上海交大網(wǎng)絡(luò)課程檢驗(yàn)微生物講義12(1)講課教案

學(xué)習(xí)好資料第十真菌一

教大要、掌真菌的定義、主要生物學(xué)性狀及主要病原性真菌的致病性、了淺部感染性真菌的種類和基本性狀、掌深部感染真菌和條件致病性真菌的生物學(xué)性狀和檢驗(yàn)技術(shù)二

教內(nèi)精(一)真菌概述真菌為真核細(xì)胞型微生物，不含葉綠素，無(wú)根、莖、葉的分化。具有細(xì)胞核和較為完善的細(xì)胞器。細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)β葡聚糖。真菌種類繁多，約萬(wàn)種。僅300余對(duì)人類致病。近年來(lái)真菌感染有所增加，與AIDS行、腫瘤和慢性消耗性疾病等導(dǎo)致人群免疫力下降、抗生素濫用引起菌群失調(diào)等有關(guān)。單細(xì)胞真菌又稱酵母菌呈圓形或卵圓形，以出芽方式繁殖。有酵母菌和類酵母菌，在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落與細(xì)菌菌落相似。臨床常見(jiàn)的有隱球菌和假絲酵母菌。多細(xì)胞真菌由菌絲和孢子交織組成為絲狀菌或霉菌子在適宜條件下發(fā)芽伸長(zhǎng)成芽管，逐進(jìn)延長(zhǎng)呈絲狀，稱為菌絲。菌絲分枝交織成團(tuán)形成菌絲體。有的菌絲向上生長(zhǎng)，稱為氣生菌絲有的伸入培養(yǎng)基中為營(yíng)養(yǎng)菌絲產(chǎn)生孢子的稱為生殖菌絲的菌絲內(nèi)可見(jiàn)隔膜，將菌絲分隔成多個(gè)細(xì)胞，隔膜上有小孔，容許細(xì)胞質(zhì)流通，稱為有隔菌絲。大多致病性真菌的菌絲為有隔菌絲些絲內(nèi)無(wú)隔膜為無(wú)隔菌絲隔絲內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞核。菌絲有多種形態(tài)可以根據(jù)不同態(tài)鑒別真菌子是真菌的繁殖結(jié)構(gòu)可分為有性孢子和無(wú)性孢子多病原性真菌形成無(wú)性孢子類型生孢子狀孢子和孢子囊孢子。有些真菌在不同的環(huán)境條件下種形態(tài)可以互相轉(zhuǎn)換如組織胞漿菌、孢子絲菌、球孢子菌等在含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基上37培養(yǎng)時(shí)為酵母菌型，在25普通培養(yǎng)基上呈絲狀菌。真菌對(duì)干燥、紫外線有較強(qiáng)抵抗力，紫外線須照射鐘能殺死。不耐熱℃小時(shí)即被殺死。對(duì)常用消毒劑有較強(qiáng)抵抗力，對(duì)石炭酸、升、碘酒較敏感。常用抗細(xì)菌的抗生素不敏感，兩性霉素B、制霉菌素、克霉唑、酮康唑、伊曲康唑、灰黃霉素等具有抗真菌作用。近年來(lái)根據(jù)卡氏肺囊蟲(chóng)超微結(jié)其壁結(jié)構(gòu)與真菌細(xì)胞相似大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為應(yīng)將其歸為真菌，并命名為卡氏肺孢菌。更多精品文檔學(xué)習(xí)好資料根據(jù)致病性真菌的感染部位，通常分為深部或全身性感染真菌、條件致病性（飼機(jī)性）真菌、淺部感染性真菌。（二）常真菌實(shí)驗(yàn)技術(shù)真菌實(shí)的注意事項(xiàng)真菌的檢驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。