免疫組化技術(shù)

關(guān)于免疫組化技術(shù)第一頁，共八十七頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫組織化學(xué)理論基礎(chǔ)

一、免疫反應(yīng)

免疫組織化學(xué)技術(shù)以免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)為理論基礎(chǔ)。

（一）抗原

抗原是一種化學(xué)物質(zhì)，能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并能在體內(nèi)和體外特異性結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物?？乖哂忻庖咴院头磻?yīng)原性，免疫原性指抗原分子具有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性，反應(yīng)原性指抗原分子與抗體或效應(yīng)T細(xì)胞等免疫應(yīng)答物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的特性?？乖梢允强扇苄晕镔|(zhì)（如毒素或蛋白質(zhì)）或微粒（細(xì)菌或組織細(xì)胞）。第二頁，共八十七頁，2022年，8月28日T細(xì)胞B細(xì)胞AgTBT漿細(xì)胞致敏T細(xì)胞抗體第三頁，共八十七頁，2022年，8月28日

1．抗原的性質(zhì)

（1）異物性：機體能對進(jìn)入體內(nèi)的異種、異體的大分子物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，該物質(zhì)與機體的種系關(guān)系越遠(yuǎn)，其免疫原性越強，機體的免疫反應(yīng)也越強。同種異體物質(zhì)也可作為抗原，如人紅細(xì)胞ABO血型抗原，人類白細(xì)胞組織相容性抗原（HLA）。第四頁，共八十七頁，2022年，8月28日

1.免疫原性

指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答(產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞)的性質(zhì)。

AgTBT漿細(xì)胞致敏T細(xì)胞抗體第五頁，共八十七頁，2022年，8月28日2.反應(yīng)原性(又稱免疫反應(yīng)性)

指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞)發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。AgTBT漿細(xì)胞致敏T細(xì)胞抗體第六頁，共八十七頁，2022年，8月28日第七頁，共八十七頁，2022年，8月28日第八頁，共八十七頁，2022年，8月28日

（2）大分子膠體：抗原分子量越大，其表面積越大，接觸免疫細(xì)胞的機會越多，在體內(nèi)停留時間長而不易排除，因而對機體的刺激作用也越強。一般具有免疫原性的物質(zhì)，分子量常在10000以上。小于5000~10000的蛋白質(zhì)分子，免疫原性很弱或完全沒有。

（3）特異性：一種抗體只能與相應(yīng)的抗原反應(yīng)而不能與其他抗原反應(yīng)，這種抗原稱為特異性抗原（specificantigen）。不同的抗原物質(zhì)常含有共同的抗原成分，即一種抗體可以與二種或二種以上不同抗原反應(yīng)，這些抗原稱為共同抗原（commonantigen）。第九頁，共八十七頁，2022年，8月28日

3．抗原的種類分類方法很多。根據(jù)抗原的性質(zhì)分為完全抗原和不完全抗原：

（1）完全抗原：同時具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)，能在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生效應(yīng)物質(zhì)，并可與產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)特異性結(jié)合，如細(xì)菌、蛋白質(zhì)等。

（2）不完全抗原或半抗原，指在體內(nèi)單獨存在時時免疫原性、但能與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合的低分子化合物或化學(xué)基團(tuán)。能與半抗原結(jié)合使其具有免疫原性的蛋白質(zhì)部分稱為載體（carrier），載體使結(jié)合物具有免疫原性，半抗原決定結(jié)合物的特異性。第十頁，共八十七頁，2022年，8月28日

3、完全抗原與半抗原

1）完全抗原（completeantigen)具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。

2）半抗原（hapten，又稱不完全抗原incompleteantigen），無反應(yīng)原性，只有抗原性的物質(zhì)。半抗原+蛋白質(zhì)→完全抗原第十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日半抗原

+載體抗體BT完全抗原BBBT第十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日2．抗原決定簇（AD）概念：抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱為表位AD的數(shù)目、性質(zhì)和空間構(gòu)象決定抗原特異性抗原以AD與相應(yīng)抗原受體及抗體特異性結(jié)合第十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日

（二）抗體機體的免疫活性淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下成為致敏淋巴細(xì)胞，進(jìn)而分化、增殖為記憶細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞，后者再分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生和分泌相應(yīng)的抗體。根據(jù)抗體發(fā)揮功能的不同可以稱為凝集素、調(diào)理素和沉淀素等。

1．抗體的性質(zhì)

1972年，國際免疫學(xué)聯(lián)合會正式將化學(xué)機構(gòu)與抗體相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白（Ig）。人類Ig有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，五種Ig都具有IgG的基本結(jié)構(gòu)。IgG分子有4條對稱的多肽鏈，兩條輕鏈（L鏈）和重鏈（H鏈），以共價和非共價二硫鍵連接組成，通常用L2H2表示。多肽鏈的氨基(N)

第十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日末端的氨基酸組成及序列隨結(jié)合抗原的特異性而異，稱可變區(qū)（V），是與抗原結(jié)合的部位，也稱Fab段；羧基（C）末端的氨基酸組成及序列比較穩(wěn)定，稱為穩(wěn)定區(qū)（C），是與Fc受體結(jié)合的部位，也稱Fc段。

