基因工程第二章DNA重組技術(shù)課件

*1第二章DNA重組技術(shù)*1第二章DNA重組技術(shù)*2主要內(nèi)容DNA的結(jié)構(gòu)天然DNA的制備限制性核酸內(nèi)切酶對DNA的切割.PCR擴(kuò)增特定DNA片段凝膠電泳檢測DNADNA片段的連接重組*2主要內(nèi)容DNA的結(jié)構(gòu)*3第一節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA組成Nucleicacidispolynucleotide,

NucleotidesarethebuildingblocksofNucleicAcidDNA.首尾*3第一節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA組成首尾*4Pentose

five-carbonsugar

2-Deoxyribose2｀－脫氧核糖1、核苷酸Phosphate、pentose、base(堿基)Hydroxylgroup羥基Hydrogen氫*4Pentose

five-carbonsugar2*5Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶CGuanine鳥嘌呤

GAdenine腺嘌呤AFourBasesinDNAPyrimidines嘧啶Purines嘌呤*5Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶C*6H2O堿基五碳糖核苷鍵核苷602*6H2O堿基五碳糖核苷鍵核苷602*7H2OH2ObasePhosphatePentose核苷鍵Phosphateesterbond核苷酸NucleotideGlycosidicbond*7H2OH2ObasePhosphatePentose核苷*88種核苷酸

M-單(D-二。T－三）；P-磷酸RNA的名稱為某（單、二、三）苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷—磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷—磷酸（脫氧腺苷酸）。稀有核苷酸與上類似；腺嘌呤A鳥嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNAAMPGMPCMPUMP未發(fā)現(xiàn)DNAdAMPdGMPdCMP未發(fā)現(xiàn)dTMP*88種核苷酸M-單(D-二。T－三）；P-磷酸腺嘌呤*92、DNADNA中核苷酸通過3’,5’-磷酸二脂鍵連接*92、DNADNA中核苷酸通過3’,5’-磷酸二脂*10headtail脫H2O脂鍵相連3`5`3`，5`-磷酸二酯鍵3’,5’-phosphodiesterbond*10headtail脫H2O3`5`3`，5`-磷酸二酯鍵*11二、DNAstructure*11二、DNAstructure*121、B型DNA雙螺旋MostDNAhavedoublehelixstructure(1).兩條鏈反向、平行、右手螺旋有大溝和小溝5`3`5`3`*121、B型DNA雙螺旋MostDNAhave*13(2).磷酸、戊糖在外側(cè)，堿基在內(nèi)，鏈間堿基形成氫鍵。*13(2).磷酸、戊糖在外側(cè)，堿基在內(nèi)，鏈間堿基形成氫鍵。*14（3）.兩堿基對間距0.34nm,螺距3.4nm.*14（3）.兩堿基對間距0.34nm,螺距3.4nm*15經(jīng)常用堿基對數(shù)來表示DNA長度(4).堿基互補(bǔ)配對原則：A=TC=G*15經(jīng)常用堿基對數(shù)來表示DNA長度(4).堿基互補(bǔ)配對原則*162、DNA序列在DNA中，兩鏈間的堿基是互補(bǔ)的知道其中一條鏈的序列后，另一鏈也可推測出來。因此DNA序列一般只用其中一鏈序列由5`向3`書寫5`TCTC3`3`AGAG5`5`TCTC3`*162、DNA序列在DNA中，兩鏈間的堿基是互補(bǔ)的5`*173、DNA變性DNA變性：DNA雙鏈打開變異無規(guī)則的單鏈的過程。粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加.變性因素：加熱,改變?nèi)芤簆H、加有機(jī)試劑*173、DNA變性DNA變性：DNA雙鏈打開變異無規(guī)則*18。計(jì)算公式：

（G+C)%=(Tm-63.0)×2.44解鏈溫度（Tm）使50%DNA變性的溫度.經(jīng)常在70-85C間，隨G/C含量的升高而升高.*18。計(jì)算公式：解鏈溫度（Tm）*194、DNA復(fù)性變性因素去除后，變性DNA又恢復(fù)成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。溫度下降過快，DNA不能復(fù)性。變性復(fù)性*194、DNA復(fù)性變性因素去除后，變性DNA又恢復(fù)成雙螺旋*205分子雜交具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈過程叫核酸分子雜交只要有一定程度的互補(bǔ)順序就可以形成雜交雙鏈。*205分子雜交具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中*21DNA與DNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*21DNA與DNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*22DNA與RNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*22DNA與RNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*236DNA的形狀線性DNA：真核生物的染色體ＤＮＡ部分原核生物染色體ＤＮＡ部分病毒ＤＮＡ．*236DNA的形狀線性DNA：*24環(huán)狀ＤＮＡ真核生物線粒體ＤＮＡ葉綠體ＤＮＡ部分原核生物染色體ＤＮＡ質(zhì)粒ＤＮＡ部分病毒ＤＮＡ．*24環(huán)狀ＤＮＡ*25chloroplastmitochondriaThecircularDNAcanbesupercoiled環(huán)狀DNA以超螺旋形式存在環(huán)狀DNA*25chloroplastmitochondriaThe*26。*26。*27負(fù)超螺旋：形成超螺旋時(shí)，旋轉(zhuǎn)方向與DNA雙螺旋方向相反，旋轉(zhuǎn)結(jié)果使DNA分子內(nèi)部張力減小，稱為松旋效應(yīng)。在自然條件下共價(jià)封閉環(huán)狀DNA呈負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋：與負(fù)超螺旋相反，形成超螺旋時(shí)的旋轉(zhuǎn)方向與DNA雙螺旋方向相同，結(jié)果加大了DNA分子內(nèi)部張力，有緊旋效應(yīng)。*27負(fù)超螺旋：形成超螺旋時(shí)，旋轉(zhuǎn)方向與DNA雙螺旋方向相反*287DNA的復(fù)制半保留復(fù)制（原核、真核）Semiconservationreplication*287DNA的復(fù)制半保留復(fù)制（原核、真核）*29親代DNA分子第一子代分子親代DNA分子第一子代分子*29親代DNA分子第一子代分子親代DNA分子第一子代分子*30DNA復(fù)制過程復(fù)制起始位點(diǎn)雙鏈打開引物酶合成RNA引物，DNA聚合酶延長引物.前導(dǎo)鏈連續(xù)延伸,滯后鏈通過岡奇片段以不連續(xù)方式延伸。在新合成的DNA鏈中將RNA引物剪去，以DNA替代通過DNA連接酶將切口封閉。*30DNA復(fù)制過程*31BubblesBubbles復(fù)制泡:細(xì)菌、病毒、線粒體：單復(fù)制子真核：多個(gè)復(fù)制子，雙向等速復(fù)制*31BubblesBubbles復(fù)制泡:*32*32*338DNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的過程：起始（啟動子），延長，終止轉(zhuǎn)錄后的加工：剪切，拼接及修飾.*338DNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的過程：起始（啟動子），延長，終*34(1)啟動子：DNA上RNA聚合酶識別、結(jié)合和促使轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列Inpromoterregions,thereisa–10regionwhichsequenceis“TATAAT”andiscalled“pribnowbox”or“TATAbox”.Thereisa–35regionwhichsequenceis“TTGACA”.Thesequencesofthetworegionsareveryconservative.*34(1)啟動子：Inpromoterregions*35promoter基因編碼區(qū)5'|-35||10|AAUGUGA|T|3'

TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1

轉(zhuǎn)錄區(qū)terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden*35promoter*36(2)轉(zhuǎn)錄區(qū)promoter基因編碼區(qū)5'----|-35||10|--AAUGUGA|T|--3'

TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1轉(zhuǎn)錄區(qū)terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden*36(2)轉(zhuǎn)錄區(qū)promoter*37轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（起錄點(diǎn)）:轉(zhuǎn)錄在特定的位點(diǎn)開始,經(jīng)常發(fā)生在A上.SD序列在起錄點(diǎn)下游有：AGGAGG序列，對應(yīng)的mRNA序列也是AGGAGG，可與核糖體中的rRNA序列TCCTCC互補(bǔ)結(jié)合，起始翻譯。*37轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（起錄點(diǎn)）:*38基因編碼區(qū):從起始密碼子到終止密碼子間，含有遺傳信息的的DNA序列。原核生物一個(gè)啟動子和一個(gè)終止子間有多個(gè)基因編碼區(qū)，每個(gè)基因編碼區(qū)均有各自的起始密碼子和終止密碼子。真核生物只有一個(gè)基因編碼區(qū)。promoter基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)5'|-35||10|--AAUGUGAAUGUGA|T|3'

TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1Transcriptionregionterminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodestopcode間隔區(qū)*38基因編碼區(qū):promoter*39終止子：terminationsequenceDNA模板上的終止信號是由于DNA特殊的結(jié)構(gòu)而起作用，此處DNA多存在著反向重復(fù)順序。此區(qū)域容易形成發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，有助于轉(zhuǎn)錄的終止。*39終止子：terminationsequence*40RNApolymerase中的δ

亞基識別啟動子區(qū)，并使RNA聚合酶結(jié)合.DNA在起始位點(diǎn)解旋成單鏈RNApolymerase開始轉(zhuǎn)錄.δ亞基脫離，RNA開始延長.RNA延長并從DNA中脫離在終止子處終止.（3）轉(zhuǎn)錄的過程*40RNApolymerase中的δ亞基識別啟動子*41終止子*41終止子*42轉(zhuǎn)錄后的RNA加工真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的初級產(chǎn)物需經(jīng)過”加帽

“”加尾”“剪切”“拼接”等一系列變化才能生成具有生物活性的RNA分子。這一過程稱為轉(zhuǎn)錄后的RNA加工(RNAprocessing)。*42轉(zhuǎn)錄后的RNA加工真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的初級產(chǎn)物需經(jīng)過”*435`加帽子3`加尾巴粗品RNA剪切拼接*435`加帽子3`加尾巴粗品RNA剪切拼接*448翻譯以mRNA為模板，按照mRNA分子上的三個(gè)核苷酸決定一種氨基酸的規(guī)則（三聯(lián)體密碼）合成具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)稱為翻譯。*448翻譯以mRNA為模板，按照mRNA分子上的三個(gè)核苷*45一、天然DNA的來源與用途來源：從不同生物的不同部位分離染色體DNA(ChromosomeDNA)病毒DNA(VirusDNA)質(zhì)粒DNA(PlasmidDNA)線粒體DNA(Mitochondria

DNA)葉綠體DNA(Chloroplast

DNA)第二節(jié)天然DNA的提取*45一、天然DNA的來源與用途第二節(jié)天然DNA的提取*46染色體DNA特征:

巨大,含有大量遺傳信息(geneticinformation).用途:

分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子*46染色體DNA特征:巨大,含有大量遺傳信息(gen*47VirusDNA可在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,可體外包裝.可用作轉(zhuǎn)基因載體或分離目的基因.頭部尾部尾絲-頭部尾部尾絲VirusDNA*47VirusDNA可在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,可體外包裝.頭部*48

環(huán)狀，游離與細(xì)胞質(zhì)中，可自我復(fù)制。1~幾百kb主要用作基因克隆載體，也可分離目的基因。質(zhì)粒DNAPlasmidDNA*48環(huán)狀，游離與細(xì)胞質(zhì)中，可自我復(fù)制。1~幾百kb質(zhì)粒D*49真核生物(eukaryote)有,基因與呼吸作用和光合作用相關(guān).用途:分離目的基因或作載體.線粒體DNA和葉綠體DNA真核生物(eukaryote)有,基因與呼吸作用和光合作用相關(guān).用途:分離目的基因或作載體.線粒體DNA和葉綠體DNA*49真核生物(eukaryote)有,基因與呼吸作用和光*50二、天然DNA的提取*50二、天然DNA的提取*511、準(zhǔn)備生物材料1、準(zhǔn)備生物材料選用DNA最易提取，含量最多的組織。大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。植物選用幼嫩植株，暗培養(yǎng)1-2天或黃化苗。*511、準(zhǔn)備生物材料1、準(zhǔn)備生物材料選用DNA最易提取*52方法:細(xì)菌(Bacteria)：用溶菌酶(lysozyme)處理,NaOH和SDS處理超聲波(ultrasonic)處理動植物:粉碎、搗碎、研磨2、裂解細(xì)胞-KeystepofDNAextraction*52方法:2、裂解細(xì)胞-Keystepof*53提取總DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚/氯仿/異戊醇等有機(jī)溶劑，分除蛋白質(zhì)，在含DNA水相加入乙醇或異丙醇使其沉淀，離心獲得DNA。提取線粒體DNA或葉綠體DNA：先分離完成細(xì)胞器，加DNase去除其他DNA，再提。提質(zhì)粒DNA：先調(diào)pH值至12.6，再調(diào)至中性，使質(zhì)粒復(fù)性后從沉淀中釋放出來。3、分離與抽提提取總DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚/氯仿/異戊醇等有機(jī)溶劑，分除蛋白質(zhì)，在含DNA水相加入乙醇或異丙醇使其沉淀，離心獲得DNA。提取線粒體DNA或葉綠體DNA：先分離完成細(xì)胞器，加DNase去除其他DNA，再提。提質(zhì)粒DNA：先調(diào)pH值至12.6，再調(diào)至中性，使質(zhì)粒復(fù)性后從沉淀中釋放出來。3、分離與抽提*53提取總DNA(Extractionoftotal*54大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.1、細(xì)菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基（Culturemedium）:LB,含有抗生素（bacteriophage）培養(yǎng)至對生長后期。離心收集菌體。不宜用高速長時(shí)間。*54大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