特別是粗球孢子菌、組織胞漿菌、皮炎芽生菌、新型隱球菌等的分離培養(yǎng)和鑒定操作必須在生物安全柜中進(jìn)行。每天工作前后應(yīng)對(duì)工作區(qū)域進(jìn)行消毒。不可試著聞平板上培養(yǎng)物產(chǎn)生的氣味。不可對(duì)組織胞漿菌、球孢子菌進(jìn)行玻片培養(yǎng)，因?yàn)槠滏咦涌稍诳諝庵猩⒉ァ?biāo)本的色檢查有些真菌如深部真菌需要染色后更清楚的觀察，常用的染色方法有：革蘭染色法所真菌均為革蘭陽(yáng)性，適用于白假絲酵母菌、孢子絲菌和新近感染的組織胞漿菌。美藍(lán)-伊紅或天青-紅染色法適于組織胞漿菌。乳酸酚棉蘭染色法真菌染成藍(lán)，適用于所有真菌。糖原染色用過(guò)碘酸作氧化劑菌胞壁多糖物質(zhì)被氧化而釋放出醛基Schiff試劑中的亞硫酸復(fù)紅及焦亞硫酸鈉作用而顯示紅色用于標(biāo)本直接涂片的染色織片的染色，也可對(duì)已進(jìn)行蘇木紫伊紅染色的組織切片重染菌呈紅色背淡綠色，細(xì)胞核藍(lán)色。糖原、透明質(zhì)酸、粘蛋白、透明蛋白、血纖維蛋白及膠質(zhì)顆粒等都呈紅色。嗜銀染色法GMS法基本原理與染法相同，本法用鉻酸代替過(guò)碘酸。真菌被染呈黑色或黑褐色，菌絲內(nèi)部為灰紫色，糖原、粘蛋白為淡紅色。粘蛋白-卡（MCS用于新型隱球菌的鑒別球菌細(xì)胞壁和莢膜染成紅色，細(xì)胞核黑色，背景黃色。孢子絲菌和鼻孢子菌的胞壁也被染成紅色。熒光染色用0.1%吖啶橙對(duì)標(biāo)本涂片和組織切片進(jìn)行染色光微鏡下觀察，白假絲酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌為黃綠色，新型隱球菌、鼻孢子菌為紅色，組織胞漿菌紅黃色，曲霉菌為綠色。真菌的離培養(yǎng)（1培養(yǎng)基真菌的營(yíng)養(yǎng)要求不高，最適。一般細(xì)菌培養(yǎng)基上即可生長(zhǎng)。在不同的培養(yǎng)基上真菌菌落形態(tài)變化很大，一般以沙保弱（sabouraud培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，描寫(xiě)菌落的形態(tài)常的培養(yǎng)基有選擇性、選擇性和鑒別培養(yǎng)基選性培養(yǎng)基有沙保更多精品文檔學(xué)習(xí)好資料弱培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基。選擇性培養(yǎng)基是在無(wú)選擇性培養(yǎng)基中根據(jù)細(xì)菌污染情況加入氯霉素.05mg/ml慶大霉素50~100mg/ml或霉素20U/ml和鏈霉素40U/ml或霉素和慶大霉素100mg/ml或氯霉素16mg/ml和大霉素4mg/ml等抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。為抑制腐生性真菌的生長(zhǎng)，加入0.5mg/ml放線菌酮，但對(duì)新型隱球菌、近滑念珠菌、熱帶念珠菌及曲菌有抑制作用。鑒別培養(yǎng)基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂、酵母浸膏瓊脂、米粉瓊脂、蔡氏瓊脂等。（2培養(yǎng)方法試培養(yǎng)法、大培養(yǎng)法和小培養(yǎng)法。4.培結(jié)果的觀察真生長(zhǎng)后要觀察菌落的以下方面：生長(zhǎng)速度、菌落大小、表面形態(tài)、菌落顏色、菌落邊緣、菌落底部。