2．抗體的產(chǎn)生抗原初次進(jìn)入機體后，首先被抗原呈遞細(xì)胞（APC）如巨噬細(xì)胞吞噬，經(jīng)消化降解保留其有效的抗原決定簇（特異性抗原成分），并呈遞給T淋巴細(xì)胞。

T淋巴細(xì)胞受到抗原信息刺激后，活化、增殖、分化為效應(yīng)T細(xì)胞，同時分泌大量細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞活化、增殖、分化為漿細(xì)胞，合成和分泌抗體。第十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日

3．抗體的種類根據(jù)獲得抗體的途徑或來源不同，分為免疫抗體、天然抗體和自身抗體。根據(jù)抗原與抗體在試管內(nèi)是否出現(xiàn)肉眼可見的免疫反應(yīng)，分為完全抗體和不完全抗體。（三）抗原抗體反應(yīng)抗原與抗體在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)，二者統(tǒng)稱為免疫學(xué)反應(yīng)，具有高度的特異性。主要有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補體參加的各種血清學(xué)反應(yīng)。抗原與抗體所形成的抗原抗體復(fù)合物不是靠化學(xué)共價鍵結(jié)合，而是抗原決定簇與抗體分子的抗原結(jié)合位點的相互吸引，同時還有靜電引力、范德華力、氫鍵、疏水鍵等參與。第十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日所以，抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合不僅具有特異性，而且結(jié)合得十分穩(wěn)定，二者在復(fù)合物中仍可保留各自原有的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性，只有在特殊條件下才能解離，如低pH高濃度鹽（3mol/L硫氫化鉀，7mol/L尿素）。在免疫組化操作過程中，已形成復(fù)合物的抗體不可能被緩沖液從組織中洗脫，所洗去的只是未結(jié)合的或結(jié)合后多余的抗體。一個抗體分子有兩個抗原結(jié)合位點（二價），但一個抗原分子可有多個結(jié)合位點（多價），抗原與抗體的反應(yīng)不受數(shù)量比例的限制，但要出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，抗原抗體需保持一定的比例。第十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日

二、免疫組織化學(xué)基本技術(shù)方法不同的免疫組織化學(xué)技術(shù)各有獨特的試劑和方法，但基本技術(shù)方法是一致的，一般包括抗體制備、標(biāo)本處理、免疫染色、對照實驗和顯微鏡觀察等。

1．抗體的制備高敏感特異性抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要條件。抗體有單克隆抗體和多克隆抗體兩大類，目前已商品化。新購買的抗體應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的效價分裝保存，在-20℃~-70℃冰箱中可保存1~2年。小量抗體最好一次用完，避免反復(fù)凍溶，以免降低效價。第十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日

2．標(biāo)本的處理標(biāo)本的采集和處理是免疫組織化學(xué)技術(shù)成功的前提，要保證待檢組織新鮮，選用合適的固定液及時固定、切片等。

3．免疫染色由于在組織和細(xì)胞進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)一般是不可見的，需要用標(biāo)記方法將某種標(biāo)記物或熒光素結(jié)合到抗體上，再用組織化學(xué)方法顯示此標(biāo)記物或在熒光顯微鏡下觀察熒光素發(fā)出的熒光。用這些標(biāo)記的抗體可以在組織切片上鑒別是否發(fā)生了特異的抗原抗體反應(yīng)，并可對與抗體結(jié)合的抗原進(jìn)行定位。第十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日

三、結(jié)果判斷對免疫組織化學(xué)結(jié)果的判斷應(yīng)持科學(xué)慎重的態(tài)度。要準(zhǔn)確判斷陰性和陽性，排除假陽性和假陰性結(jié)果以及非特異性染色，必須嚴(yán)格對照實驗。

1．陽性細(xì)胞的染色特征

有胞漿、胞核和胞膜表面著色三種類型，大部分抗原位于胞漿，可見于整個或部分胞漿；陽性細(xì)胞可呈灶性和彌漫性分布；因抗原含量不同，染色強度不一，如細(xì)胞之間染色相同，常提示為非特異性染色；陽性細(xì)胞定位于單個細(xì)胞，且與陰性細(xì)胞混雜分布，而非特異性染色常波及一片細(xì)胞；切片邊緣、刀痕、皺摺，壞死重疊細(xì)胞區(qū)，膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的染色強度，不能用于判斷陽性。第二十頁，共八十七頁，2022年，8月28日

2．染色失敗的常見原因

通常有以下幾種：（1）均一陰性：可能是操作步驟，抗體質(zhì)量，相關(guān)試劑質(zhì)量，pH等出現(xiàn)了問題。（2）均一弱陽性：可能是抗體濃度過高或溫育時間過長，H2O2濃度過高或顯色反應(yīng)時間過長，緩沖液未加NaCl或pH有誤，粘片劑太厚等因素。（3）背景過深：可能是未用酶處理切片，切片過厚，漂洗時間不足，顯色反應(yīng)過長，封閉血清不足或血清溶血，全血清抗體稀釋不夠等因素。（4）陽性對照良好，待檢切片陰性：標(biāo)本固定和處理不當(dāng)是最常見的原因。第二十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日第二節(jié)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

