基因工程工具酶課件

第三章基因工程工具酶第三章基因工程工具酶1限制性核酸內(nèi)切酶連接酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶RNA聚合酶溶菌酶、蛋白酶K等一、基因工程工具酶的種類限制性核酸內(nèi)切酶一、基因工程工具酶的種類2二、基因工程工具酶的來源多數(shù)來自微生物或噬菌體感染的微生物動物病毒二、基因工程工具酶的來源多數(shù)來自微生物或噬菌體感染的微生物3限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）:是一類能識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈的一個二磷脂鍵斷裂的內(nèi)脫氧核糖核苷酸酶．限制性核酸內(nèi)切酶41.1限制性核酸內(nèi)切酶的命名

微生物的屬名的第一個大寫字母+種名的前兩個小寫字母+菌株（型）代號字母的縮寫*EcoRI----Escherichiacoli中R型菌株提取的第一種內(nèi)切酶（該基因位于Escherichiacoli中抗藥性R質(zhì)粒上）*HindIII-----Haemophilusinfluenzae

中d菌株中提取的第三種限制性內(nèi)切酶1.1限制性核酸內(nèi)切酶的命名微生物的屬名的第一個大寫字51.2限制性內(nèi)切酶的種類

目前在細菌中已發(fā)現(xiàn)600多種限制性內(nèi)切酶，根據(jù)其性質(zhì)不同可分為I、II和III等三大類．*I類和III類限制性內(nèi)切酶同時具有核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性，屬于限制-修飾酶．*II類限制性核酸內(nèi)切酶與所對應(yīng)的甲基化酶是分離的，屬于不同的酶分子，而且這類酶的識別切割位點比較專一，廣泛應(yīng)用于DNA的重組，被稱為分子手術(shù)刀．

1.2限制性內(nèi)切酶的種類目前在細菌中已發(fā)現(xiàn)600多61.3II類限制性內(nèi)切酶的作用機制1.3II類限制性內(nèi)切酶的作用機制71.4限制性內(nèi)切酶的識別序列二重旋轉(zhuǎn)對稱識別序列（二重互補對稱）1.4限制性內(nèi)切酶的識別序列二重旋轉(zhuǎn)對稱識別序列（二8找出限制酶的識別序列找出限制酶的識別序列9識別序列越短，則在DNA序列中出現(xiàn)的幾率就越大，識別序列越長，則出現(xiàn)的幾率就越?。虼?，在基因克隆中要根據(jù)不同的要求選擇合適的限制酶．1.5限制酶識別序列出現(xiàn)的幾率識別序列越短，則在DNA序列中出現(xiàn)的幾率就越大，識別序列越長10識別序列與出現(xiàn)幾率的關(guān)系識別序列與出現(xiàn)幾率的關(guān)系111.6多識別序列限制性內(nèi)切酶能夠識別兩種或兩種以上核苷酸序列內(nèi)切酶．1.6多識別序列限制性內(nèi)切酶能夠識別兩種或兩種以上核苷酸序12同裂酶：來源不同，但具有相同識別序列的限制酶．同位酶：具有相同的識別序列，但酶切位點不同的限制性內(nèi)切酶．同尾酶：具有不同識別序列的限制性內(nèi)切酶，切割DNA分子后產(chǎn)生相同的粘性末端.稀切限制性內(nèi)切酶:由于限制性內(nèi)切酶識別序列的特異性，識別位點在DNA分子上出現(xiàn)的幾率特別低．同裂酶：來源不同，但具有相同識別序列的限制酶．13第三章基因工程工具酶課件141.7酶切末端5’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的5’端切割DNA分子的每一條鏈，使得雙鏈DNA分子交錯斷開，產(chǎn)生帶突出的5’粘性末端的DNA片段．1.7酶切末端5’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的15