菌落性質(zhì)：可分為酵母型、酵母樣型和絲狀菌落。酵母型菌落外觀光滑、質(zhì)地柔軟、呈乳酪樣，與細(xì)菌菌落相似如隱球菌母樣型菌落與酵母型菌落相似但成假菌絲伸培養(yǎng)基中假絲酵母菌狀落是多細(xì)胞真菌的菌落形態(tài)棉狀毛或粉末狀，根據(jù)菌種的不同，菌落形態(tài)多變，是鑒定的重要依據(jù)。其他鑒診斷技術(shù)（1動(dòng)物接種動(dòng)接種可以有效的分離病原性真菌，確定真菌的致病性。常用小白鼠接種新型隱球菌、孢子絲菌、皮炎芽生菌、組織胞漿菌較敏感。巴西芽生菌、球孢子菌應(yīng)接種豚鼠睪丸內(nèi)。白假絲酵母菌、皮膚絲狀菌對(duì)家兔比較敏感。病理組織檢查病理組織檢查是斷深部真菌病的重要方法。用真菌染色后在組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)孢子或菌絲則具有診斷意義。免疫學(xué)檢查真感染的診斷，主要取決于病原學(xué)診斷。但在某些情況不能獲得病原學(xué)證據(jù)急組織胞漿菌霉支氣管炎等要靠免疫學(xué)手段進(jìn)行輔助診斷。與其它微生物相比真產(chǎn)生的體慢而滴度低態(tài)反應(yīng)嚴(yán)重免血方法有皮膚試驗(yàn)和用膠乳凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗體試驗(yàn)放免疫試驗(yàn)測(cè)定血清中相應(yīng)抗體的水平核酸檢：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，如探雜交、PCR技檢測(cè)組織標(biāo)本中的真菌DNA行診斷，正在不斷研究和試驗(yàn)中。（二）淺部染性真菌淺部感染性真菌包括皮膚表面感染性真菌、皮膚癬真菌和皮下組織感染性真菌。我國(guó)主要的皮膚表面感染性真菌是糠秕馬拉癬菌要居在人體皮膚和毛干的最表層一種嗜脂性酵母樣菌，為條件致病菌，可在健康人皮膚上分離到。更多精品文檔學(xué)習(xí)好資料皮膚癬菌是寄生于皮膚角蛋白中引起皮膚淺部感染的真菌稱皮膚絲狀菌侵犯角化的皮膚、毛發(fā)和指（趾）甲等部位。共有種，其約有余種對(duì)人致病。分為毛癬菌屬表癬菌屬和小孢子癬菌我以紅色毛癬菌為最多，其次為紫色毛癬菌、須毛癬菌、絮狀表皮癬菌。引起皮下組織感染的真菌主要有著色真菌和孢子絲菌傷感染后下組織感染性真菌在局部真皮深層、皮下組織生長(zhǎng)繁殖，并緩慢向周?chē)M織擴(kuò)散，還可經(jīng)淋巴向全身擴(kuò)散。在我國(guó)以卡氏枝孢霉為最多，其次為裴氏著色真菌。孢子絲菌廣泛分布于土壤、塵埃上，屬于腐生性真菌。常因外傷感染本菌引起孢子絲菌病。主要的感染菌是申克孢子絲菌。（三）深部感染真菌1.隱菌僅新生隱球菌及其變種有致病性，新生隱球菌廣泛分布于自然界，也可存在于人體表、口腔和腸道中在糞中大量存過(guò)吸入鴿糞污染的空氣而感染特別是在一些免疫低下者。新生隱球菌在組織中呈圓形或卵圓形，直徑一般μ，菌體外有寬厚莢膜，莢膜比菌體大1倍，折光性強(qiáng)，一般染色不易著色。常用墨汁負(fù)染色法，在黑色背景下可見(jiàn)透亮菌體，內(nèi)有一個(gè)較大的反光顆粒和數(shù)個(gè)小的反光顆粒。常見(jiàn)出芽現(xiàn)象，菌體外有透明的寬厚莢膜。經(jīng)培養(yǎng)后菌體可變小。非致病性隱球菌無(wú)莢膜。