第十八章基因診斷與基因治療課件

第十八章

基因診斷與基因治療

(genediagnosisandtherapy)

11本章主要內(nèi)容

基因診斷基因治療2本章主要內(nèi)容基因診斷2

一.基因診斷概念

利用分子生物學方法，直接檢測基因結構及其表達水平是否異常，從而對疾病作出診斷,為治療提供依據(jù)。第一節(jié)基因診斷3第一節(jié)二.基因診斷特點：

針對性強，特異性高檢測靈敏度和精確性高實用性強，診斷范圍廣

4二.基因診斷特點：4三.基因診斷常用技術方法

核酸分子雜交技術聚合酶鏈反應（PCR）技術生物芯片基因測序5三.基因診斷常用技術方法（一）核酸分子雜交技術

核酸分子雜交

是指一條單鏈核酸分子（DNA或RNA）通過堿基互補與另一條單鏈核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈的過程。

基本原理：

堿基互補、變性和復性

DNA與DNA雜交：

A=T、G≡C;

DNA與RNA雜交:

A=U、G≡C;

變性：

升高溫度至94℃左右，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈；

復性：

緩慢降低溫度（52℃左右），變性的兩條單鏈重新形成互補雙鏈。

堿基互補6（一）核酸分子雜交技術堿基互補6hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC7hybridization

利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補配對，以判斷有無互補的同源核酸序列的存在。

核酸探針

是指帶有標記的、并已知堿基序列的DNA或RNA片段，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補配對結合，進而檢測同源序列。

探針標記物

有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類。8利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可

1.核酸分子雜交的分類液相雜交

待測核酸樣本與特異性探針同時溶于雜交液中進行雜交反應；固相雜交

待測核酸樣本先結合到固相支持物上，再與溶液中的特異性探針進行雜交反應。

常用固相雜交支持物：

硝酸纖維素膜、尼龍膜等－－－91.核酸分子雜交的分類92.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標記核酸探針檢測雜交信號標記核酸探針預雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標記探針102.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變

3.常用固相核酸雜交方法

Southern印跡雜交法（Southernblotting）Northern印跡雜交法（Northernblotting）斑點雜交或狹縫雜交法（Spot/Slotblothybridization）菌落雜交（colonyhybridization）夾心雜交法（sandwichhybridization）原位雜交（hybridizationinsitu）113.常用固相核酸雜交方法11

(1)Southern印跡雜交法限制性內(nèi)切酶酶切

檢測雜交信號

提取DNA

Southern法可用于檢測特異的DNA序列片段,進行基因定位、分子量測定等。12(1)Southern印跡雜交法（2）Northern印跡雜交法

（其基本過程類似于上述Southern法）

提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)移至膜→探針（標記DNA或RNA）與之雜交→顯影或顯色→檢測信號。

Northern法可用于檢測組織細胞中總RNA或mRNA

13（2）Northern印跡雜交法13（3）斑點雜交或狹縫雜交法

基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點到固相支持濾膜上→用標記探針與之雜交→自顯影或顯色反應→檢測雜交信號→分析結果。

優(yōu)點：簡便、快速、靈敏、樣本用量少；

缺點：特異性不高，有一定比例的假陽性。

用途：檢測樣本中存在的微量DNA或RNA1414（4）菌落雜交

該法可從大量細菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。15（4）菌落雜交15（5）夾心雜交法

ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探針

片斷A檢測探針

本法優(yōu)點：

特異性強，對樣本純度要求不高，定量較準確。16（5）夾心雜交法ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探（6）原位雜交

將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。

細胞原位雜交

組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點：

不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。有17（6）原位雜交有17（二）聚合酶鏈反應（PCR）技術

PCR是利用體內(nèi)DNA復制的原理和DNA變性與復性的性質(zhì)，在體外對目的基因DNA進行大量擴增的技術。

1.

PCR基本原理：

PCR技術在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buf.等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結合（復性）和延伸3個步驟的反復循環(huán)（2530次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴增。18（二）聚合酶鏈反應（PCR）技術PCR是利用體

PCR技術原理示意圖（94℃左右）（52℃左右）（72℃左右）19PCR技術原理示意圖（94℃左右（1）DNA模板的熱變性

將待擴增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應體系中作為模板。（2）模板與引物的結合（退火或復性）

將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結合。20（1）DNA模板的熱變性20（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補原則連接在DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

以上為1次PCR循環(huán)（變性、復性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）

按照上述（變性、復性和延伸）3個步驟反復循環(huán)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴增。

模板DNA擴增倍數(shù)T=2n

(n:循環(huán)次數(shù))。21（3）引物延伸212.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝；

RNA作為模板時，需要：RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.