3’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的3’端切割DNA分子的每一條鏈，使得雙鏈DNA分子交錯斷開，產(chǎn)生帶突出的3’粘性末端的DNA片段．3’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的3’端切16平末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的上切割DNA分子的每一條鏈，使得雙鏈DNA分子斷開，產(chǎn)生平末端的DNA片段．平末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的上切割171.8限制性內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)1）底物DNA分子：雙鏈DNA分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)效率密切相關(guān)．側(cè)面序列：當(dāng)識別序列兩側(cè)的堿基序列達到一定的長度時，限制性內(nèi)切酶才能正常切割DNA分子的現(xiàn)象．位點偏愛：DNA分子中的某些識別序列能夠迅速被限制性內(nèi)切酶切割，而另一些位點則相對不易被切割的現(xiàn)象．1.8限制性內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)1）底物DNA分子：雙鏈DNA18

DNA甲基化：DNA分子中的某些序列能夠特異性地被甲基化酶所修飾的現(xiàn)象．DNA的甲基化不利于限制性內(nèi)切酶的酶切作用．DNA的純度：DNA樣品中混雜的蛋白質(zhì)，有機溶劑等會影響限制性內(nèi)切酶的切割效率．

DNA分子的濃度：DNA分子的濃度不能過高，否則會難于切動DNA分子．DNA甲基化：DNA分子中的某些序列能夠特異性地被甲基化19

2）限制性內(nèi)切酶的用量活性單位：酶在最適反應(yīng)條件下，60min內(nèi)完全切割1μgDNA的酶活性．容積活性：每1μl酶液中所含的酶活性單位．限制性內(nèi)切酶的用量：不超過酶切反應(yīng)總體積的1/10．內(nèi)切酶儲存緩沖液中含有50%的甘油，酶切反應(yīng)系統(tǒng)中甘油的濃度高于5%時會影響限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)．2）限制性內(nèi)切酶的用量活性單位：酶在最適反應(yīng)條件下，60204)酶切反應(yīng)的緩沖液多數(shù)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)最適溫度為37℃，但少數(shù)限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)溫度高于或低于37℃．3)酶切反應(yīng)的溫度4)酶切反應(yīng)的緩沖液多數(shù)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)最適溫度為37211.9限制性內(nèi)切酶的Star活性某些限制性內(nèi)切酶在特定的條件下，切割位點的識別序列發(fā)生變化．形成Star活性的因素包括：高濃度甘油、低離子強度等．1.9限制性內(nèi)切酶的Star活性某些限制性內(nèi)切酶在特定的條221.10DNA分子的片段化單酶切法：以一種限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，酶切后獲得N（識別位點）個或N+1個DNA片段．雙酶切法：以兩種限制性內(nèi)切酶切割同一DNA分子．可同時酶切或先后酶切．部分酶切法：以限制性內(nèi)切酶對DNA分子進行不完全切割．1.10DNA分子的片段化單酶切法：以一種限制性內(nèi)切酶切231.11DNA分子限制性內(nèi)切酶酶切圖譜DNA分子上各種限制酶識別位點的排列順序．1)雙酶切法：用三種以上待定位的限制性內(nèi)切酶分別單酶切或雙酶切DNA分子，測定各酶切DNA片段的大小，確定各酶切位點的相對位置．1.11DNA分子限制性內(nèi)切酶酶切圖譜DNA分子上各種限制24酶切片段分析酶切片段分析252)末端標(biāo)記DNA的部分酶切法原理：先以P32標(biāo)記DNA分子的5’端，并以單切點的限制酶切割DNA分子，獲得兩個帶標(biāo)記的DNA片段，再以其它限制酶進行部分酶切，得到一系列DNA帶標(biāo)記的DNA片段，根據(jù)所得結(jié)果確定各種限制酶在DNA分子上的位置．2)末端標(biāo)記DNA的部分酶切法原理：先以P32標(biāo)記DNA分26第三章基因工程工具酶課件273)Bal31核酸酶逐步降解法原理：利用Bal31外切酶從DNA片段的兩端逐個切割核苷酸，使原切割片段在瓊脂糖凝膠電泳譜上發(fā)生有規(guī)律的變化，從而確定某種限制酶在DNA片段上各個切割位點．3)Bal31核酸酶逐步降解法原理：利用Bal31外28第三章基因工程工具酶課件292.DNA聚合酶DNA聚合酶：是一類催化DNA合成的酶類，酶的作用需要DNA或RNA作為模板，合成DNA鏈的序列與模板的序列互補。．2.DNA聚合酶DNA聚合酶：是一類催化DNA合成的酶類，302.1DNA聚合酶的種類1)幾種常見的DNA聚合酶2.1DNA聚合酶的種類1)幾種常見的DNA聚合酶312.2幾種DNA聚合酶的應(yīng)用1)E.coliDNA聚合酶I