新生隱球菌在沙保弱培養(yǎng)基和血平板上，℃37℃均能生長(zhǎng)，形成白色至奶油色粘稠酵母型菌落，后轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色最后成棕褐色。有的菌落可以液化。能分解尿素。根據(jù)新生隱球菌的莢膜多糖分為A、B、C、D等血清型，我國(guó)臨床標(biāo)本中主要是A。此外我國(guó)還發(fā)現(xiàn)了新生隱球菌上海變種。本菌屬外源性感染經(jīng)呼吸道侵人體由肺經(jīng)血行播散時(shí)可侵犯所有臟器組織要侵犯肺、腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和關(guān)節(jié)。新生隱球菌病好發(fā)于細(xì)胞免疫功能低下者，如AIDS惡性腫瘤、糖尿病、器官移植及大劑量使用糖皮質(zhì)激素者。因此，臨床上隱球菌性腦膜炎常在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病、淋巴瘤等病人中發(fā)生。在國(guó)外已成AIDS的常見(jiàn)的并發(fā)癥，是死的首要原因。用病人腦脊液作墨汁負(fù)染色檢查是診斷隱球菌腦膜炎最簡(jiǎn)便速的方法見(jiàn)透亮菌體內(nèi)有一個(gè)較大的反光顆粒數(shù)個(gè)小的反光顆粒及出芽現(xiàn)象體外有透明的寬厚莢膜。常規(guī)細(xì)胞染色可發(fā)現(xiàn)隱球菌，如PAS染色后新生球菌呈紅色。用氫氧化鉀涂片可見(jiàn)發(fā)芽的菌體，不能看見(jiàn)莢膜，須與淋巴細(xì)胞、膿細(xì)胞等鑒別。更多精品文檔學(xué)習(xí)好資料用乳膠凝集試驗(yàn)、和單克抗體法等免疫學(xué)方法檢測(cè)隱球菌莢膜多糖特異性抗原，已成為臨床的常規(guī)診斷方法，其中以乳膠凝集試驗(yàn)最為常用。將標(biāo)本接種在沙保弱培養(yǎng)基，病原性隱球菌在℃和℃孵育均可生長(zhǎng)，而病原性隱球菌在37℃時(shí)不生長(zhǎng)。培后察菌落形態(tài)特點(diǎn)，并取菌落作墨汁負(fù)染色鏡檢。新生隱球菌酚氧化酶陽(yáng)性，脲酶試驗(yàn)陽(yáng)性，能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能發(fā)酵糖類、不同化硝酸鹽。非致病性隱球菌則不能同化肌醇。新生隱球菌對(duì)小鼠接種敏感，注入腹腔、腦或靜脈內(nèi)，小鼠周內(nèi)死亡。二相性菌組織胞漿菌球孢子菌芽菌及副球孢子菌均屬二相性真菌在體內(nèi)或3℃培養(yǎng)時(shí)呈酵母型，在室溫下或人工培養(yǎng)時(shí)變?yōu)榻z狀型。（四）條件致病性真菌條件致病性真菌致病性不強(qiáng)大發(fā)生在機(jī)體免疫力低下或菌群失調(diào)時(shí)腫慢性消耗性疾病、器官移植后HIV患者、長(zhǎng)期使用廣譜抗生素、正在受放療或化療的患者容易發(fā)生感染。通常為內(nèi)源性感染。常見(jiàn)的菌株有假絲酵母菌菌毛霉菌和卡氏肺孢子菌。1.假酵母菌俗稱念珠菌屬有81個(gè)中11種對(duì)人致病假酵母菌為最常見(jiàn)的致病菌，其次為熱帶假絲酵母菌，克柔假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌也較常見(jiàn)。白假絲酵母菌呈圓形或卵圓形。直徑μ。革蘭陽(yáng)性。出芽方式繁殖，在組織內(nèi)可見(jiàn)芽生孢子、假菌絲，在玉米粉培養(yǎng)基中可產(chǎn)生假菌絲和厚膜孢子。