Extractionof*55solutionⅠ:葡萄糖,59mmol/L;Tris-HClpH8.025mmol/L,EDTApH8.010mmol/LsolutionⅡ:NaOH0.2mol/L;SDS1%solutionⅢ:5mol/L醋酸鉀60mL;冰醋酸11.5mL;ddH2O28.5mL2、細(xì)胞裂解離心沉淀的菌體加入100uL溶液I，振蕩，冰上5min，加入200uL溶液II，混勻。3、DNA的抽提冰上5min，加入150uL溶液III,振蕩10s，冰上5min，離心后取上清液，加入2倍體積的乙醇沉淀DNA，再離心取沉淀.*55solutionⅠ:葡萄糖,59mmol/L;Tri*56植物DNA的提取氯化銫法、CTAB法。具體步驟可參考分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南類工具書。*56植物DNA的提取氯化銫法、CTAB法。具體步驟可參考分*57本試劑盒采用經(jīng)典的SDS堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅膠膜在高鹽低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅膠膜上洗脫?！?/p>

采用進(jìn)口硅膠膜，吸附量大，產(chǎn)率高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性好。※

與Zymo公司的產(chǎn)品相同，溶液中添加了進(jìn)口作用指示劑，使每一步作用程度一目了然。

※

不需要使用有毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。

※

快速、方便，從1～5ml大腸桿菌LB（LuriaBertani）培養(yǎng)液中，可快速提取15-40ug純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85～90%。

※

獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高，超螺旋比例高、純度好。直接可以用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒

（離心柱型）*57本試劑盒采用經(jīng)典的SDS堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)*58利用納米技術(shù)合成的磁性納米復(fù)合材料（磁珠），結(jié)合磁性分離技術(shù)和DNA提取技術(shù)，一步實(shí)現(xiàn)DNA的提取和純化，從而獲得高質(zhì)量的DNA。本試劑盒無需特殊的設(shè)備，而且完全避免了與一些有毒試劑的接觸（如酚、氯仿等），純化的DNA可以廣泛應(yīng)用于如PCR，測序和雜交等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。除了樣本處理過程，均無需離心，適合于自動化儀器使用。DNA提取的具體過程為：消化后的組織溶液和收集的細(xì)胞在裂解液的作用下，DNA特異性的結(jié)合在磁珠上，結(jié)合了DNA的磁珠在外加磁場的作用下從溶液中分離，再通過2-3次的洗滌過程將蛋白質(zhì)等殘留的雜質(zhì)去除，最后在洗脫液的作用下DNA從磁珠上被洗下來，從而獲得基因組DNA。磁性組織基因組DNA提取試劑盒*58利用納米技術(shù)合成的磁性納米復(fù)合材料（磁珠），結(jié)合磁性分*59基因組DNA提取系列(血液DNA提取試劑盒)產(chǎn)品簡介

H.Q.&.Q.血液DNA提取試劑盒為您提供了一個(gè)快捷而簡單的從100ul-1ml新鮮、冷凍和抗凝全血中分離基因組DNA的方法，這一方法同樣適用于從鼠尾小段、血液、石蠟包埋組織、血清、血漿中提取基因組DNA。這一試劑盒可以在40min之內(nèi)同時(shí)處理單個(gè)或多個(gè)的樣品。通常一次單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)可處理最多1ml的全血。這一過程無須用到苯酚/氯仿抽提，而且那些較耗時(shí)的步驟，像：氯化銫梯度離心、異丙醇或乙醇沉淀等，都被摒除了。

用H.Q.&.Q.血液DNA提取方法提純得到的DNA可直接用于各種下游應(yīng)用，如PCR、Southern雜交及限制性酶切等。應(yīng)用

JYZ-1-1/JYZ-1-2系列均提供OB蛋白酶，該試劑盒能從全血、純的白細(xì)胞或培養(yǎng)的動物細(xì)胞中分離出DNA。若從干燥的血樣中分離DNA可使用H.Q.&.Q.組織DNA提取試劑盒。結(jié)合能力

每個(gè)Mu-Pu基因組DNA分離柱可結(jié)合大約30μgDNA。我們建議不要一次使用大于1ml全血或250μl培養(yǎng)的動物細(xì)胞。*59基因組DNA提取系列(血液DNA提取試劑盒)產(chǎn)品簡介

*60三、DNA的純化1、離子交換層析法:

在低鹽濃度下DNA可與樹脂或羥基磷灰石的鈣離子相互作用而結(jié)合，隨后用濃度梯度的NaCl或磷酸鹽洗脫回收DNA即可純化之。*60三、DNA的純化1、離子交換層析法:*61resinDNAForDNAbinding,theDNAsolutionisappliedtoIonExchangeratfixedpHandlow[salt]--++++Cl-Cl-Na+Na+--ForelutionofDNAfromIonExchanger,ahigh[salt]isappliedtocolumn*61resinDNAForDNAbinding,th*622、DNA中EB的去除

EB（ethidiumbromide）：溴化乙錠，EB可影響DNA的切割,對人有中等毒性，可誘變成癌癥.