（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是從耐熱細菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→52℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。逆轉(zhuǎn)錄222.PCR各要素及其作用逆轉(zhuǎn)錄22（3）引物

引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。引物是保證PCR擴增產(chǎn)物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。引物設計原則如下：23（3）引物23

引物設計應符合以下基本原則：

①長度適宜，一般為1530個堿基；②G+C含量，一般為40％60％；③4種堿基應隨機性分布；④引物自身不應存在互補序列；⑤兩個引物之間不應有多于4個堿基的互補；⑥引物3ˊ端不應有任何修飾；⑦引物5ˊ可以修飾。24引物設計應符合以下基本原則：24（4）緩沖溶液與Mg2+

PCR技術常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；25（4）緩沖溶液與Mg2+25（6）參數(shù)

變性溫度與時間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時間

取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃延伸溫度與時間

一般選擇：70℃75℃循環(huán)次數(shù)

取決于模板濃度，一般循環(huán)：30次26（6）參數(shù)26

PCR操作

各種PCR反應的操作基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環(huán)參數(shù)。將PCR反應管置于DNA自動化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使DNA擴增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。

PCR技術優(yōu)點

特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。

PCR缺點

由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽性結果。

27

3.PCR產(chǎn)物分析（1）凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。同時應以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結果并拍照。

（在待檢靶序列拷貝數(shù)多、且僅擴增出一條帶時，用此法即可滿足檢測要求。）283.PCR產(chǎn)物分析28（2）點雜交分析法

該法有2種：①將擴增產(chǎn)物直接固定在膜上，每一個探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進行雜交；②將不同的探針固定在膜上，再用有標記的PCR產(chǎn)物與之雜交。

本法有助于檢測突變DNA類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分析。

(當擴增產(chǎn)物時多條帶時，用此法更合適。)29（2）點雜交分析法29

(三)基因芯片

將大量序列已知的基因片段以微陣列方式固定在一芯片上做成高密度的點陣排列，與標記樣品進行雜交，然后用計算機分析雜交信號。30(三)基因芯片30

(四)基因測序即，DNA堿基序列分析，這是最確切、最直接的基因診斷方法。目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。

31

四.基因診斷的臨床應用(一)遺傳病的基因診斷(二)腫瘤的基因診斷(三)感染性疾病的基因診斷32四.基因診斷的臨床應用(一)遺傳病的基因

舉例：

——鐮刀狀紅細胞貧血

β－珠蛋白基因的第六個密碼子A→T↓

表達產(chǎn)物：谷氨酸→纈氨酸

一個堿基突變→缺失1個MstⅡ內(nèi)切酶位點

正常人：1.1kb患者：1.3kb33舉例：33

5’3’

5’3’

1.1kb

1.3kb

MstII酶切位點（CCTNATG）正?；蛲蛔兓?.3kb1.1kb0.2kb123

1、正常人2、突變攜帶者3、患者34

第二節(jié)基因治療

基因治療的概念基因治療的總體策略基因治療的基本程序基因治療的現(xiàn)狀與展望35第二節(jié)基因治療35一、基因治療概念

狹義概念

用具有正常功能的基因去置換或增補患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。

廣義概念

將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達到治療疾病的目的。

36一、基因治療概念36二、基因治療的總體策略

基因矯正

基因置換

基因增補

基因失活

“自殺基因”的應用免疫基因治療耐藥基因治療

37二、基因治療的總體策略37（一）基因矯正（genecorrection）

對于致病基因中的異常堿基進行精確修復，使其恢復正常功能。

（二）基因置換(genereplacement)

用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細胞DNA完全恢復正常狀態(tài)。

38（一）基因矯正（genecorrection）38（三）基因增補*(geneaugmentation)

將正?；?qū)牖颊唧w細胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達，以補償缺陷基因的功能（但致病基因未去除）。（四）基因失活(geneinactivation)

指將特定的反義核酸導入細胞，通過堿基互補作用與mRNA結合，阻斷腫瘤細胞中基因的異常表達，以抗腫瘤、抗病毒。

反義RNA:

干擾mRNA的互補RNA;

反義DNA:

干擾DNA的互補DNA.39（三）基因增補*(geneaugmentation)39（五）“自殺基因”的應用自殺基因(suicidegene)