A）以切口平移的方法標(biāo)記DNA：在Mg2+的存在下，用低限量的DNA酶I處理雙鏈DNA，產(chǎn)生的切口可作為大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）催化DNA合成的引物．合成過程中，dNTP前體不斷摻入到正在增長的DNA鏈上，同時利用全酶的5’3’外切核酸酶活性使切口沿5’3’方向平移．如果提供放射性dNTP前體，則反應(yīng)產(chǎn)物是被放射性標(biāo)記的DNA鏈．

2.2幾種DNA聚合酶的應(yīng)用1)E.coliDNA聚32切口平移法標(biāo)記DNA切口平移法標(biāo)記DNA33B）對DNA分子3’突出尾端進行標(biāo)記首先用3’5’外切核酸酶活性去除DNA的3’突出尾而產(chǎn)生3’凹端．然后在高濃度的放射性標(biāo)記的核苷酸前體的存在下，外切酶降解反應(yīng)與dNTP摻入3’端的反應(yīng)達到平衡．該反應(yīng)實際上是一個不斷地從凹端或平端DNA上除去并置換3’端核苷酸的過程．B）對DNA分子3’突出尾端進行標(biāo)記34利用DNA聚合酶I標(biāo)記DNA的3’端利用DNA聚合酶I標(biāo)記DNA的3’端352）E.coliDNA聚合酶I大片段（Klenow片段）

A）來源：從蛋白酶從全酶中切除具有5’-3’外切酶活性的片段，只剩下聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，目前作為商品提供的Klenow片段是通過枯草桿菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I或通過克隆技術(shù)獲得的單一的多肽鏈．2）E.coliDNA聚合酶I大片段（Klenow片段36

B）應(yīng)用*補平限制酶切割產(chǎn)生的3’凹端．*以[32P]dNTP補平DNA的3’凹端并進行標(biāo)記．*對帶3’突出端的DNA進行末端標(biāo)記．*在cDNA克隆中用于合成cDNA的第二鏈．*在體外誘變中用于從單鏈模板合成雙鏈DNA．B）應(yīng)用373）T4DNA聚合酶

A）補平或標(biāo)記限制酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端B）對3’突出端DNA分子進行末端標(biāo)記C）將雙鏈DNA的粘性末端轉(zhuǎn)化為平末端4）T7DNA聚合酶A）用于拷貝長段模板的引物延伸反應(yīng)B)通過補平或交換反應(yīng)進行末端標(biāo)記3）T4DNA聚合酶385）TaqDNA聚合酶從極度嗜熱的棲熱水生菌（Thermusaquaticus）中純化而得．這些酶具有依賴于聚合作用的5’-3’的外切酶活性，對核苷酸的插入反應(yīng)而言，該酶的具體作用溫度取決于靶序列．最佳溫度為75–80℃，溫度為60℃時活性只剩下1/2，溫度為37℃時，活性剩下1/10．但在許多情況下需要在低于最適反應(yīng)溫度的條件下起始聚合反應(yīng)．A）體外擴增特定序列的DNA分子B）DNA測序：雙脫氧核糖核苷酸法5）TaqDNA聚合酶396）反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）

