第四章 熒光分析法 現(xiàn)代食品檢測技術(shù) 教學課件

第四章熒光分析法第四章熒光分析法1第一節(jié)概述一、分子發(fā)光某些物質(zhì)的分子吸收一定能量躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)后，在返回電子基態(tài)的過程中伴隨有光輻射。二、分子發(fā)光類型1、按激發(fā)模式①光致發(fā)光：分子因吸收外來輻射的光子能量而被激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。②化學發(fā)光：分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學能量提供的發(fā)光現(xiàn)象。第一節(jié)概述一、分子發(fā)光2③生物發(fā)光：分子的激發(fā)能量是由生物體釋放出來的能量所提供所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。2、按分子激發(fā)態(tài)的類型來劃分①熒光：由第一電子激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。②磷光：由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。③生物發(fā)光：分子的激發(fā)能量是由生物體釋放3

第二節(jié)分子熒光分析法及其基本原理

一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程

1.分子能級與躍遷在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；

第二節(jié)分子熒光分析法及其基本原理

一、熒光與磷42.電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)

平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率小；2.電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則53.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定6（1）無輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重態(tài)電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。10-11s～10-13s通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。（1）無輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換7外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或猝滅。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。10-2s～10-6s改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生8（2）輻射能量傳遞過程熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為

‘2的熒光。10-7～10-9s發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

‘2>

2>

1

；延遲熒光：分子躍遷至T1態(tài)后，因相互碰撞或通過激活作用又回到S1態(tài)，經(jīng)振動馳豫到S1態(tài)的最低振動能級再發(fā)射熒光。（2）輻射能量傳遞過程熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振9磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進入T1的可能過程：S0→T1禁阻躍遷S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持續(xù)一段時間。磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動10（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光激發(fā)光的能量不足，將電子激發(fā)至基態(tài)中較高的振動能級，假如電子在受激后能量沒有損失，并且在瞬時返回原來的能級，于是便在各個不同的方向發(fā)射和激發(fā)光相同波長的輻射，這種輻射稱為瑞利散射光。②拉曼光被激發(fā)到基態(tài)中其它較高振動能級的電子，當它返回到比原來的能級稍高或稍低時，便伴隨著產(chǎn)生波長略長或略短于激發(fā)光波長的拉曼散射光。（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光11S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能l2l1l12二、分子熒光分析的基本原理1、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜（1）.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。二、分子熒光分析的基本原理1、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜13（2）.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。（2）.熒光光譜(或磷光光譜)固定激發(fā)光波長(選14第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件15（3）.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

①.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長（λem）比激發(fā)光譜的波長（λex）長，振動弛豫消耗了能量。

②.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光。

（3）.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系①.Stokes位16第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件17③.鏡像規(guī)則

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；

基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

③.鏡像規(guī)則基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各18200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)192、熒光強度及其與濃度的關(guān)系（1）量子產(chǎn)率及影響因素表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力。

=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。由于激發(fā)分子的去活化過程包括輻射躍遷和非輻射躍遷，因而熒光量子產(chǎn)率也可表示為：

=kf/(kf+∑K)kf：輻射躍遷速率，∑K：非輻射躍遷速率2、熒光強度及其與濃度的關(guān)系（1）量子產(chǎn)率及影響因素20（2）熒光強度與濃度的關(guān)系

①在稀溶液中（bc＜0.05)，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。

If

=2.3I0

bc熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率。在一定條件下：If

=Kc

②在濃溶液中，熒光強度常常隨溶液濃度增加而下降a因入射光強度大大減弱而使所產(chǎn)生的熒光強度大大降低；b.溶質(zhì)與溶質(zhì)間的相互作用產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子形成復(fù)合物；

c自吸收。

（2）熒光強度與濃度的關(guān)系①在稀溶液中（bc＜0.05)213.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：a.具有合適的結(jié)構(gòu)；b.具有一定的熒光量子產(chǎn)率。（2）化合物的結(jié)構(gòu)與熒光①共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。a芳環(huán)越大,熒光峰越移向長波方向b同一共軛環(huán)數(shù)的芳族化合物,線性環(huán)結(jié)構(gòu)者熒光波長比非線性者要強。

3.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件22②剛性平面結(jié)構(gòu)可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。a試劑本身有剛性平面結(jié)構(gòu)②剛性平面結(jié)構(gòu)可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故23b形成絡(luò)合物后,形成剛性平面滂鉻蘭黑R（BBR）無熒光，它與鋁形成螯合物有熒光。

b形成絡(luò)合物后,形成剛性平面24c取代基之間形成氫鍵加強了分子剛性結(jié)構(gòu)和增強熒光強度。d異構(gòu)體的影響順式和反式同分異構(gòu)體具有不同的熒光強度。c取代基之間形成氫鍵加強了分子剛性結(jié)構(gòu)和增強熒光強度。25③取代基效應(yīng)芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。a給電子基團常使熒光增強;取代基對苯熒光的影響(乙醇溶液)化合物分子式熒光波長(nm)熒光相對強度

