人體外周血淋巴細(xì)胞染色體制備與觀察實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備，染色體組型分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法。掌握人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體標(biāo)本制備。2、初步掌握人類染色體G－帶的顯示方法及人類染色體G－帶在染色體識別中的意義。3、熟悉人類染色體的鏡下檢查和核型分析方法。初步掌握人類染色體G帶的特征及其識別。二、實(shí)驗(yàn)原理所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當(dāng)?shù)呐嗯囵B(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細(xì)胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細(xì)胞。用低滲鹽溶液（一般是0.075mol/L的KCl）處理，使其中的紅細(xì)胞及分裂相細(xì)胞膜和一部分細(xì)胞質(zhì)除去，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。人類外周血細(xì)胞本來是終末分化細(xì)胞，一般沒有分裂能力，但經(jīng)PHA（植物血球凝集素）或ConA等藥物刺激后，轉(zhuǎn)變成可分裂的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。染色體顯帶是將染色體標(biāo)本經(jīng)過一定程序處理，并用特定染料染色，使染色體沿其長軸顯現(xiàn)明暗或深淺相間的橫行帶紋――染色體帶，這種技術(shù)，稱為染色體顯帶技術(shù)。通過顯帶，人們可以準(zhǔn)確地識別每一條染色體及染色體上的各個(gè)區(qū)段，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化。在所有的顯帶技術(shù)中，G顯帶（Gbanding）是最常見的顯帶技術(shù)，它是將染色體標(biāo)本用堿、胰蛋白酶或其它鹽溶液處理后，再用Giemsa染液染色，在普通顯微鏡下，可見深淺相間的帶紋，稱G帶（Gband）。G顯帶方法簡便，帶紋清晰，染色體標(biāo)本可以長期保存，因此被廣泛用于染色體病的診斷和研究。正常人類染色體的數(shù)目為46條(23對)，1960年的Denver會議和1963年的London會議制定了統(tǒng)一的人類染色體命名體制：按照染色體的相對長度、臂比和著絲粒指數(shù)，將常染色體（22對）按大小用阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記，順次排列為1～22號，性染色體用X和Y標(biāo)記；并按染色體大小和著絲粒位置，把人類染色體分為七個(gè)組，用大寫字母A～G表示。染色體經(jīng)顯帶處理后，每條染色體都顯示出其特定的帶紋特征（見下表）。根據(jù)這些特征，可以準(zhǔn)確地識別每條染色體，檢出染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)畸變。表1人染色體組型及其特征三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材試劑：抗凝劑：肝素溶液（500U/ml）；培養(yǎng)基：RPMI1640,按照說明書配制后抽濾、分裝，凍存?zhèn)溆谩Ｐ∨Ｑ澹菏惺?，冰凍保存，用時(shí)在56℃水浴條件滅活。植物血球凝集素（PHA）：市售，按說明書要求使用抗菌素：青霉素：50000U/ml，鏈霉素：50000ug/ml，均用無菌生理鹽水配制中的終濃度均為100U/ml5%NaHCO3秋水仙素：20ug/ml低滲溶液：0.075mol/L氯化鉀固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）胰蛋白酶溶液：用滅菌生理鹽水配制成0.1%的胰蛋白酶溶液，用3%Tris溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。Giemsa染液：磷酸緩沖液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml，用時(shí)配制。器材：光學(xué)顯微鏡1臺，離心機(jī)1臺，恒溫水浴箱1臺，恒溫箱1臺，離心管3支，量簡2個(gè)，燒杯2只，培養(yǎng)瓶3個(gè)，冷濕載玻片3張，玻片架1臺，注射器1支，碘酒和酒精棉球，酒精燈，1臺，天平1臺，普通冰箱1臺，立式染缸1個(gè)、染色架1個(gè)、鑷子3個(gè)，直頭小吸管3支、橡皮吸頭3個(gè)、吸水紙若干，香柏油，擦鏡紙，剪子1個(gè)，膠水。