一、免疫熒光的基本原理免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)系將抗體或抗原以熒光素標(biāo)記，然后與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡或紫外線照射下，呈現(xiàn)熒光的一種特異性免疫熒光檢測方法。該技術(shù)結(jié)合了免疫反應(yīng)的特異性和在黑色背景中發(fā)光物質(zhì)易被發(fā)現(xiàn)的敏感性優(yōu)點，因而能準(zhǔn)確檢測少量的抗原或抗體成分在組織細(xì)胞內(nèi)的定位分布。第二十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日

二、免疫熒光技術(shù)的條件（一）熒光素

當(dāng)某些物質(zhì)經(jīng)光線的照射，特別是經(jīng)短波長的光線(能量強)照射后，該物質(zhì)原子的電子層中的電子吸收光能，由低能級的電子層躍遷到高能級的電子層，或躍遷到同一電子層的高能帶，稱為能級躍遷。處于高能級狀態(tài)的電子極不穩(wěn)定（激發(fā)態(tài)），經(jīng)過約10-8秒后，以輻射光量子的形式釋放所吸收的能量，而回到原來的能級狀態(tài)（基態(tài)）。這種輻射出的能量即熒光。引起熒光最有效的光是激光、紫外光和藍(lán)紫光。根據(jù)不同熒光素的標(biāo)本，可產(chǎn)生紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫色的熒光。第二十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日

熒光素是一種染料，可以吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。一定的熒光素可以與組織或細(xì)胞的某些成分（如染色體）中的分子或功能基團(tuán)進(jìn)行特異性結(jié)合，呈現(xiàn)一定顏色的熒光。熒光顯微鏡就是利用組織和細(xì)胞與熒光素特異性結(jié)合的特性，通過激發(fā)濾光片產(chǎn)生一定波長的激發(fā)光源，照射結(jié)合在組織和細(xì)胞中的熒光素產(chǎn)生激光，再通過阻斷濾光片觀察所產(chǎn)生的熒光。即可觀察組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)某些成分含量的變化，并探討細(xì)胞的功能狀態(tài)。或用某些熒光素標(biāo)記免疫球蛋白，進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞學(xué)研究。第二十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的熒光素必須具備有①化學(xué)上的活潑基團(tuán)，易與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合；②能發(fā)射可見的、對視覺敏感的熒光顏色；③熒光效應(yīng)強，性質(zhì)比較穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物的活性。常用于免疫標(biāo)記的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）、四乙基羅丹明（RB200）、二甲基氨基萘-5-磺酸（DANS）、4-乙酰胺-4'-異硫氰基-二苯乙烯-2',2'二磺酸（SITS）呈蘭色熒光、得克薩斯紅、藻紅素R、花青，DANS因熒光迅速猝滅，已很少用。第二十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日（二）熒光標(biāo)記抗體

用于熒光素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，多用特異性抗體或抗原成分，因不同抗原的理化特性差別甚大，不易高效標(biāo)記，遠(yuǎn)較標(biāo)記抗體少。用于標(biāo)記的抗體要求效價高，特異性強，標(biāo)記后活性損失小。雖然單抗的效價高，特異性強，親和力強，但經(jīng)熒光素標(biāo)記后，理論活性僅是標(biāo)記前的50%，故常用標(biāo)記抗鼠免疫球蛋白的方法以彌補單抗標(biāo)記的缺點。

1．FITC標(biāo)記抗體

FITC為黃橙色或黃褐色粉末或結(jié)晶，分子量389.4，性質(zhì)穩(wěn)定，室溫可保存2年以上，低溫可保存多年，易溶于水和乙醇。最大吸收光譜490～495nm，最大發(fā)射光譜520～530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光。第二十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與IgG的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結(jié)合成為標(biāo)記熒光素的IgG熒光抗體。一個IgG分子最多可以標(biāo)記15~20個FITC分子。

2．TRITC標(biāo)記抗體

TRITC為紫紅色粉末，分子量580，較穩(wěn)定。最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰。與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同F(xiàn)ITC相似。TRITC亦分無定型和結(jié)晶型兩種，前者與蛋白質(zhì)以20~40μg/mg為宜，后者則為12.5μg/mg。第二十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日

3．RB200標(biāo)記抗體

RB200為褐紅色粉末，分子量580，不溶于水，易溶于乙醇或丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，室溫下可長期保存。最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595~600nm，呈現(xiàn)明亮橙紅色熒光。RB200在PCl5作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl），在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸-氨基反應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。

（三）熒光抗體的貯存合格的熒光抗體，加0.1%硫柳汞防腐。小劑量分裝于安瓶內(nèi)熔封后，4℃保存1年，-20℃保存2年，冷凍真空干燥成干粉后熔封，4℃保存5年效果尚好。