苯C6H6270—31010苯酚C6H5OH285—36518苯胺C6H5NH2310—40520苯基氰C6H5CN280—39020苯甲醚C6H5OCH3285—34520

③取代基效應(yīng)芳環(huán)上有供電基，使熒光增強?；衔?6b吸電子基團會減弱甚至破壞熒光;c鄰位、對位取代增強熒光，間位取代抑制熒光。d重原子引入體系，熒光強度都很弱，而磷光強度相應(yīng)增強。e與π電子體系作用小的取代基,影響小。b吸電子基團會減弱甚至破壞熒光;27④躍遷類型

*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生。④躍遷類型*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率28第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件294、影響熒光強度的主要因素（1）熒光猝滅①自猝滅a.熒光輻射的自吸收；b.熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子M*與基態(tài)分子M形成激發(fā)態(tài)的二聚體（M*M）；c.基態(tài)的熒光物質(zhì)分子的締合。②電荷轉(zhuǎn)移猝滅激發(fā)態(tài)分子比基態(tài)具有更強的與其他物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的能力，從而導(dǎo)致熒光猝滅。

4、影響熒光強度的主要因素（1）熒光猝滅30③轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅發(fā)生S1→T1間的系間竄躍，把多余的能量消耗于碰撞之中使熒光猝滅。（2）溫度、酸度和溶劑的影響①溫度隨著溶液溫度的降低，熒光物質(zhì)溶液的熒光量子產(chǎn)率和熒光強度將增大。②酸度對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制。③轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅發(fā)生S1→T1間的系間竄躍，把多余的能量31③溶劑除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。（3）表面活性劑的影響①增溶②增敏a提高熒光量子產(chǎn)率;b提高ε。③

增穩(wěn)③溶劑除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配32第三節(jié)：熒光分析儀器

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。

基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管。第三節(jié)：熒光分析儀器測量熒光的儀器主要由四個部分組成33儀

器

光

路

圖儀

器

光

路

圖34一、基本裝置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源（1）條件①足夠的強度②紫外，可見區(qū)域有連續(xù)的光譜③強度與波長無關(guān)④光強穩(wěn)定（2）激發(fā)光源①氙燈（高壓）:250～800nm光譜區(qū)呈連續(xù)光譜，氙燈使用壽命大約為2000h。②汞燈（高壓）:在紫外區(qū)激發(fā)，365nm，使用壽命1500～3000小時。一、基本裝置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源352、單色器①光柵單色器有較高的靈敏度，較寬的波長范圍，能掃描光譜，主要缺點是雜散光較大，有不同級次的譜線干擾，可用前置濾光片加以消除。②濾光片濾光片便宜簡便，在熒光計和熒光分光光度計中有廣泛的應(yīng)用。3、樣品池石英方形池，四面都透光。

4、狹縫狹縫越小，單色性越好，但光強和靈敏度降低。2、單色器①光柵單色器365、檢測器①光電倍增管：靈敏度高，線路簡單。②光電攝像管：具有檢測效率高，動態(tài)范圍寬，線性響應(yīng)好，堅固耐用和壽命長特點。6、讀出裝置記錄儀、陰極示波器和顯示器。二、常用的一些熒光分光計1、YF—1型熒光分光計手控式熒光分光計2、YF—2型熒光分光計自動記錄式3、微機化熒光分光計970CRT型熒光分光光度計；日立F—2500RF—5405、檢測器①光電倍增管：靈敏度高，線路簡單。37磷光檢測

熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。

測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術(shù)。室溫測量時，不需要杜瓦瓶。磷光檢測熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。38第四節(jié)

熒光分析方法與應(yīng)用一、熒光定量分析方法定量依據(jù)

熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時，將括號項近似處理后：

If

=2.3I0lc

=Kc第四節(jié)熒光分析方法與應(yīng)用一、熒光定量分析方法391．

標準曲線法配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度2、比較法在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比較。1．