A）種類目前有兩種反轉(zhuǎn)錄酶，一種是來源于Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶基因的表達產(chǎn)物；另一種是來源于禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶基因的表達產(chǎn)物．兩者間存在差異如表．禽源反轉(zhuǎn)錄酶鼠源反轉(zhuǎn)錄酶組成亞基21最適反應(yīng)溫度42oC〈42oC最適pH值8.37.66）反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）40B)應(yīng)用將mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA而后克隆到原核載體上．標(biāo)記帶5’突出端的DNA片段．用于雙脫氧鏈終止法測序.B)應(yīng)用413.依賴于DNA的RNA聚合酶SP6、T7、T3噬菌體可以合成依賴于DNA的RNA聚合酶，該酶能識別雙鏈DNA上特異的啟動子．1）合成單鏈RNA以作為雜交探針.2）表達克隆化基因.3.依賴于DNA的RNA聚合酶SP6、T7、T3噬菌體可以424.其它工具酶4.1DNA連接酶：催化兩個單鏈DNA片段之間形成磷酸二酯鍵．1）種類

E.coliDNA連接酶：需NAD+，連接互補粘性末端T4DNA連接酶：需ATP，連接互補粘性末端2）連接方式互補粘性末端連接：平末端連接：4.其它工具酶4.1DNA連接酶：催化兩個單鏈DNA片段434.2堿性磷酸酶催化去除DNA，RNA，rNTP，dNTP的5’磷酸基團

4.3BAL31核酸酶3’端核酸外切酶，可用于去除雙鏈DNA的末端核苷酸及繪制DNA的限制酶圖譜4.4S1核酸酶降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡核苷酸．用于分析DNA：RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，去除DNA片段中突出的單鏈尾以產(chǎn)生平端，打開雙鏈cDNA合成產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)．4.2堿性磷酸酶444.5核糖核酸酶A（RNaseA）

特異地攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端．用于去除DNA：RNA雜交體中的RNA，確定DNA或RNA中單堿基突變的位置．4.6脫氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）

優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA，產(chǎn)物為5’端帶磷酸基團的單核苷酸或寡核苷酸．1）用切口平移法標(biāo)記時，在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機缺口．2）建立隨機克隆，用于M13噬菌體測序．3）分析DNA:蛋白復(fù)合物．4.5核糖核酸酶A（RNaseA）454.7末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶（Terminaltransferase,TdT）是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3'羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物。4.7末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶（Terminaltransfe464.8細胞裂解酶溶菌酶蛋白酶K、胰酶纖維素酶4.8細胞裂解酶47思考題1.常用的工具酶有哪些？各有什么用途？2.什么是限制性核酸內(nèi)切酶？3.什么是同裂酶、同位酶、同尾酶？舉例說明。4.找出如下序列中可能的限制性內(nèi)切酶識別位點：GGATATCCGCGACGTTAATATAGCTGCTAGCTACGATCG5.簡述繪制DNA片段的限制性內(nèi)切酶圖譜的常用方法．思考題1.常用的工具酶有哪些？各有什么用途？48Talen模塊拼接Talen模塊拼接49第三章基因工程工具酶第三章基因工程工具酶50限制性核酸內(nèi)切酶連接酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶RNA聚合酶溶菌酶、蛋白酶K等一、基因工程工具酶的種類限制性核酸內(nèi)切酶一、基因工程工具酶的種類51二、基因工程工具酶的來源多數(shù)來自微生物或噬菌體感染的微生物動物病毒二、基因工程工具酶的來源多數(shù)來自微生物或噬菌體感染的微生物52限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）:是一類能識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈的一個二磷脂鍵斷裂的內(nèi)脫氧核糖核苷酸酶．限制性核酸內(nèi)切酶531.1限制性核酸內(nèi)切酶的命名