第二十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日三、免疫熒光技術(shù)的分類：據(jù)標(biāo)記的抗體和抗原不同分為熒光抗體法和熒光抗原法，以熒光抗體法較為常用。據(jù)標(biāo)記的抗體不同又分為直接法和間接法

1．直接法用熒光素直接標(biāo)記已知的特異性第一抗體（或抗原），檢測相應(yīng)的待測抗原（或抗體），本法簡便、快速、特異性強，但敏感性差。第二十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日第三十頁，共八十七頁，2022年，8月28日2．間接法間接法不需直接標(biāo)記特異抗體(一抗），而是標(biāo)記第二或第三抗體。

（1）夾心法：先用特異性抗原與組織內(nèi)的抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在組織內(nèi)抗體上的抗原結(jié)合，抗原夾在組織抗體與熒光抗體之間，故稱為夾心法。（2）檢測抗體法：用已知抗原的組織切片，加上待測血清，其中的特異性抗體與切片中的已知抗原結(jié)合，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必須用抗人IgG熒光抗體）。在熒光顯微鏡下就可以第三十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日見到抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是常規(guī)檢測血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。（3）檢測抗原法：先用特異性抗體與標(biāo)本中的待測抗原反應(yīng)，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（二抗）與結(jié)合在抗原上的一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體復(fù)合物。本法只需要制備一種種屬間熒光抗體，不但簡便快速，而且特異性強、敏感性高。第三十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日第三十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日3．補體法（1）直接檢測組織內(nèi)免疫復(fù)合物：用抗補體C3等熒光抗體直接作用于組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，形成抗原-抗體-補體-抗補體熒光抗體復(fù)合物，在抗原-抗體-補體復(fù)合物存在的部位呈現(xiàn)特異性熒光。（2）間接檢測組織內(nèi)抗原：將新鮮補體與一抗混合，同時加在抗原標(biāo)本上，37℃孵育后如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原-抗體-補體-熒光抗體復(fù)合物。第三十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日利用補體反應(yīng)，通過形成抗原-抗體-補體復(fù)合物發(fā)射熒光第三十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日

四、常用熒光染色方法1．直接法

(1）向切片滴加最佳效價的熒光標(biāo)記一抗，室溫或37℃避光作用30min；（2）傾去殘留的熒光一抗，浸入PBS(pH7.2~7.4)，電磁振動，洗滌5min×2次；（3）蒸餾水洗滌1min除去鹽結(jié)晶；（4）用50%緩沖甘油封固（0.5mol/L碳酸緩沖液，pH9.0~9.5），熒光顯微鏡觀察。（5）對照實驗：1）抗體對照：用正常血清代替熒光抗體血清，如上述方法處理，結(jié)果應(yīng)為陰性；

2）抗原對照：類屬抗原染色，結(jié)果應(yīng)為陽性；第三十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日

2．間接法（1）向切片滴加最佳效價的一抗，室溫或37℃避光作用30min；（2）傾去殘留的一抗，用0.1mol/LPBS（pH7.2）洗滌10min×2次，吸去殘留液體；（3）滴加間接熒光抗體，室溫或37℃避光作用30min，PBS振動洗滌10min×2次；（4）50%緩沖甘油封固（0.5mol/L碳酸緩沖液，pH9.0~9.5），熒光顯微鏡觀察。（5）對照實驗：1）抗體對照：用正常血清代替一抗血清，如上述方法處理，結(jié)果應(yīng)為陰性；2）陽性對照：用陽性對照切片染色，如上述方法處理，結(jié)果應(yīng)為陽性。第三十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日

3．補體法（1）將固定切片（涂片）0.1mol/LPBS（pH7.2）洗滌3min，吹干至表面無水分；（2）滴加最佳效價免疫血清和補體的等量混合液，室溫或37℃避光作用30min；（3）用0.1mol/LPBS（pH7.2）洗5min×2次，攪拌或振動，吸干標(biāo)本周圍液體；（4）滴加最佳效價的抗補體熒光抗體，37℃避光作用30min，水洗同（3）；（5）蒸餾水洗滌1min，50%緩沖甘油封固，熒光顯微鏡觀察。（6）對照實驗：按間接法對照進(jìn)行。第三十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日

五、免疫熒光染色的注意事項

1．載（蓋）玻片載玻片必須光滑均勻，無自發(fā)熒光，厚度以0.8~1.2mm為宜，蓋玻片以0.17mm為宜。

2．組織切片不宜太厚，以免激發(fā)光消耗過多和細(xì)胞重疊影響觀察，通常5~10m。

3．封片劑必須無自發(fā)熒光，無色透明。通常用甘油。

4．熒光觀察暗室中觀察，每次1~2h為宜。熒光強度分四級，“--”無或微弱自發(fā)熒光，“+”明確可見的熒光，“++”明亮的熒光，“+++”耀眼的熒光。采用高速感光膠片（ASA200）攝影，或采用分光光度計、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡和圖象分析儀觀察、記錄、分析。第三十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日