正常人類染色體G帶核型圖，核型報(bào)告紙四、實(shí)驗(yàn)方法（一）培養(yǎng)液配制（在超靜工作臺內(nèi)無菌操作）；每個(gè)培養(yǎng)瓶（容積30ml）中加入5ml培養(yǎng)液，其中含：RPMI16404ml滅活小牛血清1mlPHA2.5mg青霉素500U鏈霉素500ug依次將上述試劑加入培養(yǎng)瓶中，反復(fù)吹打使其混合均勻，用5%NaHCO3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.2-7.4。（二）采血與培養(yǎng)：先以碘酒和75%乙醇消毒皮膚。用2ml滅菌注射器吸取約0.2ml肝素,作靜脈穿刺，抽取外周靜脈血1ml。轉(zhuǎn)動針筒以混勻肝素常規(guī)消毒后，立即將針頭插入滅菌小瓶內(nèi)，送入超凈工作臺，在火焰旁將血液滴入2～3個(gè)盛有5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶0.2～0.3ml（6號針頭45度傾斜，約20滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。貼好標(biāo)簽，將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)72h。（每天搖動培養(yǎng)瓶一次）（三）秋水仙素處理:向經(jīng)恒溫培養(yǎng)68-72小時(shí)的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，使其終濃度為0.4ug/ml,即每瓶（內(nèi)裝5ml培養(yǎng)基）中用6號針頭傾斜45度角滴4滴，輕輕將液體搖勻，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2-3小時(shí)。（四）標(biāo)本的制備:1、終止培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物混勻，倒人離心管內(nèi)，離心沉淀10分鐘(2000r/min)，棄去上清液。2、加入37℃預(yù)溫的低滲液8m1，輕輕打勻，置37℃水浴箱中15~20分鐘。（使白細(xì)胞膨脹，染色體分散、紅細(xì)胞解體。）3、低滲處理完畢后，直接加入新配的固定液1m1進(jìn)行預(yù)固定，混勻后，離心10分鐘(2000r/min)。4、棄去上清液，沿離心管壁緩慢加入固定液4m1，輕輕吹打混勻，置室溫15分鐘。5、離心沉淀2000r/min，10分鐘。6、棄去上情液，再加入固定液4m1吹打均勻重懸細(xì)胞，固定10分鐘。7、離心沉淀2000r/min，10分鐘。8、重復(fù)固定一次。9、盡量吸凈上清液，視管底剩下的細(xì)胞多少加入適量固定液(0.3～0.6m1)，輕輕吹打成細(xì)胞懸液。10、滴片：取保存在冰水中的冷濕載玻片1張，稍傾斜，用滴管吸取細(xì)胞懸液，從30~40cm高處滴2滴于玻片上，立即用口對準(zhǔn)玻片吹氣，使細(xì)胞在玻片上散開，然后在酒精燈上略烘一下(勿全烘干，過火3-5次)，在空氣中待干。（四）染色：1、常規(guī)制備的染色體標(biāo)本片室溫放置3天（老化）后（或37℃干燥20小時(shí)），轉(zhuǎn)移到80℃烤箱內(nèi)干燥2～3小時(shí)，自然冷卻至室溫后取出；2、將標(biāo)本片放入盛有胰蛋白酶溶液（預(yù)溫至37℃）的染色缸中消化（恒溫）。（消化片子時(shí)，一般準(zhǔn)備2~3張片子，第一張一般在胰酶緩沖液中浸泡消化35S,而后染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膨脹得不大，細(xì)胞膜沒有破裂，染色體聚集一團(tuán)伸展不開，可根據(jù)具體情況，將消化時(shí)間延長1~3s，而后再染色鏡檢）3、將消化過的標(biāo)本片立即放入Giemsa染色液中，室溫染色30分鐘；4、自來水輕輕沖洗（沖洗標(biāo)本片的背面）3～5秒鐘，晾干；5、鏡下觀察染色體分帶及染色情況。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、觀察自己制作的標(biāo)本片中染色體的形態(tài)、顏色及其顯帶情況，記錄并說明原因。計(jì)數(shù)10個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)。2、試述染色體G顯帶技術(shù)在人類染色體識別中的意義。3、繪出一套完整的中期分裂細(xì)胞的染色體圖；根據(jù)課堂提供的材料，排列初一份正常人類染色體G帶核型圖。