微生物的屬名的第一個大寫字母+種名的前兩個小寫字母+菌株（型）代號字母的縮寫*EcoRI----Escherichiacoli中R型菌株提取的第一種內(nèi)切酶（該基因位于Escherichiacoli中抗藥性R質(zhì)粒上）*HindIII-----Haemophilusinfluenzae

中d菌株中提取的第三種限制性內(nèi)切酶1.1限制性核酸內(nèi)切酶的命名微生物的屬名的第一個大寫字541.2限制性內(nèi)切酶的種類

目前在細菌中已發(fā)現(xiàn)600多種限制性內(nèi)切酶，根據(jù)其性質(zhì)不同可分為I、II和III等三大類．*I類和III類限制性內(nèi)切酶同時具有核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性，屬于限制-修飾酶．*II類限制性核酸內(nèi)切酶與所對應(yīng)的甲基化酶是分離的，屬于不同的酶分子，而且這類酶的識別切割位點比較專一，廣泛應(yīng)用于DNA的重組，被稱為分子手術(shù)刀．

1.2限制性內(nèi)切酶的種類目前在細菌中已發(fā)現(xiàn)600多551.3II類限制性內(nèi)切酶的作用機制1.3II類限制性內(nèi)切酶的作用機制561.4限制性內(nèi)切酶的識別序列二重旋轉(zhuǎn)對稱識別序列（二重互補對稱）1.4限制性內(nèi)切酶的識別序列二重旋轉(zhuǎn)對稱識別序列（二57找出限制酶的識別序列找出限制酶的識別序列58識別序列越短，則在DNA序列中出現(xiàn)的幾率就越大，識別序列越長，則出現(xiàn)的幾率就越?。虼耍诨蚩寺≈幸鶕?jù)不同的要求選擇合適的限制酶．1.5限制酶識別序列出現(xiàn)的幾率識別序列越短，則在DNA序列中出現(xiàn)的幾率就越大，識別序列越長59識別序列與出現(xiàn)幾率的關(guān)系識別序列與出現(xiàn)幾率的關(guān)系601.6多識別序列限制性內(nèi)切酶能夠識別兩種或兩種以上核苷酸序列內(nèi)切酶．1.6多識別序列限制性內(nèi)切酶能夠識別兩種或兩種以上核苷酸序61同裂酶：來源不同，但具有相同識別序列的限制酶．同位酶：具有相同的識別序列，但酶切位點不同的限制性內(nèi)切酶．同尾酶：具有不同識別序列的限制性內(nèi)切酶，切割DNA分子后產(chǎn)生相同的粘性末端.稀切限制性內(nèi)切酶:由于限制性內(nèi)切酶識別序列的特異性，識別位點在DNA分子上出現(xiàn)的幾率特別低．同裂酶：來源不同，但具有相同識別序列的限制酶．62第三章基因工程工具酶課件631.7酶切末端5’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的5’端切割DNA分子的每一條鏈，使得雙鏈DNA分子交錯斷開，產(chǎn)生帶突出的5’粘性末端的DNA片段．1.7酶切末端5’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的64

3’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的3’端切割DNA分子的每一條鏈，使得雙鏈DNA分子交錯斷開，產(chǎn)生帶突出的3’粘性末端的DNA片段．3’粘性末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的3’端切65平末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的上切割DNA分子的每一條鏈，使得雙鏈DNA分子斷開，產(chǎn)生平末端的DNA片段．平末端：限制性內(nèi)切酶在二重對稱軸的上切割661.8限制性內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)1）底物DNA分子：雙鏈DNA分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)效率密切相關(guān)．側(cè)面序列：當(dāng)識別序列兩側(cè)的堿基序列達到一定的長度時，限制性內(nèi)切酶才能正常切割DNA分子的現(xiàn)象．位點偏愛：DNA分子中的某些識別序列能夠迅速被限制性內(nèi)切酶切割，而另一些位點則相對不易被切割的現(xiàn)象．1.8限制性內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)1）底物DNA分子：雙鏈DNA67