標準曲線法403、多組分混合物的熒光分析①各組分熒光峰相互不干擾，按單組分測定方法，分別在各自的熒光峰處測定；②如果熒光峰互相干擾，激發(fā)光譜相差大，可選擇在不同的激發(fā)光進行測定，其它組分在此激發(fā)波長不會產(chǎn)生熒光；（書p114例）③如果在同一激發(fā)波長下熒光光譜互相干擾，可以利用熒光強度的加和性，解聯(lián)立方程求出。3、多組分混合物的熒光分析①各組分熒光峰相互不干擾，按單414、熒光分析注意事項①防止熒光污染②防止散射光的干擾三、熒光分析法的特點1、靈敏度高；2、選擇性強；3、重現(xiàn)性好；4、試樣量少；5、應(yīng)用范圍小。4、熒光分析注意事項①防止熒光污染42四、熒光分析法的應(yīng)用1無機化合物的分析與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定2生物與有機化合物的分析見表四、熒光分析法的應(yīng)用1無機化合物的分析43第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件44第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件453、食品檢測方面應(yīng)用（1）食品中礦物質(zhì)及金屬元素的分析（2）食品中氨基酸、維生素等的分析（3）食品霉變物質(zhì)、菌類污染熒光分析（4）食品添加劑、防腐劑、食品包裝有害物質(zhì)分析（5）食品農(nóng)藥殘留、藥物殘留分析3、食品檢測方面應(yīng)用（1）食品中礦物質(zhì)及金屬元素的分析46第四章熒光分析法第四章熒光分析法47第一節(jié)概述一、分子發(fā)光某些物質(zhì)的分子吸收一定能量躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)后，在返回電子基態(tài)的過程中伴隨有光輻射。二、分子發(fā)光類型1、按激發(fā)模式①光致發(fā)光：分子因吸收外來輻射的光子能量而被激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。②化學發(fā)光：分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學能量提供的發(fā)光現(xiàn)象。第一節(jié)概述一、分子發(fā)光48③生物發(fā)光：分子的激發(fā)能量是由生物體釋放出來的能量所提供所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。2、按分子激發(fā)態(tài)的類型來劃分①熒光：由第一電子激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。②磷光：由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。③生物發(fā)光：分子的激發(fā)能量是由生物體釋放49

第二節(jié)分子熒光分析法及其基本原理

一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程

1.分子能級與躍遷在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；

第二節(jié)分子熒光分析法及其基本原理

一、熒光與磷502.電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)

平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率?。?.電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則513.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定52（1）無輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重態(tài)電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。10-11s～10-13s通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。（1）無輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換53外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或猝滅。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。10-2s～10-6s改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生54（2）輻射能量傳遞過程熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為

‘2的熒光。10-7～10-9s發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

‘2>

2>

1

；延遲熒光：分子躍遷至T1態(tài)后，因相互碰撞或通過激活作用又回到S1態(tài)，經(jīng)振動馳豫到S1態(tài)的最低振動能級再發(fā)射熒光。（2）輻射能量傳遞過程熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振55磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進入T1的可能過程：S0→T1禁阻躍遷S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持續(xù)一段時間。磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動56（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光激發(fā)光的能量不足，將電子激發(fā)至基態(tài)中較高的振動能級，假如電子在受激后能量沒有損失，并且在瞬時返回原來的能級，于是便在各個不同的方向發(fā)射和激發(fā)光相同波長的輻射，這種輻射稱為瑞利散射光。②拉曼光被激發(fā)到基態(tài)中其它較高振動能級的電子，當它返回到比原來的能級稍高或稍低時，便伴隨著產(chǎn)生波長略長或略短于激發(fā)光波長的拉曼散射光。（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光57S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能l2l1l58二、分子熒光分析的基本原理1、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜（1）.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。二、分子熒光分析的基本原理1、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜59（2）.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。（2）.熒光光譜(或磷光光譜)固定激發(fā)光波長(選60第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件61（3）.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

①.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長（λem）比激發(fā)光譜的波長（λex）長，振動弛豫消耗了能量。

②.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光。

（3）.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系①.Stokes位62第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件63③.鏡像規(guī)則

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；

基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

③.鏡像規(guī)則基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各64200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)652、熒光強度及其與濃度的關(guān)系（1）量子產(chǎn)率及影響因素表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力。

=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。由于激發(fā)分子的去活化過程包括輻射躍遷和非輻射躍遷，因而熒光量子產(chǎn)率也可表示為：

=kf/(kf+∑K)kf：輻射躍遷速率，∑K：非輻射躍遷速率2、熒光強度及其與濃度的關(guān)系（1）量子產(chǎn)率及影響因素66（2）熒光強度與濃度的關(guān)系

