體外培育牛黃-省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸科課件

中西結(jié)合拓展視野

國家一類新藥體外培育牛黃提綱體外培育牛黃的概況體外培育牛黃藥理藥效學(xué)現(xiàn)代研究體外培育牛黃相關(guān)臨床驗證介紹體外培育牛黃的安全性研究小結(jié)引子：牛黃印象？牛黃是牛的膽結(jié)石，又名西黃、犀黃、丑寶。氣香，味苦而后甘。是備受我國中醫(yī)界推崇的一味傳統(tǒng)名貴中藥，是許多名貴中成藥的君藥。具有清心、豁痰、開竅、涼肝、息風(fēng)、解毒功能。多用于治療高熱神昏、驚厥抽搐、中風(fēng)、痰迷、癲癇發(fā)狂、咽喉腫痛、口舌生瘡、癰腫疔瘡等疾病。

牛黃為?？苿游锱８稍锏哪懡Y(jié)石，歷來被譽為比黃金更為貴重的珍貴藥材，也是諸多珍貴中成藥如“安宮牛黃丸”、“片仔癀”等的主要成分。長期以來，藥源緊缺，難以滿足臨床用藥的需要，大量牛黃依賴進(jìn)口。為此，國家藥品監(jiān)督管理部門自1972年陸續(xù)批準(zhǔn)了3個牛黃代用品。人工牛黃1972年培植牛黃1989年體外培育牛黃1997年背景：從體外培育牛黃的研發(fā)談起牛黃代用品—人工牛黃

人工牛黃是由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬帷⒛懠t素、膽固醇、微量元素等制成，為黃色疏松的粉末，味苦、微甘。其膽紅素含量限制為不少于0.63%，應(yīng)用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有天然牛黃廣泛.其制作工藝簡單，價格極低.現(xiàn)在國家已明文規(guī)定急救中成藥品(42種)不得采用人工牛黃入藥,并有意向在以后的發(fā)展中拋棄人工牛黃.

模擬體內(nèi)結(jié)石形成的原理和生物化學(xué)過程，在可控條件下體外培育的牛膽紅素鈣結(jié)石。體外培育牛黃：現(xiàn)代生物工程技術(shù)的杰作天然牛黃、體外培育牛黃、人工牛黃外觀體外培育牛黃形成機理(配方)

新鮮牛膽汁----生物牛膽汁----成石牛膽汁----膽汁核心----成品

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生物反應(yīng)

生化過程

牛黃機(搖轉(zhuǎn))

分層培育干燥調(diào)節(jié)pH體外培育牛黃技術(shù)應(yīng)用膽紅素鈣結(jié)石形成的靜電效應(yīng)原理,將新鮮牛膽汁通過生物技術(shù)制成成石膽汁，在一定必備的條件下，加入生物成核觸發(fā)物，發(fā)生生物、生化反應(yīng)，使成石膽汁內(nèi)蛋白氫鍵形成，部分蛋白凝固變性，形成核心，其活動中心吸引母液中膽紅素鈣鹽顆粒等物質(zhì)，向中心沉淀。以高分子有機物質(zhì)對沉淀顆粒的架橋作用，即線型聚合物的功能對顆粒的吸附作用，層層沉附，逐漸增大，脫水，干燥。形成牛膽結(jié)石，即牛黃成品體黃和天然牛黃穩(wěn)定性對比天然牛黃的采集來源于每一頭個體牛,其每顆牛黃的成分和含量差異比較大。而體外培育牛黃采用工業(yè)化生成水平,能夠在高水平條件下控制牛黃的成分和含量的穩(wěn)定性,從而在穩(wěn)定性上優(yōu)于天然牛黃.指紋圖譜研究結(jié)果10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC疊加圖譜指紋圖譜研究結(jié)果10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC疊加圖譜指紋圖譜研究結(jié)果10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜

HPLC指紋圖譜的比較研究

結(jié)論：1、體外培育牛黃與天然牛黃三個提取部位（包括酸水、酸醇和

二甲亞砜提取液）的成分種類均基本一致，但含量有差異。2、10批體外培育牛黃三個提取部位（包括酸水、酸醇和二甲

亞砜提取液）的HPLC指紋圖譜有較好的一致性，說明體外

培育牛黃的工藝是穩(wěn)定的。

體外培育牛黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-45（Z-051）-2003（Z）

除增加了[游離膽紅素檢查]外，其它各項（性狀、鑒別、檢查、含量測定、功能與主治、用法與用量、注意、貯藏）均與中國藥典2000版

一部及2005版藥典、2010版藥典中牛黃（指天然牛黃）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

完全一致。

安全性：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對比分析注明：體外培育牛黃中游離膽紅素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然牛黃，而大量游離膽紅素將引發(fā)毒性反應(yīng)。這說明體外培育牛黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比天然牛黃更加嚴(yán)格。膽紅素體外培育牛黃中膽紅素含量在35.0%以上。膽紅素為血紅蛋白代謝后的過氧化物,結(jié)合型膽紅素在生理濃度下能夠有效地清除過氧化物、自由基，是機體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑,有著特殊的治療作用。膽紅素通過清除氧自由基、單線態(tài)氧、炎性細(xì)胞分子、病毒等發(fā)揮其抗炎解毒作用。膽紅素可顯著抑制大腸埃希菌、肺炎球菌和金黃色葡萄球菌等典型致病菌的增殖，并能殺滅乙型腦炎病毒。另外還具有有中樞鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解熱、降壓、抗癌和促紅細(xì)胞再生等作用,效果顯著。

膽酸、去氧膽酸類膽酸含量在6.0%以上，去氧膽酸含量為5.0%-7.0%，另外還包括牛磺酸膽酸鹽、甘氨酸膽酸鹽等膽酸鹽類。膽酸、去氧膽酸是體外培育牛黃中具有生物活性的有效成分。膽酸、去氧膽酸及其鹽類具有顯著的解熱作用；去氧膽酸對四聯(lián)球菌、金黃色葡萄球菌、奎氏雙球菌、鏈球菌等具有明顯的抑制作用。除此之處，膽酸、去氧膽酸還具有解痙、鎮(zhèn)咳等藥理活性。微量元素類測定結(jié)果顯示體外培育牛黃中還含有鈣、鐵、鋅等21種微量元素，能增強動物機體內(nèi)的抗氧化酶的活性和總抗氧化能力，阻斷或清除自由基形成及其連鎖反應(yīng)，保持機體內(nèi)產(chǎn)生和清除自由基的動態(tài)平衡，保護(hù)細(xì)胞完整性（1）抗驚厥

（2）鎮(zhèn)靜（3）解熱（4）抗炎（5）抗菌（6）抗病毒（7）降壓（8）護(hù)肝（9）抗腫瘤（10）耐缺氧、清除自由基和抗衰老作用體外培育牛黃的主要藥效解熱作用體外培育牛黃對酵母致大鼠發(fā)熱和傷寒副傷寒三聯(lián)疫苗致家兔

發(fā)熱均有明顯抑制作用抗炎作用體外培育牛黃對急性炎癥的滲出和白細(xì)胞的趨化均有抑制作用體外培育牛黃對急性炎癥的滲出和慢性炎癥的增生均有顯著抑制作用，其抗炎作用強度與等量天然牛黃相似，以200-800mg/kg灌胃給予動物5-7d，可顯著抑制小鼠巴豆油性耳廓水腫，大鼠角叉菜膠性足趾腫脹，大鼠巴豆油性肉芽囊腫的滲出和組織增生，抑制白細(xì)胞游走反應(yīng)，對抗前列腺素E2所致毛細(xì)血管滲透性增加，但不能影響腎上腺中維生素C的含量，提示其抗炎作用不是通過垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)，而是通過抑制炎癥組織中致炎物前列腺素E2的生成而發(fā)揮作用的?？咕饔皿w外培育牛黃能顯著降低感染金黃色葡萄球菌小鼠的死亡率抗氧化、抗衰老作用體外培育牛黃能顯著提高腦、心、肝組織及血清中SOD、GSH-px、GSH活性，提高總抗氧化能力。明顯降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量。體外培育牛黃含有銅、鋅、錳、硒等多種微量元素，能增強老幼化動物機體內(nèi)的抗氧化酶的活性和總抗氧化能力，阻斷或清除自由基形成及其連鎖反應(yīng)。保持機體內(nèi)產(chǎn)生和清除自由基的動態(tài)平衡，保護(hù)細(xì)胞完整性，發(fā)揮抗衰老作用。護(hù)肝通過血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染家免構(gòu)建肝纖維化模型，應(yīng)用體外培育牛黃復(fù)合制劑進(jìn)行干預(yù)治療，采用Masson染色法及圖像分析儀測定肝組織膠原纖維的含量，采用Westem