正丁醇抽提法：DNA樣品溶液中加入用溶解DNA的緩沖溶液飽和的正丁醇，輕輕混合，分相后，棄上相正丁醇，反復(fù)重復(fù)至上相正丁醇無桔紅色為止。*622、DNA中EB的去除*633、DNA的濃縮：乙醇沉淀法：DNA中加2倍體積的乙醇，使DNA沉淀，離心收即可。*633、DNA的濃縮：*64第三節(jié)限制酶及其對DNA的切割一、限制酶（Restrictionendonucleases）已開發(fā)上百種，公司有賣.功能:能識別特定的核酸序列而將核酸切斷。*64第三節(jié)限制酶及其對DNA的切割一、限制酶（Rest*65

1、定義一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。主要存在于細(xì)菌中。用于防止外源DNA入侵*651、定義*662、分類I型、II型、III型?；蚬こ讨袘?yīng)用的是II型，可識別特殊序列進(jìn)行有規(guī)律切割。*662、分類*673、命名一般以提取這類酶的生物屬名和種名的第1、2個(gè)字母及菌株的代號來命名。如：HaemophilusinfluenzaeRd菌中提取的第三個(gè)酶可命名為HindIII*673、命名*68二、作用機(jī)理底物：DNA可識別一定的核苷酸序列使兩條鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3`-OH基團(tuán)和5`-P基因的片段。*68二、作用機(jī)理底物：DNA*69REbasebaseHHHHHHHH*69REbasebaseHHHHHHHH*705’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5EcoRⅠ5’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5`OHOHPP3`5`3`5`*705’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……*71三.識別序列recognitionsequences共同特點(diǎn)：具有旋轉(zhuǎn)對稱性，或二重互補(bǔ)對稱性

GAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGGAAGCTTTTCGAA*71三.識別序列recognitionsequenc*72如：序列有6個(gè)核苷酸對，出現(xiàn)概率為1/4，即1/4096。6對于一條長DNA鏈中的酶識別序列可利用電腦分析。識別序列長為n個(gè)bp，它出現(xiàn)的概率：為1/4。n*72如：序列有6個(gè)核苷酸對，出現(xiàn)概率為6對于一條長DNA鏈*73四、酶切切割方式有兩種其一，兩條鏈上斷開的位置是交錯(cuò)的對稱地分布在識別序列中心位置兩側(cè)，產(chǎn)生粘性末端。其二，兩條鏈斷開的位置在識別序列的對稱中心產(chǎn)生平末端。*73四、酶切切割方式有兩種*745’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5OHOHPP粘性末端同尾酶：來源各異，識別序列相似，切割后產(chǎn)生的粘性末端完全相同。5’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5OHOHPP平末端*745’……ATCGCGATG*75五、酶切反應(yīng)系統(tǒng)1、底物DNADNA的純度：乙醇、EDTA、SDS、酚等DNA的分子構(gòu)型：線形>環(huán)狀識別序列的側(cè)面序列：如僅含GAATTC的不會被EcoRI切，該序列兩側(cè)延長1到幾個(gè)核苷酸后才行。DNA甲基化：識別序列被甲基化，會影響酶切效率。*75五、酶切反應(yīng)系統(tǒng)1、底物DNA*762、酶的用量酶的活性越高用量越少底物DNA適合，用量少。3、反應(yīng)的緩沖溶液（buffer）buffer最適合酶的活性最強(qiáng)。4、反應(yīng)溫度37℃*762、酶的用量*77六、REStar活性某些酶在特定條件下，可在不是原來的識別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱為Star活性。排除方法：降低反應(yīng)系統(tǒng)中甘油含量、控制在pH中性和高鹽濃度下進(jìn)行反應(yīng)。*77六、REStar活性某些酶在特定條件下，可在不是原*78DNA的片段化：DNA酶切成可用于連接重組的DNA片段的過程。1、單酶切最常用，只用一種酶進(jìn)行切割。13uLddH2O2uLbuffer搖勻，離心，室溫1-3h，65℃104uLDNA分鐘1uL酶七、DNA的片段化*78DNA的片段化：DNA酶切成可用于連接重組的DNA片段*792、雙酶切兩種酶切割同一種DNA分子。產(chǎn)生兩個(gè)不同的末端。先后分別切割：原則是先低后高。同時(shí)切割：反應(yīng)條件相近，有共同的buffer。BamHIDNAEcoRI810bpEcoRIBamHI*792、雙酶切BamHIDNAEcoRI810bpE*803、部分酶切對DNA分子的全部識別序列進(jìn)行不完全的切割。原因:DNA純度低、甲基化、酶量不足、溫度不適、時(shí)間不夠等。BamHIBamHIDNAEcoRI750bp810bp*803、部分酶切BamHIBamHIDNAEcoR*81八、DNA的限制性圖譜DNA分子上每種限制性內(nèi)切酶的識別序列分布圖，稱限制性圖譜（restrictionmap）或稱物理圖譜(physicalmap)。*81八、DNA的限制性圖譜DNA分子上每種限制性內(nèi)切酶的*82第四節(jié)特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增*82第四節(jié)特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增*83一、概述在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增特定DNA片段該片段可能是大量DNA混合物中的一段:

e.g.aspecificexonofahumangene.模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可獲得大量拷貝的DNA片段，步驟簡便，結(jié)果可靠。*83一、概述模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可獲得*84PCR功能強(qiáng)大PCR可在2小時(shí)內(nèi)獲得足夠多的DNA片段。模板不需很純、如煮沸的細(xì)菌。PCR獲得的DNA可切割、連接、測序。PCR可擴(kuò)增單DNA模板,e.g.fromasinglecell。*84PCR功能強(qiáng)大PCR可在2小時(shí)內(nèi)獲得足夠多的DNA片*85PCR的發(fā)明PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù)是1983年由美國CETUS公司的KarryMullis博士發(fā)明的，它是分子生物學(xué)在技術(shù)上的一次革命.*85PCR的發(fā)明PCR（PolymeraseChain*8660-70年代有科學(xué)家Khorana提出“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想遺忘:

很難人工合成寡核苷酸引物；當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測序.DidHeReallyInventPCR?*8660-70年代有科學(xué)家Khorana提出“經(jīng)過*87發(fā)明過程