六、非特異性染色的消除方法

1．非特異性染色的主要因素（1）部分熒光素未與蛋白結(jié)合而形成聚合物或衍化物，不能被透析除去而著色。（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，與組織成分非特異結(jié)合。（3）除待檢抗原外，組織中可能存在類屬抗原（如Forssman抗原），可能與組織中特異性抗原以外的相應(yīng)抗體結(jié)合。（4）所制備的免疫血清混雜一些抗其他組織成分的抗體，混淆不清。（5）熒光素分子太多，過量標(biāo)記的抗體分子帶有過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色，熒光素不純、標(biāo)本固定不當(dāng)也可出現(xiàn)非特異性染色。第四十頁，共八十七頁，2022年，8月28日

2．非特異性染色的消除方法

根據(jù)非特異性染色的原因，通常采用下列方法：（1）動物臟器粉末吸收法：常用豬或鼠肝粉或骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加肝粉50~100mg，混允，室溫振動2h，4℃過夜，再攪拌10min，3000~15000rpm高速離心30min，1~2次，即可使用其上清液。一般在臨用前進(jìn)行，吸收后熒光抗體低溫保存不要超過2周。（2）透析法：熒光素（如FITC）可以透過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，因此，透析法可以將未與抗體蛋白質(zhì)分子結(jié)合的熒光素除去。

第四十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日（3）伊文藍(lán)（Evanblue）襯染法：用含0.01%伊文藍(lán)的0.01mol/L（pH7.2）PBS溶液稀釋熒光抗體，可將背景組織染成紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明對比，減少非特異性熒光，宜常規(guī)使用。伊文藍(lán)配成1%溶液，4℃保存，用前稀釋至0.01%以稀釋抗體。（4）其他：葡聚糖凝膠G-25或G-50層析法和DEAE纖維素柱層析法、熒光抗體稀釋法、純化抗原和純化抗體法、胰蛋白酶消化組織切片法、牛血清蛋白封閉法等。第四十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)免疫酶標(biāo)組織化學(xué)技術(shù)免疫酶標(biāo)記技術(shù)是在免疫熒光技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，當(dāng)抗原與抗體在組織或細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合后，借助酶對相應(yīng)底物的特異催化作用，生成有色不溶性產(chǎn)物（或高電子密度顆粒），在光鏡（或電鏡）下進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位、定性和定量檢測。第四十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日一、標(biāo)本制備基本原則是保持組織內(nèi)抗原物質(zhì)的不動性和免疫活性。1．AMEX（acetonemethenzoatexylene）即改良冷凍置換法（freezesubstitution）的簡稱，主要用于石蠟包埋的標(biāo)本，具有同新鮮未固定組織冷凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結(jié)構(gòu)保存性。其機制為：組織在丙酮中固定（脫水），細(xì)胞內(nèi)水分逐漸被丙酮取代，繼而用苯甲酸酯取代丙酮，經(jīng)二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內(nèi)過夜亦形成冰晶，所以將組織先置4℃丙酮20~30min，再移入-20℃丙酮過夜，也可以在4℃丙酮內(nèi)過夜，效果基本相同。第四十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日2．微波固定能保持良好的組織結(jié)構(gòu)和抗原性，適用于各種切片固定。其機理可能與微波的頻率具有被水分吸收的性質(zhì)（通常所用微波頻率2450MHz）有關(guān)。生物材料含有大量水分，照射后分子運動加快，溫度升高，促進(jìn)固定液向組織內(nèi)滲透，加速與組織成分的反應(yīng)，短時間內(nèi)可達(dá)到固定的效果。經(jīng)微波照射固定的組織，需置于相同固定液中，室溫下后固定2~6h。通常為固定液5~10ml，照射10~30s，照射后固定液的溫度≤50℃。具體方法：將標(biāo)本置于微波爐轉(zhuǎn)臺中央，周圍放一燒杯盛300~500ml純水，以吸收照射時微波爐產(chǎn)生的熱量，選擇強檔照射10~30s。3．切片冷凍切片和石蠟切片，各有優(yōu)缺點，根據(jù)具體情況選擇第四十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日

二、染色方法（一）酶標(biāo)抗體染色方法

1．標(biāo)記酶理論上講，用于組織化學(xué)方法顯示的酶均可用于標(biāo)記抗體，但實際上能用于標(biāo)記抗體的酶只有少數(shù)幾種：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP），分子量40kD；堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP），分子量80kD；葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD），分子量180kD。理想的酶首先必須具有催化底物的特異性和反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，同時應(yīng)具有分子量小、可溶性好、光密度高、偶聯(lián)方法簡便，與抗體偶聯(lián)后仍保持酶的活性，與底物作用后容易顯色，而且不易退色等特性。第四十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日

HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根內(nèi)含量最多而得名，系無色的酶蛋白與深棕色的鐵卟啉結(jié)合組成的糖蛋白，糖占16～18%（8條糖鏈分布在HRP分子表面），最適pH=5～5.5，最適溫度40～45℃。pH4～11、50℃以下較穩(wěn)定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含有鐵卟啉輔基，最大吸收光譜403nm。目前認(rèn)為，HRP是一種比較理想的標(biāo)記酶，但生物體內(nèi)某些組織和細(xì)胞（如退化變性壞死組織，紅細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等）內(nèi)也有內(nèi)源性HRP，因此，標(biāo)記切片中可出現(xiàn)非特異性著色，影響對結(jié)果的判斷分析。然而，正常哺乳動物的組織中（或心臟經(jīng)灌注后）不含HRP，不出現(xiàn)非特異性染色，故標(biāo)記切片背景清晰。第四十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日2．酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體與熒光素標(biāo)記抗體不同，需要借助偶聯(lián)劑將酶連接在抗體分子上。偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，必須具備3個基本特征：與抗體和酶之間必須是不可逆共價鍵結(jié)合；不能影響酶和抗體的活性；不能因偶聯(lián)劑的加入，使酶標(biāo)抗體與組織成分發(fā)生特異性結(jié)合。HRP標(biāo)記抗體的常用偶聯(lián)劑有戊二醛、對萘醌、過碘酸鈉和Maleimide等。第四十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日3．基本原理根據(jù)酶標(biāo)抗體的不同，分為直接免疫酶標(biāo)法和間接免疫酶標(biāo)法。（1）直接免疫酶標(biāo)法（directimmunoperoxidasemethod）：是通過HRP直接標(biāo)記的第一抗體與抗原結(jié)合，形成酶標(biāo)免疫復(fù)合物而顯色。本法簡便，但每種抗體均需與HRP偶聯(lián)，而偶聯(lián)過程會降低抗體的效價，故不及直接免疫熒光法簡便，已很少應(yīng)用第四十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日組織抗原第一抗體過氧化物酶直接法（一）直接法原理：HRP標(biāo)記在特異性抗體（第一抗體）上，抗原---抗體●HRP復(fù)合物第五十頁，共八十七頁，2022年，8月28日步驟：一步完成優(yōu)點：簡便、省時特異性強，非特異染色輕缺點：敏感性差一種標(biāo)記抗體只能檢測一種抗原第五十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日（2）間接免疫酶標(biāo)法：是用HRP標(biāo)記二抗，有抗原放大作用，較直接標(biāo)記法敏感。當(dāng)特異性一抗（多數(shù)抗血清由兔制得，單克隆抗體由小鼠制備）與抗原形成復(fù)合物后，再加HRP標(biāo)記的二抗，形成抗原-一抗-HRP標(biāo)記二抗復(fù)合物而顯色。由于二抗體實際就是一抗體的抗體，所以，只要不同的一抗來源于同一種屬，與標(biāo)記的二抗結(jié)合就能顯示其不同特異性抗原的存在，避免了直接法標(biāo)記每種一抗的麻煩，而且提高了敏感性。第五十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法（二）間接法原理：HRP標(biāo)記在第二抗體上，抗原---特異性抗體---第二抗體●HRP復(fù)合物第五十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法（二）間接法原理：HRP標(biāo)記在第二抗體上，抗原---特異性抗體---第二抗體●HRP復(fù)合物第五十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日優(yōu)點：較直接法敏感性高

一種標(biāo)記抗體能用于相應(yīng)動物制備的多種特異性抗體，檢測多種抗原缺點：

較直接法費時非特異性染色稍重

步驟：二步法第五十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日優(yōu)點：較直接法敏感性高

一種標(biāo)記抗體能用于相應(yīng)動物制備的多種特異性抗體，檢測多種抗原缺點：

較直接法費時非特異性染色稍重

步驟：二步法第五十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日4．顯色原理（1）HRP標(biāo)記顯色：HRP是最常用的標(biāo)記酶，其顯色原理如下：