4、實(shí)驗(yàn)報(bào)告六、注意事項(xiàng)（一）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體中取出的細(xì)胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的無菌，防止污染。2、無菌操作的要領(lǐng)和要求1）培養(yǎng)前準(zhǔn)備為做好培養(yǎng)前用品的充分準(zhǔn)備工作，根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的要求收集好已消毒的所需用品，清點(diǎn)無誤后置于超凈工作臺內(nèi)，這樣可避免操作開始后由于用品不全、往反取物而增加污染機(jī)會。2）超凈工作臺消毒打開紫外線殺菌燈照射消毒20-30分鐘，然后關(guān)閉紫外燈打開風(fēng)機(jī)，流入的空氣是經(jīng)過除菌板過濾的空氣，工作臺內(nèi)可保持無菌環(huán)境。為防止培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)液等受到紫外線照射，消毒前應(yīng)予先放在帶蓋容器內(nèi)或在操作時(shí)隨手?jǐn)y入。3）洗手操作時(shí)因整個(gè)前臂要伸入超凈工作臺內(nèi)，所以洗手時(shí)，一定要洗刷到肘部，然后用0.2%新潔爾滅擦洗或用75%酒精棉球擦試。4）火焰消毒在超凈工作臺無菌環(huán)境中操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈，此后一切操作如安裝吸管橡皮頭、打開或加蓋瓶塞、使用吸管等都要經(jīng)過火焰燒灼，或在近火焰處進(jìn)行。注意金屬器械不能在火焰上燒灼時(shí)間過長。燒過的用具都要待冷卻后再接觸細(xì)胞，否則會燒焦形成炭膜，再用時(shí)會把有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。5）操作進(jìn)行培養(yǎng)操作時(shí)動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動增加污染機(jī)會。不能用手觸及器皿的消毒部分。如已接觸，要用火焰燒灼消毒或更換。為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理布局。原則上是右手使用方便的用品放在右側(cè)，左手使用方便的用品放在左側(cè)；酒精燈置于中央。培養(yǎng)液等不要過早開瓶，打開的培養(yǎng)液和培養(yǎng)用瓶等應(yīng)保持斜位或平放，長時(shí)間開口直立，易增加落菌機(jī)會。吸取各種用液時(shí)均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或增加混淆不同細(xì)胞的機(jī)會。（二）染色體染色體是生物細(xì)胞中的一個(gè)重要的組成部分，每一物種都有一定數(shù)目及一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的染色體。染色體能通過細(xì)胞分裂而復(fù)制。并且在世代相傳的過程中具有穩(wěn)定地保持形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的特征。染色體是遺傳物質(zhì)的載體。人類99%的遺傳物質(zhì)位于染色體上。染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致染色體病。（三）操作1、接種的血樣越新鮮越好，最好是在采血后24h內(nèi)培養(yǎng)，如不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4℃冰箱存放，避免保存時(shí)間過久，以免影響細(xì)胞的活力。培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，最好每天輕輕震蕩混勻一次。2、Giemsa為噻嗪類染料,其堿性成份天青B與DNA分子中的磷酸基結(jié)合,蛋白質(zhì)在一定的環(huán)境中,具有不同的嗜酸性和嗜鹼性傾向,出現(xiàn)著色差異易于觀察。因此染液PH值對著色效果有影響。當(dāng)呈淡灰色帶紋不顯時(shí),應(yīng)調(diào)節(jié)染液pH值7.0~7.2,復(fù)染10min,可獲得鮮亮的顯色效果。3、在采血接種培養(yǎng)是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和分裂。但肝素量也不應(yīng)太少，以免發(fā)生凝血或培養(yǎng)物中出現(xiàn)纖維蛋白形成的膜狀結(jié)構(gòu)。這種膜狀物一般在培養(yǎng)24小時(shí)左右出現(xiàn)，此時(shí)可在無菌條件下將它除去以免影響培養(yǎng)效果。