Mullis在《偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)》一文中寫到:這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時(shí)想出來的。發(fā)展過程：開始使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加。耗時(shí)、費(fèi)力、易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動化.*87發(fā)明過程*88二、PCR的原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-退火-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。*88二、PCR的原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。*89DNA加熱變性成單鏈引物退火與DNA結(jié)合DNA聚合酶延伸引物上三步重復(fù)30次基本方案*89DNA加熱變性成單鏈基本方案*90PCR反應(yīng)體系的成分：模板DNA緩沖溶液（Tris,銨離子（和/或鉀離子），鎂離子，牛血清白蛋白）核苷酸dNTPs(dATP,dTTP,dGTP,dCTP的混合物)引物DNA聚合酶（常用Taq酶）*90PCR反應(yīng)體系的成分：*91PCR反應(yīng)系統(tǒng)成份引物AB核苷酸TaqDNA聚合酶Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+緩沖溶液目標(biāo)DNA5’3’3’5’*91PCR反應(yīng)系統(tǒng)成份引物AB核苷酸TaqDNAMg2*92變性目標(biāo)DNA95oC5’3’3’5’5’3’3’5’*92變性目標(biāo)DNA95oC5’3’3’5’5’3’3’5’*93退火~55oC5’5’AB引物AB5’3’3’5’*93退火~55oC5’5’AB引物AB5’3’3’5’*94延伸72oC5’5’TaqDNA聚合酶3’5’5’3’*94延伸72oC5’5’TaqDNA聚合酶3’5’5’3*95Thebasicprotocol--extension72oC5’5’5’3’3’5’3’3’第一個(gè)循環(huán)結(jié)束第二個(gè)循環(huán)開始*95Thebasicprotocol--extensi*965’5’5’3’3’5’3’3’95oC5’5’3’3’5’3’變性5’3’*965’5’5’3’3’5’3’3’95oC5’5’3’3*975’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’55oC退火*975’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’55o*985’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72oCextension*985’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72o*995’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72oC延伸第二個(gè)循環(huán)結(jié)束*995’5’5’3’3’5’3’3’5’5’5’5’72o*1005’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’95oC變性第三個(gè)循環(huán)開始*1005’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’*1015’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’55oC退火*1015’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’55oC*1025’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’72oC延伸3’*1025’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’72oC*1035’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’5’3’372oC延伸目標(biāo)DNA目標(biāo)DNA第三個(gè)循環(huán)結(jié)束*1035’5’3’5’5’3’3’5’5’5’5’5’3’*1045’3’5’94oC變性第四個(gè)循環(huán)3’40oC退火72oC延伸*1045’3’5’94oC變性第四個(gè)循環(huán)3’40oC退火7*105每循環(huán)一次，目的DNA片段增加一倍30次循環(huán)后可達(dá)109條230=1,073,741,824動畫33*105每循環(huán)一次，目的DNA片段增加一倍230=1,073*106常規(guī)PCR：一對引物，擴(kuò)增一條DNA片段。多重PCR

（Multiplex-PCR）：多對引物，同時(shí)擴(kuò)增多條DNA片段。*106常規(guī)PCR：一對引物，擴(kuò)增一條DNA片段。*107PCR操作過程：（1）引物（primer）的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)已知的基因序列，設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增特異性基因片段的寡聚核苷酸引物。（2）模板（template）DNA的提取。（3）PCR擴(kuò)增：取一定量的DNA提取物，加入過量引物，TaqDNA聚合酶，dNTP，PCR反應(yīng)緩沖液，Mg離子，PCR儀（ThermalCyclers）上擴(kuò)增。（4）結(jié)果分析：采用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。*107PCR操作過程：*108PCR儀熱循環(huán)儀該儀器可實(shí)現(xiàn)PCR程序中各步驟間溫度的迅速升降可自動化控制，輸入各步驟的溫度、時(shí)間等參數(shù)后自動完成反應(yīng)程序。*108PCR儀該儀器可實(shí)現(xiàn)PCR程序中各步驟間溫度的迅速*109三、PCR反應(yīng)成分及功能（一）、DNA聚合酶的選擇1.KlenowDNA聚合酶:

缺點(diǎn):①受熱失活；②產(chǎn)物混合其他DNA分子；③產(chǎn)物混合大量雜蛋白④擴(kuò)增DNA小于400bp.*109三、PCR反應(yīng)成分及功能（一）、DNA聚合酶的選*1102、TaqDNApolymerase

1969年，美國黃石國家公園溫泉中分已克隆了該酶基因，表達(dá)蛋白已成功純化，其分子量為94kD①、活性：在幾種水棲熱菌中活性最高，200000U/mg②、離子需要：對Mg2+

，單價(jià)離子（K+

或NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。適當(dāng)濃度的KCl可使合成率增加50％～60％，*1102、TaqDNApolymerase*111③、忠實(shí)性有5‘→3’聚合酶活性，無3‘→5’外切酶活性。沒有校正單核苷酸錯(cuò)配功能致命弱點(diǎn)。一般出錯(cuò)率為2×10-4核苷酸/循環(huán)，利用PCR克隆、測序時(shí)尤應(yīng)注意。如何避免錯(cuò)配？使用有校對功能的酶。*111③、忠實(shí)性*112抑制劑尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及許多其他化學(xué)藥劑。內(nèi)源DNA:

不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細(xì)菌DNA或PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來源的DNA。在使用擴(kuò)增保守序列的通用引物時(shí)，會在無模板對照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。保存:在-20℃至少6個(gè)月。*112抑制劑*1133PwoDNApolymerase有5‘→3’聚合酶活性和3‘→5’外切酶活性，有校正單核苷酸錯(cuò)配功能，準(zhǔn)確度比Taq酶高10倍。可擴(kuò)增DNA片段的長度5kb。產(chǎn)物為平末端DNA片段，可直接進(jìn)行連接。*1133PwoDNApolymerase*1144TthDNA聚合酶有5‘→3’聚合酶活性，無3‘→5’外切酶活性，在有Mn離子時(shí)有反轉(zhuǎn)錄酶活力，有Mg離子時(shí)可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該酶可用于RT-PCR可擴(kuò)增DNA片段的長度1kb*1144TthDNA聚合酶*115（二）、模板DNATemplateDNAdsDNA，ssDNA,DNA的來源：根據(jù)研究對象不同DNA來源不同：