DNA甲基化：DNA分子中的某些序列能夠特異性地被甲基化酶所修飾的現(xiàn)象．DNA的甲基化不利于限制性內(nèi)切酶的酶切作用．DNA的純度：DNA樣品中混雜的蛋白質(zhì)，有機溶劑等會影響限制性內(nèi)切酶的切割效率．

DNA分子的濃度：DNA分子的濃度不能過高，否則會難于切動DNA分子．DNA甲基化：DNA分子中的某些序列能夠特異性地被甲基化68

2）限制性內(nèi)切酶的用量活性單位：酶在最適反應(yīng)條件下，60min內(nèi)完全切割1μgDNA的酶活性．容積活性：每1μl酶液中所含的酶活性單位．限制性內(nèi)切酶的用量：不超過酶切反應(yīng)總體積的1/10．內(nèi)切酶儲存緩沖液中含有50%的甘油，酶切反應(yīng)系統(tǒng)中甘油的濃度高于5%時會影響限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)．2）限制性內(nèi)切酶的用量活性單位：酶在最適反應(yīng)條件下，60694)酶切反應(yīng)的緩沖液多數(shù)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)最適溫度為37℃，但少數(shù)限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)溫度高于或低于37℃．3)酶切反應(yīng)的溫度4)酶切反應(yīng)的緩沖液多數(shù)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)最適溫度為37701.9限制性內(nèi)切酶的Star活性某些限制性內(nèi)切酶在特定的條件下，切割位點的識別序列發(fā)生變化．形成Star活性的因素包括：高濃度甘油、低離子強度等．1.9限制性內(nèi)切酶的Star活性某些限制性內(nèi)切酶在特定的條711.10DNA分子的片段化單酶切法：以一種限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，酶切后獲得N（識別位點）個或N+1個DNA片段．雙酶切法：以兩種限制性內(nèi)切酶切割同一DNA分子．可同時酶切或先后酶切．部分酶切法：以限制性內(nèi)切酶對DNA分子進行不完全切割．1.10DNA分子的片段化單酶切法：以一種限制性內(nèi)切酶切721.11DNA分子限制性內(nèi)切酶酶切圖譜DNA分子上各種限制酶識別位點的排列順序．1)雙酶切法：用三種以上待定位的限制性內(nèi)切酶分別單酶切或雙酶切DNA分子，測定各酶切DNA片段的大小，確定各酶切位點的相對位置．1.11DNA分子限制性內(nèi)切酶酶切圖譜DNA分子上各種限制73酶切片段分析酶切片段分析742)末端標(biāo)記DNA的部分酶切法原理：先以P32標(biāo)記DNA分子的5’端，并以單切點的限制酶切割DNA分子，獲得兩個帶標(biāo)記的DNA片段，再以其它限制酶進行部分酶切，得到一系列DNA帶標(biāo)記的DNA片段，根據(jù)所得結(jié)果確定各種限制酶在DNA分子上的位置．2)末端標(biāo)記DNA的部分酶切法原理：先以P32標(biāo)記DNA分75第三章基因工程工具酶課件763)Bal31核酸酶逐步降解法原理：利用Bal31外切酶從DNA片段的兩端逐個切割核苷酸，使原切割片段在瓊脂糖凝膠電泳譜上發(fā)生有規(guī)律的變化，從而確定某種限制酶在DNA片段上各個切割位點．3)Bal31核酸酶逐步降解法原理：利用Bal31外77第三章基因工程工具酶課件782.DNA聚合酶DNA聚合酶：是一類催化DNA合成的酶類，酶的作用需要DNA或RNA作為模板，合成DNA鏈的序列與模板的序列互補。．2.DNA聚合酶DNA聚合酶：是一類催化DNA合成的酶類，792.1DNA聚合酶的種類1)幾種常見的DNA聚合酶2.1DNA聚合酶的種類1)幾種常見的DNA聚合酶802.2幾種DNA聚合酶的應(yīng)用1)E.coliDNA聚合酶I