①在稀溶液中（bc＜0.05)，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。

If

=2.3I0

bc熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率。在一定條件下：If

=Kc

②在濃溶液中，熒光強度常常隨溶液濃度增加而下降a因入射光強度大大減弱而使所產(chǎn)生的熒光強度大大降低；b.溶質(zhì)與溶質(zhì)間的相互作用產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子形成復(fù)合物；

c自吸收。

（2）熒光強度與濃度的關(guān)系①在稀溶液中（bc＜0.05)673.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：a.具有合適的結(jié)構(gòu)；b.具有一定的熒光量子產(chǎn)率。（2）化合物的結(jié)構(gòu)與熒光①共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。a芳環(huán)越大,熒光峰越移向長波方向b同一共軛環(huán)數(shù)的芳族化合物,線性環(huán)結(jié)構(gòu)者熒光波長比非線性者要強。

3.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件68②剛性平面結(jié)構(gòu)可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。a試劑本身有剛性平面結(jié)構(gòu)②剛性平面結(jié)構(gòu)可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故69b形成絡(luò)合物后,形成剛性平面滂鉻蘭黑R（BBR）無熒光，它與鋁形成螯合物有熒光。

b形成絡(luò)合物后,形成剛性平面70c取代基之間形成氫鍵加強了分子剛性結(jié)構(gòu)和增強熒光強度。d異構(gòu)體的影響順式和反式同分異構(gòu)體具有不同的熒光強度。c取代基之間形成氫鍵加強了分子剛性結(jié)構(gòu)和增強熒光強度。71③取代基效應(yīng)芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。a給電子基團常使熒光增強;取代基對苯熒光的影響(乙醇溶液)化合物分子式熒光波長(nm)熒光相對強度

苯C6H6270—31010苯酚C6H5OH285—36518苯胺C6H5NH2310—40520苯基氰C6H5CN280—39020苯甲醚C6H5OCH3285—34520

③取代基效應(yīng)芳環(huán)上有供電基，使熒光增強?；衔?2b吸電子基團會減弱甚至破壞熒光;c鄰位、對位取代增強熒光，間位取代抑制熒光。d重原子引入體系，熒光強度都很弱，而磷光強度相應(yīng)增強。e與π電子體系作用小的取代基,影響小。b吸電子基團會減弱甚至破壞熒光;73④躍遷類型

*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生。④躍遷類型*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率74第四章熒光分析法現(xiàn)代食品檢測技術(shù)教學課件754、影響熒光強度的主要因素（1）熒光猝滅①自猝滅a.熒光輻射的自吸收；b.熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子M*與基態(tài)分子M形成激發(fā)態(tài)的二聚體（M*M）；c.基態(tài)的熒光物質(zhì)分子的締合。②電荷轉(zhuǎn)移猝滅激發(fā)態(tài)分子比基態(tài)具有更強的與其他物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的能力，從而導(dǎo)致熒光猝滅。

4、影響熒光強度的主要因素（1）熒光猝滅76③轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅發(fā)生S1→T1間的系間竄躍，把多余的能量消耗于碰撞之中使熒光猝滅。（2）溫度、酸度和溶劑的影響①溫度隨著溶液溫度的降低，熒光物質(zhì)溶液的熒光量子產(chǎn)率和熒光強度將增大。②酸度對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制。③轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅發(fā)生S1→T1間的系間竄躍，把多余的能量77③溶劑除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。（3）表面活性劑的影響①增溶②增敏a提高熒光量子產(chǎn)率;b提高ε。③

增穩(wěn)③溶劑除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配78第三節(jié)：熒光分析儀器

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。

基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管。第三節(jié)：熒光分析儀器測量熒光的儀器主要由四個部分組成79儀

器

光

路

圖儀

器

光

路

圖80一、基本裝置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源（1）條件①足夠的強度②紫外，可見區(qū)域有連續(xù)的光譜③強度與波長無關(guān)④光強穩(wěn)定（2）激發(fā)光源①氙燈（高壓）:250～800nm光譜區(qū)呈連續(xù)光譜，氙燈使用壽命大約為2000h。②汞燈（高壓）:在紫外區(qū)激發(fā)，365nm，使用壽命1500～3000小時。一、基本裝置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源812、單色器①光柵單色器有較高的靈敏度，較寬的波長范圍，能掃描光譜，主要缺點是雜散光較大，有不同級次的譜線干擾，可用前置濾光片加以消除。②濾光片濾光片便宜簡便，在熒光計和熒光分光光度計中有廣泛的應(yīng)用。3、樣品池石英方形池，四面都透光。

4、狹縫狹縫越小，單色性越好，但光強和靈敏度降低。2、單色器①光柵單色器825、檢測器①光電倍增管：靈敏度高，線路簡單。②光電攝像管：具有檢測效率高，動態(tài)范圍寬，線性響應(yīng)好，堅固耐用和壽命長特點。6、讀出裝置記錄儀、陰極示波器和顯示器。