HRP+H2O2←→HRP·H2O2+供氫體（電子供體）

HRP+H2O+供氫體（氧化型）HRP的特異性底物為H2O2

，在分解H2O2過程中，與H2O2形成復(fù)合物，無電子供體存在時，反應(yīng)再進(jìn)行，有電子供體存在時則迅速生成水，酶被還原，電子供體被氧化、聚合，再經(jīng)氧化環(huán)化后形成吲哚胺多聚體。紅外光分析表明，這一多聚體進(jìn)一步氧化環(huán)化形成苯乙阱聚合體，在酶反應(yīng)部位形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。第五十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日第五十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異性的（催化底物H2O2），其余反應(yīng)無特異性，可以用不同的電子供體，因此最終產(chǎn)物的顏色也不同，如4-氯-1-萘酚（CN）呈藍(lán)黑色、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）呈深藍(lán)色、3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）呈紅色、3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）呈棕色。AEC室溫下穩(wěn)定，但不能進(jìn)行脫水等處理，時間長易褪色。DAB是目前廣泛應(yīng)用的電子供體之一，較為敏感，切片可以脫水透明處理，而且終產(chǎn)物具有嗜鋨性，經(jīng)四氧化鋨處理后電子密度增加，適用于電鏡下確定抗原的存在。但是，DAB可能具有致癌性，應(yīng)盡量減少吸入和接觸，最好將DAB制成10倍儲存液，分裝于-20℃保存，臨用時稀釋、過濾。CN較DAB敏感性略差，但其終產(chǎn)物較為局限，很少彌散，適于光鏡觀察第五十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日第六十頁，共八十七頁，2022年，8月28日（2）ALP標(biāo)記顯色：ALP標(biāo)記抗體主要用于內(nèi)源性過氧化物酶較高的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫組化顯色。ALP以AS-Mx為底物，F(xiàn)B/FR為顯色劑，生成藍(lán)色/紅色不溶性沉淀。顯色液內(nèi)加入終濃度為2~4mmol/L的左旋咪唑（levamisole），大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑以每毫升60~120mmol/L濃度的儲存液-20℃保存，應(yīng)用時稀釋30倍。為避免反復(fù)稱取和試劑吸水，萘酚AS-Mx、FR和FB均應(yīng)小量分裝后-20℃保存。第六十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日第六十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日（二）非酶標(biāo)記抗體染色法由于酶標(biāo)抗體法中酶與抗體之間的共價鍵結(jié)合能損害部分抗體和酶的活性，抗血清中的非特異性抗體被酶標(biāo)記后，與組織結(jié)合可導(dǎo)致背景染色等。1969年Masson建立了非酶標(biāo)橋抗體法（bridgeantibodymethod），1970年Sternberger創(chuàng)建了辣根過氧化物酶-抗辣根過氧化物酶法（peroxidaseanti-peroxidasemethod，PAP）。第六十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日1．橋抗體法首先制備高效價的特異性抗酶（HRP）抗體（三抗），然后利用二抗作為“橋梁”，將抗酶抗體連接在與組織待測抗原結(jié)合的一抗上，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)顯色后顯示抗原的存在。具有二次放大作用，比間接法更為敏感，但操作步驟復(fù)雜。制備三抗和二抗的動物必須與一抗為同一種動物，以保證其相互結(jié)合。二抗的一個Fab片斷與一抗的Fc段結(jié)合，另一個Fab片斷與三抗的Fc段結(jié)合，二抗作為連接一抗和三抗的“橋梁”，故稱為橋抗體。當(dāng)三抗與二抗結(jié)合后，再加HRP，此時HRP即可與三抗自然結(jié)合，從而形成一個復(fù)雜的抗原-一抗-二抗-三抗-HRP復(fù)合物而顯色第六十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體第三抗體（抗酶抗體）HRP二、酶橋法原理：HRP標(biāo)記在抗酶抗體（三抗）上，抗原---特異性抗體---第二抗體---第三抗體●HRP復(fù)合物一抗、三抗有何關(guān)系？第六十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日優(yōu)點：與酶標(biāo)記抗體法相比，敏感性高（酶與三抗通過抗原-抗體反應(yīng)結(jié)合，避免直接標(biāo)記引起兩者活性降低）缺點：

較費時

步驟：四步法第六十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日2．PAP法用PAP復(fù)合物作為酶標(biāo)顯色手段。PAP是一種可溶性酶-抗酶血清復(fù)合物，可作為特異性顯色基團(tuán)。PAP法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，是目前免疫組織化學(xué)染色常用的方法（圖）。PAP法比間接熒光法靈敏，所用第一抗體的濃度可低于間接熒光法10倍，也可用其它酶代替HRP與相應(yīng)的抗體組成復(fù)合物，如ALP-抗ALP等。原理：抗原---特異性抗體---第二抗體(橋抗體)---PAP復(fù)合物第六十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRPPAP法（過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法）原理：與酶橋法相似，不同之處是將酶與三抗制備成PAP復(fù)合物?？乖?--特異性抗體---第二抗體（橋抗）---PAP復(fù)合物第六十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日優(yōu)點：敏感性較高背景染色較輕局限：特異性抗體與PAP必須為同一種屬動物

步驟：三步法第六十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日PAP復(fù)合物是HRP的抗體和HRP結(jié)合而生成的一種復(fù)合物。每個PAP復(fù)合物由2個抗HRP的IgG分子及3個HRP分子組成。PAP法也需用三抗。首先用特異的第一抗體（多為兔或小鼠IgG）孵育組織切片，其次用抗第一抗體（IgG）的抗體即二抗（如羊抗兔IgG或驢抗小鼠IgG）作為“橋梁”，然后用PAP復(fù)合物與二抗結(jié)合。二抗（橋抗）IgG分子有兩個Fab段，一個與一抗結(jié)合，另一個與PAP復(fù)合物結(jié)合。最后，用HRP的底物來顯示PAP復(fù)合物。有若干種底物可供選擇，不同底物可以產(chǎn)生不同的顏色反應(yīng)。第七十頁，共八十七頁，2022年，8月28日三、結(jié)果判斷在科研工作中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可進(jìn)行定性及定量分析。應(yīng)熟悉所用的實驗方法、抗體的優(yōu)點和局限性，嚴(yán)格操作步驟，控制控制條件，避免主觀意識，進(jìn)行客觀判斷，認(rèn)真地分析。需要強調(diào)的是，最好將對照組及實驗組的切片貼在同一張載片上或?qū)⑶衅谙嗤臈l件下同時孵育，盡可能保證處理條件一致，使結(jié)果具有可比性。第七十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日（一）對照實驗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時，必須證實組織內(nèi)顯示的有色產(chǎn)物確實是抗原與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合所產(chǎn)生的。如前所述，影響免疫組織化學(xué)染色過程的因素很多，必須要有嚴(yán)格的對照才能對染色結(jié)果作出正確的評價。常用的實驗對照有：