blot

及免疫組織化學(xué)方法檢測家兔門靜脈壁ERK1/2及C-fos的表達(dá)。結(jié)果表明：模型組家兔肝組織膠原纖維含量、ERK1/2活性和C-fos平均染色體指數(shù)較正常對照組明顯增加，藥物組肝臟上述指標(biāo)比模型組明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05），提示體外培育牛黃可以明顯減輕血吸蟲病肝纖維化程度，可能通過影響ERK1/2/C-fos信號途徑來干預(yù)血吸蟲病門靜脈高壓性血管病變的形成，對肝纖維具有改善和治療作用。從中醫(yī)藥學(xué)的角度看：

體外培育牛黃六大功效豁痰開竅清心涼肝息風(fēng)解毒豁痰消除炎癥，使痰化解，保護(hù)呼吸系統(tǒng)功能膽酸具有顯著的祛痰作用。膽酸和去氧膽酸還有鎮(zhèn)咳作用。中醫(yī)小術(shù)語：祛痰，化痰，豁痰解毒

與其具有的抗病毒、抗癌、抑菌、抗炎、抗真菌作用有關(guān)系。主要物質(zhì)基礎(chǔ)：膽紅素、膽酸開竅

打通神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)絡(luò)，恢復(fù)器官功能與抗驚厥、抽搐、癲癇作用有關(guān)。膽酸、去氧膽酸－抗驚厥清心

使處于昏迷狀態(tài)的人神智清醒，與其具有鎮(zhèn)靜、強心作用有關(guān)。膽酸、?；撬?、去氧膽酸－鎮(zhèn)靜?；撬幔剐乃ツ懰峒捌溻}鹽－對心臟有興奮作用涼肝

清除肝火，解除頭暈、目赤、易怒等。與其具有解熱、降溫等作用有關(guān)系?；撬?、膽酸、膽紅素、去氧膽酸－解熱膽酸、去氧膽酸、?；撬幔禍叵L(fēng)

使癲癇、神經(jīng)失常的病癥得以消除。與其具有的鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇等中樞抑制作用有密切關(guān)系。膽酸、去氧膽酸、牛磺酸－鎮(zhèn)靜膽酸、去氧膽酸－抗驚厥

體外培育牛黃具有清熱解毒、豁痰開竅、息風(fēng)涼肝等作用，藥理實驗證明可提高巨噬細(xì)胞吞噬功能，在免疫、抗炎方面起到重要作用。

體外培育牛黃還有顯著的祛痰作用，同時膽酸與去氧膽酸有顯著鎮(zhèn)咳作用，因此含有牛黃的多種制劑常用于治療上呼吸道感染。

體外培育牛黃除了具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、解熱作用外，還有耐缺氧、清除自由基，具有顯著的保護(hù)缺血缺氧細(xì)胞功能的作用。小結(jié)體外培育牛黃缺血缺氧細(xì)胞的保護(hù)作用