4、在普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，必須將培養(yǎng)瓶口蓋緊，以免培養(yǎng)液的PH發(fā)生較大的變化。如果培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液酸化比較嚴(yán)重（培養(yǎng)液呈黃色時(shí)）將不利于細(xì)胞生長，此時(shí)可加入適量無菌的0.14%碳酸氫鈉溶液調(diào)整或再加入2～3ml培養(yǎng)液來校正。培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)控制在37℃℃，溫度過高或過低都會影響細(xì)胞的生長。5、染色體標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因。如果淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標(biāo)本質(zhì)量不佳時(shí)，其原因可能為：⑴秋水仙素處理不當(dāng)：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時(shí)間有一定的關(guān)系，如果處理時(shí)間太短，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少，相反，如果處理時(shí)間太長，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。⑵低滲處理不當(dāng)：低滲處理細(xì)胞時(shí)間過長，細(xì)胞膜往往過早破裂，以致分裂細(xì)胞或染色體丟失；如果處理時(shí)間不足時(shí)，細(xì)胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)分析。⑶離心速度不合適：如果從培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞后進(jìn)行離心時(shí)的速度太低，細(xì)胞可能被丟失；如果細(xì)胞被低滲后離心速度過高，往往使分裂細(xì)胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標(biāo)本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。⑷標(biāo)本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時(shí)染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細(xì)胞漿的藍(lán)色背景。⑸載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在載玻片上的細(xì)胞懸液不能均勻分散，且細(xì)胞隨液體流動而丟失。⑹載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從冰水中拿出時(shí)，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞難以貼附在載玻片上。6、下列因素對染色體G顯帶有一定的影響。（1）胰蛋白酶溶液的濃度，是決定染色體消化時(shí)間的關(guān)鍵因素之一。濃度高時(shí)，消化時(shí)間短，但極易消化過，故一般消化時(shí)間不宜少于10秒鐘。（2）胰蛋白酶溶液的溫度：溫度較高時(shí)，酶解反應(yīng)速度較快。在有空調(diào)的實(shí)驗(yàn)室中，最合適的溫度是室溫。在進(jìn)行顯帶之前，胰蛋白酶溶液應(yīng)當(dāng)在室溫至少穩(wěn)定30分鐘。對無空調(diào)控溫的實(shí)驗(yàn)室，也有把胰蛋白酶溶液溫度穩(wěn)定在4℃的，有的甚至置冰箱中進(jìn)行處理。在溫度較低的情況下，應(yīng)當(dāng)延長處理時(shí)間。如能把所有條件穩(wěn)定下來，則可得到一致的效果。（3）胰蛋白酶溶液中的鹽類成分：溶液中的二價(jià)陽離子會使反應(yīng)減慢，但不能阻止反應(yīng)。（4）制作標(biāo)本的方法：火焰干燥法制得的標(biāo)本對胰蛋白酶處理的抵抗性較氣干法標(biāo)本要強(qiáng)些。（5）標(biāo)本的片齡：標(biāo)本保存的時(shí)間越長，染色體對胰蛋白酶處理的抵抗性越大。片齡超過20天以上的標(biāo)本顯帶時(shí)，染色體往往呈斑點(diǎn)狀，而不是顯示帶紋。（6）染色：隨著染色時(shí)間的延長，在染液表面會形成一層氧化膜（發(fā)亮）。染色完畢，應(yīng)把標(biāo)本浸入水中洗去染液