動物可提取血液或特定組織中的DNA

植物可取葉片，芽等組織。

真菌、細(xì)菌直接提取菌體DNA對于RNA樣品，首先需要反轉(zhuǎn)錄成cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA遠(yuǎn)比RNA穩(wěn)定。*115（二）、模板DNATemplateDNAdsDN*116（三）、引物（primes）1、設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)(最重要)(1)、長度:20～27bp(2)、G+C含量：40-60%，ATCG隨機(jī)分布*116（三）、引物（primes）1、設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)(*117Iftherearecomplementarysequencesbetweentwoprimers.ThetwoprimersareComplementaryat3‘end5‘3‘5‘3‘Primerdimer引物二聚體ThetwoprimersareComplementaryat5‘end5‘3‘5‘3‘ThetwoendsofoneprimerarecomplementaryPrimercyclizeinternalcomplementarity(3)、引物內(nèi)和引物間無互補(bǔ)序列*117Iftherearecomplementary*1185’5’3’3’5’5’72oCextension3`endcannotbemodified5`endcouldbemodified(4)、引物的3`端：不能修飾(5)、引物的5‘端：決定產(chǎn)物長度，可以修飾，加上限制性酶切位點(diǎn)。*1185’5’3’3’5’5’72oCextension3*1195`end

determinethelengthofthePCRproduct.*1195`enddeterminethelengt*120(6)、序列的特異性利用已知序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增未知DNA片段時(shí)，已知序列在引物區(qū)的序列同源性應(yīng)盡可能大，小于70%就可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。*120(6)、序列的特異性*1215’3’5’3’5’3’5’3’ATCGAATGTGGCATATCGAATGTGGCATATCGAATGTGGCATATCGAATGTGGCAT里氏木霉CBH2基因綠色木霉CBH2基因李氏木霉CBH2基因康氏木霉CBH2基因TGGAATCGTCGAAACCTAAAACCGT??AA?C?*1215’3’5’3’5’3’5’3’ATCGAATGTG*1222、PCR擴(kuò)增長度不同的DNA聚合酶不同,最長可達(dá)10Kb,一般在2kb以內(nèi)。3、保存凍干引物于-20℃可保存1-2年，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個(gè)月。一般均在-20℃保存4、反應(yīng)引物終濃度0.2-1μmol/L。濃度過高易形成引物二聚體，濃度過低，降低PCR的產(chǎn)率.*1222、PCR擴(kuò)增長度*123*123*1244、PCR反應(yīng)體系的其他成分（1）緩沖溶液

10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃）（2）Mg2+：為提高TaqDNA聚合酶的活性含量：低:低活性，高:非特異性擴(kuò)增*1244、PCR反應(yīng)體系的其他成分（1）緩沖溶液*125（3）dNTPs（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）貯備dNTPs液：1mol/LNaOH調(diào)pH至中性。貯備濃度為10mmol/L，終濃度為20-200umol/L，分裝-20℃保存。4種dNTP濃度應(yīng)相同。*125（3）dNTPs（dATP、dTTP、dGTP*1265、PCR循環(huán)的溫度與時(shí)間預(yù)變性94℃10min變性94℃30s退火40-60℃30s延伸70-75℃2min延伸70-75℃10min循環(huán):25-30次*1265、PCR循環(huán)的溫度與時(shí)間預(yù)變性94℃10*127（六）、PCR的擴(kuò)增平臺期平臺期：PCR過程經(jīng)過一定次數(shù)的循環(huán)后，待擴(kuò)增的DNA片段不再以指數(shù)關(guān)系累積，而進(jìn)入線性關(guān)系累積。進(jìn)入平臺期的原因：模板DNA過量引物或dNTP的量不足。DNA聚合酶中途失活。*127（六）、PCR的擴(kuò)增平臺期平臺期：*128四.PCR的優(yōu)化*128四.PCR的優(yōu)化*1291、變性溫度和時(shí)間變性不完全——失敗。一般94℃基因的G和C多，可提高變性溫度.過高或時(shí)間過長，酶活性會損失。*1291、變性溫度和時(shí)間*1302、退火(annealing)溫度與時(shí)間通常37-55℃、30s~2min。引物G、C含量高、長度長并與模板完全配對時(shí)，可提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。*1302、退火(annealing)溫度與時(shí)間*131溫度應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定.每次實(shí)驗(yàn)溫度遞增(減)2℃.可使用梯并PCR儀.*131溫度應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定.*1323、延伸的溫度與時(shí)間常用72℃.時(shí)間：對低濃度的、序列長的DNA片段，可延長時(shí)間。時(shí)間過長，非特異性增加。一般在擴(kuò)增后，需一步較長時(shí)間的延伸反應(yīng)。4循環(huán)次數(shù):25-30個(gè)足夠。循環(huán)過多，非特異性增加*1323、延伸的溫度與時(shí)間*1335Mg2+濃度[Mg2+]低，產(chǎn)物少.[Mg2+]高，非特異性高。*1335Mg2+濃度[Mg2+]低，產(chǎn)物少.*134強(qiáng)大擴(kuò)增能力，檢測敏感極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性。五、PCR污染及其對策*134五、PCR污染及其對策*1351污染源①、點(diǎn)樣器和加樣器②、離心機(jī)③、微解剖刀④、濃縮用具⑤、電泳裝置等等。*1351污染源*1362污染的預(yù)防(1)隔離不同操作區(qū)：前處理、后處理在不同隔離工作臺或房間進(jìn)行。(2)分裝試劑：去離子水、緩沖液、吸頭、離心管等均應(yīng)高壓滅菌。引物不能高壓，用滅菌的去離子水在無菌條件下配制。試劑均應(yīng)在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)制備、分裝與貯存。*1362污染的預(yù)防*137(3)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作:①戴一次性手套操作。②避免反應(yīng)液的飛濺。③用一次性移液器或吸頭。(4)結(jié)果的重演:反復(fù)驗(yàn)證*137(3)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作:*138六.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法1凝膠電泳分析法瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定產(chǎn)物大小，還可以純化擴(kuò)增產(chǎn)物。2點(diǎn)雜交當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適3序列測定最準(zhǔn)*138六.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法1凝膠電泳分析法*1394其他：微孔板夾心雜交法、

PCR-ELISA法、顏色互補(bǔ)分析法、單一核苷酸引物延伸法

PCR-OLA*1394其他：微孔板夾心雜交法、*140第五節(jié)凝膠電泳分析DNA片段

Analysisof

DNAfragmentbygelelectrophoresis

一、核酸電泳的原理：核酸是兼性離子，具有等電點(diǎn)(DNA4~4.5，RNA2~2.5)。在中性或堿性緩沖系統(tǒng)中帶負(fù)電。電泳：在外電場作用下，由于離子所帶電荷大小和性質(zhì)不同，其泳動方向和速率也不同，從而達(dá)到分離的目的。*140第五節(jié)凝膠電泳分析DNA片段

