(biāo)檢測(cè)限：2.5mg/kg。靈敏度：靈敏度應(yīng)≥99%特異性：特異性應(yīng)≥85%。假陰性率：假陰性率應(yīng)≤1%。假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%。注：性能指標(biāo)計(jì)算方法參見(jiàn)附錄A。其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定，可根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T22388-2008）。本方法使用試劑盒可能與滅蠅胺存在交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判定為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)采用實(shí)驗(yàn)室儀器方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T22388-2008）對(duì)三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。 附錄A快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測(cè)結(jié)果b總數(shù)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（χ2）χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C為方法