這種基因?qū)胧荏w細胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒物質(zhì)，將細胞自身殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。如果將自殺基因?qū)肽[瘤細胞，則可將腫瘤細胞殺死。但對正常細胞則無傷害作用。

40（五）“自殺基因”的應用40（六）免疫基因治療將某些細胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強患者的抵抗力。（七）耐藥基因治療在腫瘤化療過程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。41（六）免疫基因治療41

三、基因治療的基本程序（一）治療性基因的獲得

在了解疾病發(fā)生的分子機制基礎上，選擇對疾病有治療作用的特定基因。

如，對單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療；對于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關的癌基因或抑癌基因用于基因治療。

治療性基因獲得的方法很多：

用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫獲得，從cDNA文庫獲取，PCR擴增，人工合成等。42三、基因治療的基本程序42（二）基因載體的選擇

基因治療關鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達。

常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。

病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體等；

非病毒載體：

與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。43（二）基因載體的選擇43（三）靶細胞的選擇

基因治療的受體細胞有生殖細胞和體細胞兩大類。

對生殖細胞進行基因治療，可使該生殖細胞分化發(fā)育成長的個體及其后代均具有正常基因，理論上講是根治遺傳病的理想方法。但由于涉及安全性和倫理學問題，目前基因治療中禁止使用生殖細胞作為靶細胞，只限于使用體細胞。

44（三）靶細胞的選擇44

人類基因治療中，將治療基因?qū)氚屑毎袃煞N途徑。

一種為直接體內(nèi)療法（invivo）：即，將治療基因直接導入體內(nèi)有關組織細胞；

另一種為間接體內(nèi)療法（exvivo）：即，在體外先將治療基因?qū)肱囵B(yǎng)的靶細胞內(nèi)，再將已獲得表達外源基因的遺傳修飾細胞回輸入病人體內(nèi)，達到治療目的。45人類基因治療中，將治療基因?qū)氚屑毎袃煞N45

治療基因?qū)胧荏w細胞的方法

化學方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法（四）基因轉(zhuǎn)移方法

磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法

電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）46

(五)轉(zhuǎn)導細胞的選擇鑒定標記基因技術基因缺陷型受體細胞技術基因共轉(zhuǎn)染技術分子雜交技術外源基因表達鑒定(六)回輸體內(nèi)將治療性基因修飾的細胞以不同方式回輸體內(nèi)。47(五)轉(zhuǎn)導細

四、基因治療的應用與展望

(一)基因治療應滿足的條件：1、單基因缺陷疾病2、僅限體細胞的基因治療3、靶細胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)。4、治療效果應勝過對病人的危害。5、表達水平無需調(diào)控且無副作用。6、需經(jīng)動物實驗驗證安全可行。48四、基因治療的應用與展望48

（二）基因治療有待解決的問題1、難以獲得真正有治療作用的基因。2、外源基因的表達難以在體內(nèi)精確調(diào)控。3、體細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學特性會有改變。4、過多的外源蛋白對機體帶來可能的影響。5、隨機整合潛在的威脅。

49（二）基因治療有待解決的問題49

基因診斷與基因治療（課堂練習）1.核酸分子雜交主要內(nèi)容有制備核酸樣本B.制備與標記特異探針C.核酸樣本的分離、變性、轉(zhuǎn)移和固定預雜交、雜交和漂洗E.檢測雜交信號下列是常用核酸雜交方法的用途，錯誤的是Southern印跡雜交法可用于檢測特異RNA序列片斷Southern印跡雜交法可用于檢測特異DNA序列片斷Northern印跡雜交法可用于檢測DNA或RNANorthern印跡雜交法可用于檢測RNA原位雜交法可用于檢測組織細胞中的DNA或RNA50基因診斷與基因治療（課堂練習）503.以下是關于PCR技術的敘述，錯誤是PCR技術進行體外DNA擴增，其過程不同于體內(nèi)DNA復制過程需要目的DNA兩條鏈為模板需Taq酶代替DNA聚合酶需RNA引物代替DNA引物PCR經(jīng)過DNA變性、復性和延伸3個步驟的反復循環(huán)基因診斷常用技術有核酸分子雜交B.聚合酶鏈反應基因芯片D.基因測序E.以上都可以513.以下是關于PCR技術的敘述，錯誤是51