Analysiso*141OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

兼性離子帶正電荷離子帶負(fù)電荷離子Base-H+Base-HH+Base-H++HHH+

+

+

+

HBase-H+Base-HH+Base-H++*141OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+*1422、電泳遷移率與DNA的構(gòu)型和大小相關(guān)。大小相同：超螺旋結(jié)構(gòu)最快，環(huán)狀結(jié)構(gòu)次之，線性結(jié)構(gòu)最慢。構(gòu)型相同：越小越快。*1422、電泳遷移率與DNA的構(gòu)型和大小相關(guān)。大小相同：*143凝膠固體-DNA不會丟失固體-提供阻力*143凝膠*1443、DNA可以被染色觀察可見光下DNA無色。DNA被EB染色后，紫外光照射可發(fā)光，可以檢測和分析。*1443、DNA可以被染色觀察*14512

實(shí)例*14512實(shí)例*146二、電泳方法：1、Agarosegelelectrophoresis

瓊脂糖凝膠電泳(分離范圍:70bp-80kb）2、Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離范圍:6bp-1kb)*146二、電泳方法：*1471、瓊脂糖凝膠電泳*1471、瓊脂糖凝膠電泳*148（1）、緩沖溶液（Buffer）一種溶液可同時(shí)用于電泳和凝膠制備。常用：TAE（Tris-乙酸-EDTA）TBE（Tris-硼酸-EDTA），較粘稠，*148（1）、緩沖溶液（Buffer）*149(2)、凝膠中瓊脂糖的含量：含量高，凝膠密度大，分析DNA片段小，反之，分析DNA片段大含量要依據(jù)DNA大小確定，一般用1%。*149(2)、凝膠中瓊脂糖的含量：含量高，凝膠密度大，分析*150凝膠濃度過大時(shí)*150凝膠濃度過大時(shí)*151凝膠濃度適中*151凝膠濃度適中*152凝膠濃度過小*152凝膠濃度過小*153高濃度凝膠，適合小分子DNA*153高濃度凝膠，適合小分子DNA*154低濃度凝膠，適合大分子DNA*154低濃度凝膠，適合大分子DNA*155DNA片段大?。?/p>

kb）瓊脂糖含量（%）0.043.00.2-31.50.7-71.20.5-101.00.8-120.70.9-300.55.0-600.3800.1*155DNA片段大?。╧b）瓊脂糖含量（%）0.043*156(3)、凝膠的配置例如配制1%的凝膠：稱0.2g瓊脂糖加入20mLTAE緩沖溶液，混均，加熱熔化（微波爐）。注意：此時(shí)溶化的凝膠易沸騰噴出。倒入制膠平臺上，插入梳子。冷卻凝固后，拔出梳子，留出樣品孔。*156(3)、凝膠的配置*157(4)、加DNA樣品電泳槽加滿TAE緩沖溶液，放入制好的凝膠，浸入溶液中。DNA樣品與上樣緩沖液(含甘油)混合后加入凝膠中上樣孔內(nèi)（加入量在孔的2/3以下）。*157(4)、加DNA樣品*158(5)、電泳加樣孔在負(fù)極，接通電源，90v電壓電泳。Positivepolenegativepole*158(5)、電泳Positivepolenegativ*159(6)、染色與紫外觀察電泳完成，取出凝膠，浸入EB溶液，染色10-30min后，在302nm紫外光下觀察。注意事項(xiàng)：紫外可傷眼睛皮膚等，應(yīng)戴面罩。EB是很強(qiáng)的誘變劑，應(yīng)帶手套。*159(6)、染色與紫外觀察*160(7)、DNA片段大小的確定將已知大小的DNAmarker與待測的DNA片段在同一板膠上電泳，根據(jù)DNAmarker的大小來推斷待測DNA大小。*160(7)、DNA片段大小的確定*16156483113751904DNAMarker待測DNADNA片段大小的確定注意：待測DNA與MarkerDNA的構(gòu)型一定相同*16156483113751904DNAMarker待測*16212

564831947137515841904750830實(shí)例*1621256483194713751*1632、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）*1632、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）*164Section6DNAfragmentslink一、DNAligase1、DNA連接酶可催化雙鏈DNA片段靠近的3`羥基末端與5`磷酸末端形成磷酸二酯鍵而連接的。*164Section6DNAfragmentsl*1652、常用的DNA連接酶E.coliDNAligase：只連接黏末端。T4DNAligase：可連接粘末端和平末端，反應(yīng)需要ATP輔助。*1652、常用的DNA連接酶*1665’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’

3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5`OHOHPP3`5`3`5`5’……ATCGCGATGAATTCGCGAT……3’3’……TAGCGCTACTTAAGCGCTA……5ligase*1665’……ATCGCGATGAATT*167*167*168二、連接方法1.連接粘末端.將ddH2O，buffer，兩DNA片段，T4DNAligase混合12℃下8h2.連接粘平端.只能用T4DNAligase.*168二、連接方法*1695’……ATCGCGAT

CGCGAT……3’

3’……TAGCGCTAGCGCTA……5`OHOHPP3`5`3`5`5’……ATCGCGATGCGAT……3’3’……TAGCGCTACGCTA……5T4DNAligaseATP*1695’……ATCGCGAT*170課后習(xí)題說明PCR的反應(yīng)體系的組成及基本過程。以EcoRI為例說明限制性內(nèi)切酶識別序列的基本特點(diǎn)。為什么DNA可以采用凝膠電泳法進(jìn)行分離分析?*170課后習(xí)題說明PCR的反應(yīng)體系的組成及基本過程。演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！*172第二章DNA重組技術(shù)*1第二章DNA重組技術(shù)*173主要內(nèi)容DNA的結(jié)構(gòu)天然DNA的制備限制性核酸內(nèi)切酶對DNA的切割.PCR擴(kuò)增特定DNA片段凝膠電泳檢測DNADNA片段的連接重組*2主要內(nèi)容DNA的結(jié)構(gòu)*174第一節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA組成Nucleicacidispolynucleotide,

NucleotidesarethebuildingblocksofNucleicAcidDNA.首尾*3第一節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA組成首尾*175Pentose

five-carbonsugar

2-Deoxyribose2｀－脫氧核糖1、核苷酸Phosphate、pentose、base(堿基)Hydroxylgroup羥基Hydrogen氫*4Pentose

five-carbonsugar2*176Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶CGuanine鳥嘌呤

GAdenine腺嘌呤AFourBasesinDNAPyrimidines嘧啶Purines嘌呤*5Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶C*177H2O堿基五碳糖核苷鍵核苷602*6H2O堿基五碳糖核苷鍵核苷602*178H2OH2ObasePhosphatePentose核苷鍵Phosphateesterbond核苷酸NucleotideGlycosidicbond*7H2OH2ObasePhosphatePentose核苷*1798種核苷酸

