植物組織中總氮、蛋白氮含量的測定(微量凱氏法)

植物組織中總氮、蛋白氮含量的測定（微量凱氏法）氮素代謝在植物的新陳代謝中占主導(dǎo)地位。植物組織中有機(jī)氰化物的含量隨著植物的生理狀況及環(huán)境條件的不同而發(fā)生變化。所以測定其含量，對(duì)研究植物的氮素吸收、運(yùn)輸和代謝規(guī)律，以及確定農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)、營養(yǎng)價(jià)值等具有一定意義。一、原理植物組織中的有機(jī)氰化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量無機(jī)氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子?？杉尤肴纫宜?，使其最終濃度為5%，將蛋白質(zhì)沉淀出來，分別測定總氮、蛋白氮或非蛋白氮，通常只測定總氮或蛋白氮。將植物材料與濃硫酸共熱，硫酸分解為二氧化硫、水和原子態(tài)氧，并將有機(jī)物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步生成硫酸銨。為了加速有機(jī)物質(zhì)的分解，在消化時(shí)通常加入多種催化劑，如硫酸銅、硫酸鉀和硒粉等。消化完成后、加入過量的NaOH，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3，導(dǎo)入過量的硼酸溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計(jì)算，可得出含氮量。以甘氨酸為例，上述反應(yīng)如下：蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量（約在14%~18%，平均約含氯16%），所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100/16=6.25），算出蛋白質(zhì)的含量。若以總氮含量乘以6.25，就是樣品的粗蛋白含量。試樣中若含有硝態(tài)氮時(shí)，首先要使硝態(tài)氮還原為銨態(tài)氮，可加入水楊酸和硫代硫酸鈉，使硝態(tài)氮與水楊酸在室溫下作用生成硝基水楊酸，再用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）或Zn粉使硝基水楊酸轉(zhuǎn)化為銨鹽。由于水楊酸與硫代硫酸鈉會(huì)消耗一部分硫酸，所以消化時(shí)的硫酸用量要酌情增加。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料各種干燥、粉碎、過篩（60~80目）的植物樣品。（二）儀器設(shè)備消化管，微量凱氏定氮蒸餾裝置一套（圖2-30-1），三角燒瓶，微量滴定管，量筒，容量瓶，燒杯，移液管等。試劑濃硫酸（AR級(jí)）。（2）5%三氯乙酸。（3）30%過氧化氫。（4）40%NaOH。（5）混合催化劑：K2SO4：CuSO4·5H2O=3：1或Se：CuSO2·5H，0：KSO4=1：5：50，充分研細(xì)、混勻，貯于廣口瓶中備用。（6）混合指示劑：取200mL0.1%甲基紅酒精溶液和50mL0.1%甲烯藍(lán)酒精溶液混合，貯于棕色瓶中備用。本指示劑在pH=5.2時(shí)為紫紅色，pH=5.4時(shí)為暗灰或褐色，pH=5.6時(shí)為綠色，變色點(diǎn)pT為5.4，變色范圍為pH5.2~5.6，非常靈敏。（7）2%硼酸溶液：按100：1的體積比加入混合指示劑，搖勻后溶液呈紫紅色即可。（8）0.0100mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液：取比重1.19的分析純鹽酸8.4mL，加無氨蒸餾水稀釋至1L，再以硼酸鈉標(biāo)定。標(biāo)定方法：精確稱取四硼酸鈉（Na2B407·10H20）0.50g，溶于50mL蒸餾水中，加混合指示劑2~3滴，用配好的鹽酸溶液滴至淺紅色。精確計(jì)算鹽酸的濃度并稀釋成0.0100mol/L。標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（約含N0.6mg/mL）：取適量硫酸銨（A.R）于110℃烘箱內(nèi)烘30min后取出，置于干燥器中冷卻后，準(zhǔn)確稱取2.829g，加無氨蒸餾水溶解并定容至1000mL。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）樣品提取分離準(zhǔn)確稱取烘至恒重的樣品0.1000g~0.5000g（依樣品含氮量而定，含氮1~3mg為宜），置10mL離心管中，加入5mL5%三氯乙酸，90℃水浴中浸提15min，不時(shí)攪拌，取出后用少量蒸餾水沖洗玻棒，待溶液冷卻后，4000r/min離心15min，上清液棄去。并用5%三氯乙酸洗沉淀2~3次，離心，棄去上清液，最后用蒸餾水將沉淀無損地洗入鋪有濾紙的漏斗上，去掉濾液后，將沉淀和濾紙?jiān)?0℃下烘干，用于蛋白氮的測定。（二）樣品的消化取4支消化管編號(hào)。1號(hào)管直接放入稱好的材料用于測定總氮，2號(hào)管放入上述烘干的濾紙和沉淀，用于蛋白氮的測定，3號(hào)管放入同樣濾紙一張，4號(hào)管不加任何樣品作為空白對(duì)照、注意將樣品放入消化管底部。向各消化管加濃硫酸5mL，混合催化劑0.3~0.5g，將樣品浸泡數(shù)小時(shí)或放置過夜后，在管口蓋一小漏斗，放在遠(yuǎn)紅外消煮爐上加熱消化。開始時(shí)溫度可稍低，以防止內(nèi)容物上升至管口。泡沫多時(shí)，可從小漏斗加入2~3滴無水乙醇。到管口出現(xiàn)白色霧狀物時(shí)，泡沫已不再產(chǎn)生，此時(shí)可逐漸升溫，使內(nèi)容物達(dá)到微沸，直到消化液變?yōu)榍宄和该鳛橹?。