52

Eggsarecoaxedtomatureinaculturedish.Eachhasaremnanteggcellcalledthepolarbodyandcumuluscellsfromtheovaryclingingtoit.53EggsarecoaxedtomatureinaWhileaneggisheldstillwithapipette,aneedleisusedtodrillthroughthezonapellucida,removingaplug.54WhileaneggisheldstillAfterejectingthezonaplug,theneedleisinsertedbackintheeggthroughtheholetowithdrawanddiscardthepolarbodyandtheegg'sgeneticmaterial.55AfterejectingthezonaplugAcumuluscellfromanothereggistakenupintotheneedle.Cellscalledfibroblasts(ortheirnuclei)canalsobeusedinthisstep.56AcumuluscellfromanotherThecumuluscellisinjecteddeepintotheeggthathasbeenstrippedofitsgeneticmaterial.57ThecumuluscellisinjectedTheinjectedeggisexposedtoamixtureofchemicalsandgrowthfactorsdesignedtoactivateittodivide.58TheinjectedeggisexposedAfterroughly24hours,theactivatedeggbeginsdividing.

Thecellscontaingeneticmaterialonlyfromtheinjectedcumuluscell.59Afterroughly24hours,theBythefourthorfifthday,ahollowballofroughly100cellshasformed.Itholdsaclumpofcellscalledtheinnercellmassthatcontainsstemcells.

60Bythefourthorfifthday,Theblastocystisbrokenopen,andtheinnercellmassisgrowninaculturedishtoyieldstemcells.61TheblastocystisbrokenopeThestemcells,inturn,canbecoaxedtogrowintoavarietyofcellsthatmightonedaybeinjectedintopatients.--

62Thestemcells,inturn,can

第十八章

基因診斷與基因治療

(genediagnosisandtherapy)

631本章主要內(nèi)容

基因診斷基因治療64本章主要內(nèi)容基因診斷2

一.基因診斷概念

利用分子生物學方法，直接檢測基因結構及其表達水平是否異常，從而對疾病作出診斷,為治療提供依據(jù)。第一節(jié)基因診斷65第一節(jié)二.基因診斷特點：

針對性強，特異性高檢測靈敏度和精確性高實用性強，診斷范圍廣

66二.基因診斷特點：4三.基因診斷常用技術方法

核酸分子雜交技術聚合酶鏈反應（PCR）技術生物芯片基因測序67三.基因診斷常用技術方法（一）核酸分子雜交技術

核酸分子雜交

是指一條單鏈核酸分子（DNA或RNA）通過堿基互補與另一條單鏈核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈的過程。

基本原理：

堿基互補、變性和復性

DNA與DNA雜交：

A=T、G≡C;

DNA與RNA雜交:

A=U、G≡C;

變性：

升高溫度至94℃左右，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈；

復性：

緩慢降低溫度（52℃左右），變性的兩條單鏈重新形成互補雙鏈。

堿基互補68（一）核酸分子雜交技術堿基互補6hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC69hybridization

利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補配對，以判斷有無互補的同源核酸序列的存在。

核酸探針

是指帶有標記的、并已知堿基序列的DNA或RNA片段，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補配對結合，進而檢測同源序列。

探針標記物

有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類。70利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可

1.核酸分子雜交的分類液相雜交

待測核酸樣本與特異性探針同時溶于雜交液中進行雜交反應；固相雜交

待測核酸樣本先結合到固相支持物上，再與溶液中的特異性探針進行雜交反應。

常用固相雜交支持物：

硝酸纖維素膜、尼龍膜等－－－711.核酸分子雜交的分類92.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標記核酸探針檢測雜交信號標記核酸探針預雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標記探針722.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變

3.常用固相核酸雜交方法

Southern印跡雜交法（Southernblotting）Northern印跡雜交法（Northernblotting）斑點雜交或狹縫雜交法（Spot/Slotblothybridization）菌落雜交（colonyhybridization）夾心雜交法（sandwichhybridization）原位雜交（hybridizationinsitu）733.常用固相核酸雜交方法11

(1)Southern印跡雜交法限制性內(nèi)切酶酶切

檢測雜交信號

提取DNA

Southern法可用于檢測特異的DNA序列片段,進行基因定位、分子量測定等。74(1)Southern印跡雜交法（2）Northern印跡雜交法

（其基本過程類似于上述Southern法）

提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)移至膜→探針（標記DNA或RNA）與之雜交→顯影或顯色→檢測信號。

Northern法可用于檢測組織細胞中總RNA或mRNA

75（2）Northern印跡雜交法13（3）斑點雜交或狹縫雜交法

基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點到固相支持濾膜上→用標記探針與之雜交→自顯影或顯色反應→檢測雜交信號→分析結果。