M-單(D-二。T－三）；P-磷酸RNA的名稱為某（單、二、三）苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷—磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷—磷酸（脫氧腺苷酸）。稀有核苷酸與上類似；腺嘌呤A鳥嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNAAMPGMPCMPUMP未發(fā)現(xiàn)DNAdAMPdGMPdCMP未發(fā)現(xiàn)dTMP*88種核苷酸M-單(D-二。T－三）；P-磷酸腺嘌呤*1802、DNADNA中核苷酸通過3’,5’-磷酸二脂鍵連接*92、DNADNA中核苷酸通過3’,5’-磷酸二脂*181headtail脫H2O脂鍵相連3`5`3`，5`-磷酸二酯鍵3’,5’-phosphodiesterbond*10headtail脫H2O3`5`3`，5`-磷酸二酯鍵*182二、DNAstructure*11二、DNAstructure*1831、B型DNA雙螺旋MostDNAhavedoublehelixstructure(1).兩條鏈反向、平行、右手螺旋有大溝和小溝5`3`5`3`*121、B型DNA雙螺旋MostDNAhave*184(2).磷酸、戊糖在外側(cè)，堿基在內(nèi)，鏈間堿基形成氫鍵。*13(2).磷酸、戊糖在外側(cè)，堿基在內(nèi)，鏈間堿基形成氫鍵。*185（3）.兩堿基對間距0.34nm,螺距3.4nm.*14（3）.兩堿基對間距0.34nm,螺距3.4nm*186經(jīng)常用堿基對數(shù)來表示DNA長度(4).堿基互補(bǔ)配對原則：A=TC=G*15經(jīng)常用堿基對數(shù)來表示DNA長度(4).堿基互補(bǔ)配對原則*1872、DNA序列在DNA中，兩鏈間的堿基是互補(bǔ)的知道其中一條鏈的序列后，另一鏈也可推測出來。因此DNA序列一般只用其中一鏈序列由5`向3`書寫5`TCTC3`3`AGAG5`5`TCTC3`*162、DNA序列在DNA中，兩鏈間的堿基是互補(bǔ)的5`*1883、DNA變性DNA變性：DNA雙鏈打開變異無規(guī)則的單鏈的過程。粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加.變性因素：加熱,改變?nèi)芤簆H、加有機(jī)試劑*173、DNA變性DNA變性：DNA雙鏈打開變異無規(guī)則*189。計(jì)算公式：

（G+C)%=(Tm-63.0)×2.44解鏈溫度（Tm）使50%DNA變性的溫度.經(jīng)常在70-85C間，隨G/C含量的升高而升高.*18。計(jì)算公式：解鏈溫度（Tm）*1904、DNA復(fù)性變性因素去除后，變性DNA又恢復(fù)成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。溫度下降過快，DNA不能復(fù)性。變性復(fù)性*194、DNA復(fù)性變性因素去除后，變性DNA又恢復(fù)成雙螺旋*1915分子雜交具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈過程叫核酸分子雜交只要有一定程度的互補(bǔ)順序就可以形成雜交雙鏈。*205分子雜交具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中*192DNA與DNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*21DNA與DNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*193DNA與RNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*22DNA與RNA間的雜交全部互補(bǔ)時(shí)部分互補(bǔ)時(shí)變性復(fù)性*1946DNA的形狀線性DNA：真核生物的染色體ＤＮＡ部分原核生物染色體ＤＮＡ部分病毒ＤＮＡ．*236DNA的形狀線性DNA：*195環(huán)狀ＤＮＡ真核生物線粒體ＤＮＡ葉綠體ＤＮＡ部分原核生物染色體ＤＮＡ質(zhì)粒ＤＮＡ部分病毒ＤＮＡ．*24環(huán)狀ＤＮＡ*196chloroplastmitochondriaThecircularDNAcanbesupercoiled環(huán)狀DNA以超螺旋形式存在環(huán)狀DNA*25chloroplastmitochondriaThe*197。*26。*198負(fù)超螺旋：形成超螺旋時(shí)，旋轉(zhuǎn)方向與DNA雙螺旋方向相反，旋轉(zhuǎn)結(jié)果使DNA分子內(nèi)部張力減小，稱為松旋效應(yīng)。在自然條件下共價(jià)封閉環(huán)狀DNA呈負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋：與負(fù)超螺旋相反，形成超螺旋時(shí)的旋轉(zhuǎn)方向與DNA雙螺旋方向相同，結(jié)果加大了DNA分子內(nèi)部張力，有緊旋效應(yīng)。*27負(fù)超螺旋：形成超螺旋時(shí)，旋轉(zhuǎn)方向與DNA雙螺旋方向相反*1997DNA的復(fù)制半保留復(fù)制（原核、真核）Semiconservationreplication*287DNA的復(fù)制半保留復(fù)制（原核、真核）*200親代DNA分子第一子代分子親代DNA分子第一子代分子*29親代DNA分子第一子代分子親代DNA分子第一子代分子*201DNA復(fù)制過程復(fù)制起始位點(diǎn)雙鏈打開引物酶合成RNA引物，DNA聚合酶延長引物.前導(dǎo)鏈連續(xù)延伸,滯后鏈通過岡奇片段以不連續(xù)方式延伸。在新合成的DNA鏈中將RNA引物剪去，以DNA替代通過DNA連接酶將切口封閉。*30DNA復(fù)制過程*202BubblesBubbles復(fù)制泡:細(xì)菌、病毒、線粒體：單復(fù)制子真核：多個(gè)復(fù)制子，雙向等速復(fù)制*31BubblesBubbles復(fù)制泡:*203*32*2048DNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的過程：起始（啟動子），延長，終止轉(zhuǎn)錄后的加工：剪切，拼接及修飾.*338DNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的過程：起始（啟動子），延長，終*205(1)啟動子：DNA上RNA聚合酶識別、結(jié)合和促使轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列Inpromoterregions,thereisa–10regionwhichsequenceis“TATAAT”andiscalled“pribnowbox”or“TATAbox”.Thereisa–35regionwhichsequenceis“TTGACA”.Thesequencesofthetworegionsareveryconservative.*34(1)啟動子：Inpromoterregions*206promoter基因編碼區(qū)5'|-35||10|AAUGUGA|T|3'

TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1

轉(zhuǎn)錄區(qū)terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden*35promoter*207(2)轉(zhuǎn)錄區(qū)promoter基因編碼區(qū)5'----|-35||10|--AAUGUGA|T|--3'