體外培育牛黃耐缺氧、清除自由基實驗1.1.1常壓耐缺氧實驗：實驗組小鼠18-20g，用ICCB800-600mg/Kg，ig給藥5天后，將小鼠放入標(biāo)定250ml廣口瓶內(nèi)（每瓶放鈉石灰5g），自封瓶口天始，直至小鼠呼吸停止，計算存活時間。設(shè)陰性對照組ig給藥0.2ml/只和心得安對照組，方法相同。1.1.2缺血缺氧小鼠實驗：小鼠連續(xù)igICCB800mg/Kg5天后，放入250ml廣口瓶內(nèi)（每瓶放鈉石灰5g），自封瓶口時起計時，10分鐘后取出小鼠，并剪尾放血0.5ml(3%)。連續(xù)ig給藥5天后處死，采血、腦、心、肝臟組織勻漿作SOD活性和MDA含量測定。實驗結(jié)果ICCB耐缺氧清除自由基實驗結(jié)果1ICCB對小鼠常壓缺氧耐受力的影響

組別動物數(shù)（只）劑量給藥途徑存活時間x+SD(min)NS1020ml/kgig31.04±2.88ICCB10800mg/kgig37.57±2.89﹡﹡﹡ICCB101200mg/kgig39.54±2.70﹡﹡﹡ICCB101600mg/kgig40.12±3.06﹡﹡﹡PPN1020mg/kgig38.01±2.95體外培育牛黃800-1600mg/kg，均能顯著提高缺氧小鼠的耐受力，明顯延長缺氧小鼠的生存時間，與對照組比較有顯著差異。***P<0.001說明—ICCB耐缺氧清除自由基實驗結(jié)果2

ICCB對缺血缺氧小鼠的血清及腦、心、肝組織勻漿SOD活性的影響。

組別動物數(shù)(只)劑量給藥途徑SOD活性（Nu/mgprcx+SD）腦肝血清心NS920ml/kgig31.20±7.7080±10.79175.57±26.1964.0±9.29ICCB101200mg/kgig39.90±5.76**94.68±14.86﹡203.16±23.73﹡69.87±8.71—*P<0.005**P<0.01體外培育牛黃組缺氧小鼠血清及腦、肝組織的SOD活性均顯著高于對照組。

說明

ICCB耐缺氧清除自由基實驗結(jié)果3

ICCB對缺血缺氧小鼠的血清及腦、心、肝組織勻漿MDA含量的影響。

組別動物數(shù)(只)劑量給藥途徑MDA含量nmol/mg(x+SD)

腦心肝血清NS920ml/kgig5.90±0.998.45±1.968.76±1.906.89±0.71ICCB101200mg/kgig4.70±1.11﹡5.51±1.40***7.29±1.55﹡5.20±1.02*—*P<0.05**P<0.01**P<0.001體外培育牛黃缺氧小鼠的心、肝、腦組織和血清MDA含量均低于對照組。特別是心臟組織勻漿MDA含量與對照組比較有非常顯著差異。

說明ICCB耐缺氧清除自由基實驗結(jié)果4ICCB對缺血缺氧小鼠腦組織的超微病理的改變。

對照組體外培育牛黃治療組神經(jīng)元細(xì)胞水腫，胞漿內(nèi)細(xì)胞器不同程度變性，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核糖體數(shù)量減少，部分膠質(zhì)細(xì)胞核周積液，胞漿空亮，細(xì)胞器溶解，部分有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂，部分無髓神經(jīng)纖維腫脹，呈大小不等泡狀，神經(jīng)絲消失，見局限性神經(jīng)纖維溶解灶。毛細(xì)血管管徑不等，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)空泡增多，大部分毛細(xì)血管周周見積液性間隙。僅少量神經(jīng)元細(xì)胞輕微變性。線粒體

輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴張。

核糖體數(shù)量基本正常，有髓及無髓神

經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)規(guī)則。毛細(xì)血管內(nèi)

皮細(xì)胞無明顯腫脹，毛細(xì)血管周圍無

積液性間隙。體外培育牛黃治療組缺血缺氧小鼠腦組織超微病理改變很輕微，而對照組則很嚴(yán)重。說明結(jié)果討論：體外培育牛黃具有保護(hù)缺血缺氧細(xì)胞的作用，作用機制是其具有提高機體耐缺氧能力和抗氧化酶活性，提高機體清除自由基能力，減輕脂質(zhì)過氧化作用對缺血缺氧細(xì)胞的損害，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，保護(hù)或恢復(fù)神經(jīng)通路，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞功能的作用。