優(yōu)點：簡便、快速、靈敏、樣本用量少；

缺點：特異性不高，有一定比例的假陽性。

用途：檢測樣本中存在的微量DNA或RNA7614（4）菌落雜交

該法可從大量細菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。77（4）菌落雜交15（5）夾心雜交法

ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探針

片斷A檢測探針

本法優(yōu)點：

特異性強，對樣本純度要求不高，定量較準確。78（5）夾心雜交法ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探（6）原位雜交

將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。

細胞原位雜交

組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點：

不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。有79（6）原位雜交有17（二）聚合酶鏈反應（PCR）技術

PCR是利用體內(nèi)DNA復制的原理和DNA變性與復性的性質(zhì)，在體外對目的基因DNA進行大量擴增的技術。

1.

PCR基本原理：

PCR技術在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buf.等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結合（復性）和延伸3個步驟的反復循環(huán)（2530次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴增。80（二）聚合酶鏈反應（PCR）技術PCR是利用體

PCR技術原理示意圖（94℃左右）（52℃左右）（72℃左右）81PCR技術原理示意圖（94℃左右（1）DNA模板的熱變性

將待擴增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應體系中作為模板。（2）模板與引物的結合（退火或復性）

將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結合。82（1）DNA模板的熱變性20（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補原則連接在DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

以上為1次PCR循環(huán)（變性、復性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）

按照上述（變性、復性和延伸）3個步驟反復循環(huán)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴增。

模板DNA擴增倍數(shù)T=2n

(n:循環(huán)次數(shù))。83（3）引物延伸212.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝；

RNA作為模板時，需要：RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.

（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是從耐熱細菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→52℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。逆轉(zhuǎn)錄842.PCR各要素及其作用逆轉(zhuǎn)錄22（3）引物

引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。引物是保證PCR擴增產(chǎn)物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。引物設計原則如下：85（3）引物23

引物設計應符合以下基本原則：

①長度適宜，一般為1530個堿基；②G+C含量，一般為40％60％；③4種堿基應隨機性分布；④引物自身不應存在互補序列；⑤兩個引物之間不應有多于4個堿基的互補；⑥引物3ˊ端不應有任何修飾；⑦引物5ˊ可以修飾。86引物設計應符合以下基本原則：24（4）緩沖溶液與Mg2+

PCR技術常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；87（4）緩沖溶液與Mg2+25（6）參數(shù)

變性溫度與時間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時間

取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃延伸溫度與時間

一般選擇：70℃75℃循環(huán)次數(shù)

取決于模板濃度，一般循環(huán)：30次88（6）參數(shù)26

PCR操作

各種PCR反應的操作基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環(huán)參數(shù)。將PCR反應管置于DNA自動化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使DNA擴增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。

PCR技術優(yōu)點

特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。

PCR缺點

由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽性結果。

89

3.PCR產(chǎn)物分析（1）凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。同時應以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結果并拍照。

（在待檢靶序列拷貝數(shù)多、且僅擴增出一條帶時，用此法即可滿足檢測要求。）903.PCR產(chǎn)物分析28（2）點雜交分析法

該法有2種：①將擴增產(chǎn)物直接固定在膜上，每一個探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進行雜交；②將不同的探針固定在膜上，再用有標記的PCR產(chǎn)物與之雜交。

本法有助于檢測突變DNA類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分析。

(當擴增產(chǎn)物時多條帶時，用此法更合適。)91（2）點雜交分析法29

(三)基因芯片

將大量序列已知的基因片段以微陣列方式固定在一芯片上做成高密度的點陣排列，與標記樣品進行雜交，然后用計算機分析雜交信號。92(三)基因芯片30

(四)基因測序即，DNA堿基序列分析，這是最確切、最直接的基因診斷方法。目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。

93

四.基因診斷的臨床應用(一)遺傳病的基因診斷(二)腫瘤的基因診斷(三)感染性疾病的基因診斷94四.基因診斷的臨床應用(一)遺傳病的基因

舉例：

——鐮刀狀紅細胞貧血

β－珠蛋白基因的第六個密碼子A→T↓

表達產(chǎn)物：谷氨酸→纈氨酸

一個堿基突變→缺失1個MstⅡ內(nèi)切酶位點

正常人：1.1kb患者：1.3kb95舉例：33

5’3’

5’3’