A）以切口平移的方法標(biāo)記DNA：在Mg2+的存在下，用低限量的DNA酶I處理雙鏈DNA，產(chǎn)生的切口可作為大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）催化DNA合成的引物．合成過程中，dNTP前體不斷摻入到正在增長的DNA鏈上，同時利用全酶的5’3’外切核酸酶活性使切口沿5’3’方向平移．如果提供放射性dNTP前體，則反應(yīng)產(chǎn)物是被放射性標(biāo)記的DNA鏈．

2.2幾種DNA聚合酶的應(yīng)用1)E.coliDNA聚81切口平移法標(biāo)記DNA切口平移法標(biāo)記DNA82B）對DNA分子3’突出尾端進行標(biāo)記首先用3’5’外切核酸酶活性去除DNA的3’突出尾而產(chǎn)生3’凹端．然后在高濃度的放射性標(biāo)記的核苷酸前體的存在下，外切酶降解反應(yīng)與dNTP摻入3’端的反應(yīng)達到平衡．該反應(yīng)實際上是一個不斷地從凹端或平端DNA上除去并置換3’端核苷酸的過程．B）對DNA分子3’突出尾端進行標(biāo)記83利用DNA聚合酶I標(biāo)記DNA的3’端利用DNA聚合酶I標(biāo)記DNA的3’端842）E.coliDNA聚合酶I大片段（Klenow片段）

A）來源：從蛋白酶從全酶中切除具有5’-3’外切酶活性的片段，只剩下聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，目前作為商品提供的Klenow片段是通過枯草桿菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I或通過克隆技術(shù)獲得的單一的多肽鏈．2）E.coliDNA聚合酶I大片段（Klenow片段85

B）應(yīng)用*補平限制酶切割產(chǎn)生的3’凹端．*以[32P]dNTP補平DNA的3’凹端并進行標(biāo)記．*對帶3’突出端的DNA進行末端標(biāo)記．*在cDNA克隆中用于合成cDNA的第二鏈．*在體外誘變中用于從單鏈模板合成雙鏈DNA．B）應(yīng)用863）T4DNA聚合酶

A）補平或標(biāo)記限制酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端B）對3’突出端DNA分子進行末端標(biāo)記C）將雙鏈DNA的粘性末端轉(zhuǎn)化為平末端4）T7DNA聚合酶A）用于拷貝長段模板的引物延伸反應(yīng)B)通過補平或交換反應(yīng)進行末端標(biāo)記3）T4DNA聚合酶875）TaqDNA聚合酶從極度嗜熱的棲熱水生菌（Thermusaquaticus）中純化而得．這些酶具有依賴于聚合作用的5’-3’的外切酶活性，對核苷酸的插入反應(yīng)而言，該酶的具體作用溫度取決于靶序列．最佳溫度為75–80℃，溫度為60℃時活性只剩下1/2，溫度為37℃時，活性剩下1/10．但在許多情況下需要在低于最適反應(yīng)溫度的條件下起始聚合反應(yīng)．A）體外擴增特定序列的DNA分子B）DNA測序：雙脫氧核糖核苷酸法5）TaqDNA聚合酶886）反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）

A）種類目前有兩種反轉(zhuǎn)錄酶，一種是來源于Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶基因的表達產(chǎn)物；另一種是來源于禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶基因的表達產(chǎn)物．兩者間存在差異如表．禽源反轉(zhuǎn)錄酶鼠源反轉(zhuǎn)錄酶組成亞基21最適反應(yīng)溫度42oC〈42oC最適pH值8.37.66）反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）89B)應(yīng)用將mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA而后克隆到原核載體上．標(biāo)記帶5’突出端的DNA片段．