取標(biāo)本直接涂片，革蘭染色后鏡檢，見(jiàn)到革蘭陽(yáng)性（著色不均勻）、圓形或卵圓形菌體或孢子及假菌絲，可確認(rèn)為假絲酵母菌感染。取病人血清ELISA、疫印跡法等檢測(cè)白假絲酵母菌抗原。將標(biāo)本接種在沙保弱培養(yǎng)基上，25℃7℃培養(yǎng)l4d后，培養(yǎng)基表面可現(xiàn)奶油色類酵母型菌落。鏡檢可見(jiàn)假菌絲和芽生孢子。此外，還可作以下試驗(yàn)加以鑒定：l芽管形成試驗(yàn)白絲酵母菌可形成芽管并非所有的白假絲酵母菌都形成芽管，其它假絲酵母菌一般不形成芽管。厚膜孢子形成試驗(yàn)：將假絲酵母菌接種于玉米粉培養(yǎng)基，僅白假絲酵母菌在菌絲頂端、側(cè)緣或中間形成厚膜孢子。糖同化或發(fā)酵試驗(yàn)：不同的假絲酵母菌對(duì)糖類的發(fā)酵和同化能力是不同的。常用葡更多精品文檔學(xué)習(xí)好資料萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖進(jìn)行同化試驗(yàn)。5試絲母菌懸液注射于家兔耳靜脈或注射于白鼠尾靜脈，觀察5，意動(dòng)物是否死亡。剖檢時(shí)如發(fā)現(xiàn)臟器有多種小膿腫，即為白假絲酵母菌感染，其他假絲酵母菌對(duì)動(dòng)物無(wú)致病性。2.曲曲霉廣泛分布于自然界。曲霉有900種，對(duì)人致病的曲霉至少有0種，其中最常見(jiàn)的約有8種。曲霉是條件致病菌人免疫功能降低時(shí)致病長(zhǎng)期使用廣譜抗生素疫制劑、腎上腺皮質(zhì)激素，放療、化療，各種惡性腫瘤、糖尿病可誘發(fā)曲霉病。曲霉可侵犯機(jī)體許多部位尤是呼吸系統(tǒng)身性曲霉病有增高的趨勢(shì)曲霉除直接感染和產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)引起曲霉病外可生毒素起食物中毒，黃曲霉毒素色霉素有致癌作用黃霉毒素可能與人類原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān)。取標(biāo)本涂于載玻片上在鏡下可見(jiàn)分枝的菌絲粗的分生孢子頭頂端膨大形成頂囊，頂囊上有小梗，小梗上有許多小分生孢子的特征性結(jié)構(gòu)。分離培養(yǎng)與鑒定

標(biāo)本接種沙保弱瓊脂，室溫培養(yǎng)后形成黃綠色毛狀菌落。涂片鏡檢可見(jiàn)特征性的分生孢子頭和足細(xì)胞。根據(jù)不同的形態(tài)和菌落特征確定菌種。免疫學(xué)檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)性LISA測(cè)病人血清中曲霉抗原常用免疫擴(kuò)散對(duì)流免疫電泳、ELISA、物素一親和素酶聯(lián)免吸附測(cè)定、放射免疫測(cè)定（RIA）間接免疫熒光法等檢測(cè)病人血清中抗曲霉抗體。菌絲和培養(yǎng)濾液可ELISA抗原。3.毛目真菌毛霉目真菌有7個(gè)科，主要是毛科。毛霉科中的根霉屬、梨頭霉屬、毛霉屬、根毛霉屬常引起毛霉病，其中根霉屬中的少根根霉和米根霉兩種最多見(jiàn)。