1．陽性對照用已知含靶抗原的組織切片（最好是冷凍切片）與待檢標(biāo)本同樣處理，染色結(jié)果應(yīng)為陽性，稱陽性對照。通過陽性對照可證明靶抗原有活性，抗體特異性高，染色過程中各個步驟以及所使用的試劑合乎標(biāo)準(zhǔn)，染色方法可靠。第七十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日尤其當(dāng)待檢標(biāo)本為陰性時，陽性對照切片呈陽性反應(yīng)可排除待檢標(biāo)本假陰性的可能。所以，若預(yù)期染色結(jié)果為陰性時，必須設(shè)陽性對照。若陽性對照亦不顯色，說明抗原保存、染色方法和抗體效價等某一方面存在問題。目前，各試劑公司對不同的試劑盒都有陽性對照。

2．陰性對照用已知不存在相應(yīng)靶抗原的組織標(biāo)本染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。陰性對照可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的假陽性結(jié)果。當(dāng)待測標(biāo)本為陽性結(jié)果時，陰性對照更為重要。陰性對照包括以下幾種：第七十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日（1）空白對照：用緩沖液替代一抗是最常用的空白對照，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說明染色方法可靠、一抗特異性強。實驗中應(yīng)常規(guī)設(shè)立空白對照。（2）替代對照：用制備第一抗體相同動物的免疫前血清或相同種屬動物的正常血清替代第一抗體，染色結(jié)果應(yīng)為陰性。這可證明待檢組織切片的陽性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是該抗體與組織內(nèi)靶抗原特異性反應(yīng)的結(jié)果。第七十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日（3）自身對照：用同一組織切片上與靶抗原無關(guān)的其它抗體的染色作對照，應(yīng)為陰性。陽性與陰性結(jié)構(gòu)同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應(yīng)的特異性對照。如無關(guān)抗體在相同部位出現(xiàn)類似的陽性結(jié)果，多為非特異性著色。（4）吸收試驗：先將過量的已知抗原與對應(yīng)的抗體混合孵育，兩者形成特異性結(jié)合，再用結(jié)合后的混合物孵育切片，染色結(jié)果應(yīng)為陰性。若染色結(jié)果仍為陽性，則為非特異性染色。此法可證明待檢組織切片的陽性結(jié)果是該抗體與組織內(nèi)靶抗原特異性反應(yīng)的結(jié)果。但此法操作步驟繁瑣，抗原和抗體的用量較大，價格昂貴。第七十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日（二）非特異性染色非特異性染色的來源主要有以下幾個方面：1．組織細(xì)胞內(nèi)色素與DAB沉淀物顏色類似的色素，如黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)黑色素容易混淆，可用其他電子供體或免疫熒光技術(shù)鑒別，也可用ALP代替HRP進(jìn)行染色。2．類過氧化物酶紅細(xì)胞內(nèi)的血紅素輔基有類過氧化物酶活性，如組織內(nèi)存在紅細(xì)胞，即使不加過氧化物酶也可出現(xiàn)陽性著色。用甲醇-0.3%H2O2混合液孵育30min，或直接用3%H2O2溶液孵育30min，可以抑制這種假陽性著色。甲醇能使血紅素中的亞鐵血紅素游離，后者被H2O2破壞，從而抑制類過氧化物酶的活性。

第七十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日3．內(nèi)源性過氧化物酶主要存在于粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和固定效果較差的膠質(zhì)細(xì)胞，能與DAB-H2O2反應(yīng)出現(xiàn)假陽性。所以，富含此類細(xì)胞的脾、肝、骨髓等組織染色時最好先阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，可用甲醇-H2O2封閉4．游離醛基醛類固定的組織切片可能存在游離醛基，后者能與蛋白質(zhì)（IgG）非特異性結(jié)合導(dǎo)致假陽性。用白蛋白或封閉性阻斷血清預(yù)先孵育切片，可將其抑制。5．疏水鍵和離子鍵免疫球蛋白可通過疏水鍵和離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體非特異性結(jié)合，用正常血清封閉非特異結(jié)合位點即可消除非特異性著色.第七十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日6．天然抗體和不純抗體天然抗體指因動物自然感染等因素血清中存在的部分抗體，不純抗體是在制備抗體血清時所用的抗原不純而獲得的抗體含有雜質(zhì)抗體，與組織成分結(jié)合可出現(xiàn)非特異性著色。除去的方法是盡可能高地稀釋抗體，以減低非特異抗體的濃度。7．載體蛋白制備分子量小于4kD的小分子多肽抗體時，需要借助載體蛋白使小分子多肽獲得免疫原性。但載體本身也具有抗原性，因此動