消化過程中，若在消化管上部發(fā)現(xiàn)有黑色顆粒時(shí)，應(yīng)小心地轉(zhuǎn)動(dòng)消化管，用消化液將它沖洗下來，以保證樣品消化完全。消化過程約需2~3h。（三）定容消化完畢，待溶液冷卻后，沿管壁仔細(xì)加入10mL左右無氨蒸餾水，以沖洗管壁，再將消化液小心轉(zhuǎn)入100ml.容量瓶中。以無氨水少量多次沖洗消化管，洗滌液并入容量瓶。冷卻后用無氮水定容至刻度，混勻備用。（四）蒸餾及滴定蒸餾及滴定過程可分以下幾步進(jìn)行；1.儀器的洗滌先經(jīng)一般洗滌后，還要用水蒸氣洗滌。可按下列方法進(jìn)行蒸氣洗滌。先在蒸氣發(fā)生器中加入2/3體積的蒸餾水（事先加入幾滴濃硫酸，使其酸化，加入甲基紅指示劑，并加入少許沸石或毛細(xì)玻璃管以防止爆沸）。打開漏斗下的夾子，用電爐或酒精爐加熱至沸騰，使水蒸氣通入儀器的各個(gè)部分，以達(dá)到清洗的目的。在冷凝管下端放置一個(gè)三角瓶接收冷凝水，然后關(guān)緊漏斗下的夾子，繼續(xù)用蒸氣洗滌5min。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，蒸餾瓶中的廢液由于減壓而倒吸進(jìn)入收集器，打開收集器下端的活塞排除廢液。如此清洗2~3次，再在冷凝管下端換放一個(gè)盛有硼酸-指示劑混合液的三角瓶，使冷凝管下口完全浸沒在液面以下0.5cm處，蒸餾1~2min，觀察三角瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。移去三角瓶，再蒸餾1~2min，用蒸餾水沖洗冷凝管下口，關(guān)閉電爐，儀器即可供測定樣品使用（圖2-30-1)。2.標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測定為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)，并檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，找出系統(tǒng)誤差、常用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次。在三角瓶中加入20mL硼酸-指示劑混合液，將此三角瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸入溶液中。注意在加樣前務(wù)必打開收集器活塞，以免三角瓶內(nèi)液體倒吸。準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，加到漏斗中，小心打開漏斗下的夾子，使硫酸銨緩慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水洗滌漏斗三次（每次約1~2mL），一并放入蒸餾瓶中。然后用量筒向漏斗里加入10mL40%的氫氧化鈉溶液、使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，待堿液尚未流完時(shí)，將夾子夾緊，向漏斗中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開夾子，使一半蒸餾水流入蒸溜瓶，另一半留在漏斗中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸汽發(fā)生器，開始蒸餾。三角瓶中硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時(shí)起，再蒸餾3~5min后，移動(dòng)三角瓶，使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約1cm，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管下口，繼續(xù)蒸餾1min，移開三角瓶，蓋上表面皿。按上述方法再用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測定兩次。另取2ml蒸餾水代替硫酸銨溶液進(jìn)行空白測定。將各次蒸餾的三角瓶一起滴定。取三次滴定的平均值進(jìn)行含氮量的計(jì)算，并將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值（即加入硫酸銨中的含氮量）進(jìn)行比較，得到氮的回收率。每次蒸餾完畢，移去電爐，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的橡膠管，排除廢液，并用蒸餾水沖洗漏斗幾次，廢液排出，如此反復(fù)沖洗干凈后，即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的蒸餾。3.樣品及空白的蒸餾準(zhǔn)確吸取稀釋后的消化液5mL，通過漏斗加入到蒸餾瓶中，再用少量蒸餾水洗滌漏斗3次，其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾進(jìn)行。4.滴定樣品與空白蒸餾完畢后，一起進(jìn)行滴定。選用微量酸式滴定管，加入0.0100mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定，直至三角瓶中硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色即為滴定終點(diǎn)，記錄鹽酸的用量。四、結(jié)果計(jì)算含氮量為0.6mg/mL；V為標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的滴定值/mL；V。為空白的滴定值/mL；V，為蛋白氮的滴