免疫功能低下者如AIDS、性消耗性疾病如糖尿病、白血病等腫瘤患者長(zhǎng)期應(yīng)用化療、器官移植和自身免疫性疾病患者長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇激素最易感染起初多發(fā)于鼻粘膜或鼻竇，繼而擴(kuò)展則眼眶軟組織、面腭及腦，還可發(fā)生于肺部、胃腸道、皮膚等處，也可全身性播散，臨床上常見(jiàn)的是眼眶及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毛霉病，死亡率高。更多精品文檔學(xué)習(xí)好資料4.卡肺孢菌卡氏肺孢菌，曾稱為卡氏肺孢子蟲(chóng)。可引起間質(zhì)漿細(xì)胞性肺炎，近年以來(lái)卡氏肺孢菌肺炎已成為IDS患者最常見(jiàn)的機(jī)性感染，并是其致死的的主要原因?？ㄊ戏捂呔钍酚邪液妥甜B(yǎng)體兩種形態(tài)。包囊為感染型，分為成熟包囊和未成熟包囊。前者包囊壁較厚，直6~8，呈球形、圓形、橢圓形、瓢形，包囊內(nèi)囊內(nèi)小體，大l1.5μm，呈球形、半月形或阿米巴形，排列呈玫瑰花狀或不規(guī)則形，單個(gè)核；后者大多為橢圓形3~5，囊內(nèi)l~8個(gè)滋養(yǎng)體為繁型，壁較薄，單個(gè)核不規(guī)則，直徑25μm姬氏染色后胞質(zhì)呈藍(lán)色，核呈紫紅色。呈二分裂法繁殖。長(zhǎng)期使用免疫抑制劑器移植腫艾滋病等引起宿主免疫力下降潛的卡氏肺孢菌在患者肺內(nèi)大量繁殖擴(kuò)散肺泡上皮細(xì)胞受損致間質(zhì)性漿細(xì)胞肺炎稱卡氏肺孢菌性肺炎?？ㄊ戏捂呔IDS常見(jiàn)、最嚴(yán)重的機(jī)會(huì)感染性疾病。將痰液或氣管抽吸物涂片后用姬姆薩染色，在顯微鏡下可見(jiàn)包囊內(nèi)8個(gè)囊內(nèi)小體，囊內(nèi)小體的胞質(zhì)呈淺藍(lán)色核個(gè)紫紅色I(xiàn)FAELISACFT測(cè)人群血清中卡氏肺孢菌抗體，可用于流行病學(xué)調(diào)查。（五）真菌體外藥物敏感試驗(yàn)常量稀法肉湯常量稀釋法是廣泛適用于抗真菌藥敏試驗(yàn)的方法于所有抗真菌藥物對(duì)所有真菌的測(cè)試。培養(yǎng)基無(wú)酸鹽的RPMI1640加L-谷氨酰胺和指示劑℃用MOPS調(diào)培養(yǎng)基的至。適合5-FC和砒咯類抗假絲酵母菌和一些絲狀菌的藥敏試。藥物原液抗菌藥物的標(biāo)準(zhǔn)品從藥品的鑒定機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)廠商處獲得脈射和口服制劑不能用于藥敏試驗(yàn)?？咕幬锏馁A存液必須高于試驗(yàn)濃度的0倍（氟康唑和5-FC為1280μg/ml、康唑和其它任何水溶性的藥物應(yīng)用蒸餾水配成水溶液。對(duì)于多烯類或其它水溶性的藥物，稱取足夠量的標(biāo)準(zhǔn)品用二甲亞砜、聚乙二醇等制成1600g/ml的溶液。二性霉素B應(yīng)光。無(wú)菌的貯存液應(yīng)分裝成小容量-℃或以下貯存6個(gè)在20℃或以上將會(huì)失活。根據(jù)需要在使用當(dāng)天取出。取出后未經(jīng)使用的溶液應(yīng)全被廢棄。更多精品文檔33333333學(xué)習(xí)好資料接種菌液的制備測(cè)試菌株接種在沙保弱培養(yǎng)基35培養(yǎng)至少傳代二次培24小時(shí)后的假絲酵母菌和培養(yǎng)48小時(shí)上的新型隱球菌挑選直徑1mm以上的菌落5個(gè)混懸在無(wú)菌的5ml0.85%Nacl中530nm下測(cè)量濁度無(wú)生理鹽水調(diào)節(jié)濁度至0.5麥標(biāo)準(zhǔn)。懸液的菌數(shù)為1×至5