1.1kb

1.3kb

MstII酶切位點（CCTNATG）正?；蛲蛔兓?.3kb1.1kb0.2kb123

1、正常人2、突變攜帶者3、患者96

第二節(jié)基因治療

基因治療的概念基因治療的總體策略基因治療的基本程序基因治療的現(xiàn)狀與展望97第二節(jié)基因治療35一、基因治療概念

狹義概念

用具有正常功能的基因去置換或增補患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。

廣義概念

將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達到治療疾病的目的。

98一、基因治療概念36二、基因治療的總體策略

基因矯正

基因置換

基因增補

基因失活

“自殺基因”的應用免疫基因治療耐藥基因治療

99二、基因治療的總體策略37（一）基因矯正（genecorrection）

對于致病基因中的異常堿基進行精確修復，使其恢復正常功能。

（二）基因置換(genereplacement)

用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細胞DNA完全恢復正常狀態(tài)。

100（一）基因矯正（genecorrection）38（三）基因增補*(geneaugmentation)

將正?；?qū)牖颊唧w細胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達，以補償缺陷基因的功能（但致病基因未去除）。（四）基因失活(geneinactivation)

指將特定的反義核酸導入細胞，通過堿基互補作用與mRNA結合，阻斷腫瘤細胞中基因的異常表達，以抗腫瘤、抗病毒。

反義RNA:

干擾mRNA的互補RNA;

反義DNA:

干擾DNA的互補DNA.101（三）基因增補*(geneaugmentation)39（五）“自殺基因”的應用自殺基因(suicidegene)

這種基因?qū)胧荏w細胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒物質(zhì)，將細胞自身殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。如果將自殺基因?qū)肽[瘤細胞，則可將腫瘤細胞殺死。但對正常細胞則無傷害作用。

102（五）“自殺基因”的應用40（六）免疫基因治療將某些細胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強患者的抵抗力。（七）耐藥基因治療在腫瘤化療過程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。103（六）免疫基因治療41

三、基因治療的基本程序（一）治療性基因的獲得

在了解疾病發(fā)生的分子機制基礎上，選擇對疾病有治療作用的特定基因。

如，對單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療；對于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關的癌基因或抑癌基因用于基因治療。

治療性基因獲得的方法很多：

用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫獲得，從cDNA文庫獲取，PCR擴增，人工合成等。104三、基因治療的基本程序42（二）基因載體的選擇

基因治療關鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達。

常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。

病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體等；

非病毒載體：

與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。105（二）基因載體的選擇43（三）靶細胞的選擇

基因治療的受體細胞有生殖細胞和體細胞兩大類。

對生殖細胞進行基因治療，可使該生殖細胞分化發(fā)育成長的個體及其后代均具有正常基因，理論上講是根治遺傳病的理想方法。但由于涉及安全性和倫理學問題，目前基因治療中禁止使用生殖細胞作為靶細胞，只限于使用體細胞。

106（三）靶細胞的選擇44

人類基因治療中，將治療基因?qū)氚屑毎袃煞N途徑。

一種為直接體內(nèi)療法（invivo）：即，將治療基因直接導入體內(nèi)有關組織細胞；

另一種為間接體內(nèi)療法（exvivo）：即，在體外先將治療基因?qū)肱囵B(yǎng)的靶細胞內(nèi)，再將已獲得表達外源基因的遺傳修飾細胞回輸入病人體內(nèi)，達到治療目的。107人類基因治療中，將治療基因?qū)氚屑毎袃煞N45

治療基因?qū)胧荏w細胞的方法

化學方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法（四）基因轉(zhuǎn)移方法

磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法

電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）108

(五)轉(zhuǎn)導細胞的選擇鑒定標記基因技術基因缺陷型受體細胞技術基因共轉(zhuǎn)染技術分子雜交技術外源基因表達鑒定(六)回輸體內(nèi)將治療性基因修飾的細胞以不同方式回輸體內(nèi)。109(五)轉(zhuǎn)導細

四、基因治療的應用與展望

(一)基因治療應滿足的條件：1、單基因缺陷疾病2、僅限體細胞的基因治療3、靶細胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)。4、治療效果應勝過對病人的危害。5、表達水平無需調(diào)控且無副作用。6、需經(jīng)動物實驗驗證安全可行。110四、基因治療的應用與展望48

（二）基因治療有待解決的問題1、難以獲得真正有治療作用的基因。2、外源基因的表達難以在體內(nèi)精確調(diào)控。3、體細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學特性會有改變。4、過多的外源蛋白對機體帶來可能的影響。