小插曲：國食藥監(jiān)注[2004]21號

對于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)處方中含牛黃的臨床急重病癥用藥品種，和國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的含牛黃的新藥，可以將處方中的牛黃以培植牛黃、體外培育牛黃等量投料使用，但不得以人工牛黃替代。SFDA規(guī)定必須使用牛黃或者體外培育牛黃的

42個臨床急重病癥用藥品種名單（2004）1安宮牛黃丸15靈寶護(hù)心丹29同仁大活絡(luò)丸2八寶玉樞丹16六應(yīng)丸30同仁牛黃清心丸3保赤一粒金散17梅花點舌丹31萬氏牛黃清心丸4保赤一粒金丸18牛黃抱龍丸32萬應(yīng)錠5保嬰奪命散19牛黃千金散33五?；卮和?大活絡(luò)丸20牛黃清熱散34西黃丸7癲狂龍虎丸21牛黃清心丸（局方）35小兒百壽丹8瓜子錠22牛黃醒腦丸36小兒回春丸9廣羚散23牛黃鎮(zhèn)驚丸37小兒羚羊散10猴棗牛黃散24片仔癀38小兒牛黃清心散11回春丹25人參再造丸39小兒清熱鎮(zhèn)驚散12回天再造丸26麝香保心丹40小兒珠黃散13金黃抱龍丸27十香返生丸41至圣保元丸14局方至寶散28天黃猴棗散42珠珀保嬰散（丹）一）I、II、III期臨床試驗綜述受試藥物：單味體外培育牛黃及其安宮牛黃丸、片仔癀。對照藥物：單味天然牛黃及其安宮牛黃丸、片仔癀。治療疾?。褐酗L(fēng)、乙腦、急性咽炎、牙周炎、癤腫。療效：療效良好，與優(yōu)質(zhì)天然牛黃無統(tǒng)計學(xué)差異。

第四部分：體外培育牛黃臨床應(yīng)用經(jīng)驗介紹臨床研究醫(yī)院：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院武漢大學(xué)中南醫(yī)院湖北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一、第二醫(yī)院臨床藥理基地福建中醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院,福建省中醫(yī)研究院組別藥名病名總例數(shù)愈顯率（%）總有效率（%）治療組安宮牛黃丸（ICCB）乙腦18293.9599.45對照組安宮牛黃丸（NN）乙腦7888.4697.43治療組單味（ICCB）乙腦12492.7499.20對照組單味（NN）乙腦4175.6087.80治療組安宮牛黃丸（ICCB）中風(fēng)24847.9884.78對照組安宮牛黃丸（NN）中風(fēng)14847.9784.93治療組單味（ICCB）中風(fēng)9537.986.30對照組單味（NN）中風(fēng)3232.2580.60治療組片仔癀（ICCB）急性咽炎41675.5096.64對照組片仔癀（NN）急性咽炎10280.3897.06治療組體外培育牛黃（ICCB）牙周炎14890.5499.32對照組天然牛黃（NN）牙周炎3984.6194.87治療組體外培育牛黃（ICCB）癤腫11076.3696.36對照組天然牛黃（NN）癤腫3966.6794.87II、III期臨床試驗共1852例治療結(jié)果：

注：以上治療組均為體外培育牛黃，對照組均為天然牛黃相關(guān)臨床文獻(xiàn)簡介牛黃蛇膽川貝滴丸對COPD急性發(fā)作期的血氣影響牛黃蛇膽川貝滴丸對慢性支氣管炎治療作用的實驗研究牛黃清心丸對36例顱內(nèi)高壓昏迷患者祛痰的療效觀察牛黃羚貝消炎片祛痰作用的初步藥理學(xué)研究安宮牛黃丸治療晚期肺癌痰熱壅肺證急性毒性試驗：LD50為9g/kg，為臨床用量的1800倍;長期毒性試驗：未發(fā)現(xiàn)毒性作用;特殊毒理學(xué)試驗：未發(fā)現(xiàn)致突變、致畸作用。第五部分：體外培育牛黃的安全性研究游離膽紅素批次1234567891011平均值天然牛黃4.4203.2382.0263.7034.3